趙澤 左禧萌 汪唐順 劉潔麗 楊臻瑞 高爽 孫萍 馮雪 王玉坤 史曉光

肉芽腫小葉性乳腺炎為一種發(fā)病原因不明的乳腺良性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為突發(fā)的乳房紅腫熱痛、迅速破潰流膿，形成竇道，且反復(fù)遷延不愈，難以治療。這種疾病的病理臨床表現(xiàn)主要為以乳腺小葉為中心的非干酪樣壞死，主要病理變化為生成肉芽腫病灶[1]。該疾病的主要治療方式目前為激素[2]治療、免疫抑制劑[3]治療及手術(shù)[4]治療等，但療效參差不齊且均存在一定副作用，尋找更為合適的治療方式仍為研究重點(diǎn)。中醫(yī)藥盡管作用時(shí)間相較糖皮質(zhì)激素及手術(shù)治療更長(zhǎng)，且具有副作用小、減少乳房損毀等優(yōu)點(diǎn)，但針對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎的中醫(yī)理論繁多[5-7]，且藥物各異。因此，從現(xiàn)有中醫(yī)藥中篩選合適的藥物參與對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎的治療仍具有必要性。

托里透膿湯出自《醫(yī)宗金鑒》卷六十三，為托毒潰膿之劑，主治正虛不能托毒、內(nèi)已成膿、外不易潰、漫腫無(wú)頭之癰瘍，為外科托法中的著名方劑。由補(bǔ)益氣血和透膿的藥物組成，在既往研究中被廣泛應(yīng)用于難治性褥瘡[8]、肛周膿腫[9]、坐骨直腸窩膿腫[10]等難治性瘡瘍上。考慮到該病臨床表現(xiàn)符合托里透膿湯適用證型，且在既往臨床肉芽腫小葉性乳腺炎治療中有一定療效[11]，本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠20只，體質(zhì)量350～450 g，周齡不限，有孕產(chǎn)史，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批許可，倫理號(hào)：20-48。

1.2 藥物與試劑

托里透膿湯，處方：人參10 g、白術(shù)10 g、王不留行15 g、白芷10 g、升麻10 g、甘草 6 g、當(dāng)歸10 g、黃芪15 g、皂角刺10 g、醋青皮6 g。以上中藥采用北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備的配方顆粒劑型。

完全弗氏佐劑(sigma，美國(guó))，IL-18酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ezyme linted immunosorbent assay, elisa)試劑盒(proteintech，中國(guó))，caspase-1兔一抗、GSDMD兔一抗、IL-18兔一抗、IL-1β兔一抗、a-tublin兔一抗、山羊抗兔IgG(H+L)(SA00001-2，proteintech，中國(guó))，蛋白酶抑制劑cocktail、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、5×loading buffer(索萊寶，中國(guó))，10 %SDS-PAGE凝膠試劑盒(雅酶，中國(guó))。

1.3 造模與分組

參照《肉芽腫小葉性乳腺炎動(dòng)物模型初探討》中方式構(gòu)建動(dòng)物模型：將人肉芽腫小葉性乳腺炎標(biāo)本組織稱(chēng)重、人工研磨至無(wú)明顯大顆粒，置于于冰上，與生理鹽水比例為1∶3進(jìn)行超聲勻漿。勻漿12000 r/min離心，取上清液與完全弗氏佐劑按1∶1體積乳化備用[12]。3%戊巴比妥溶液，30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。麻醉后固定于木板上，第3、4對(duì)乳房剔除毛發(fā)，用75%酒精消毒皮膚。鑷子提起乳頭，用接種注射器，將制備好的油包乳混懸液、生理鹽水各0.2 mL分組沿乳頭注入大鼠第3對(duì)、4對(duì)乳腺內(nèi)，即可完成人工種植包埋過(guò)程。次日進(jìn)入給藥流程。

空白組、模型組、西藥組(糖皮質(zhì)激素組)、托里透膿湯組，每組各五只。除空白組外，其余大鼠均進(jìn)行肉芽腫小葉性乳腺炎造模。

1.4 給藥劑量

造模完成后第二日開(kāi)始給藥流程。托里透膿湯用量按人鼠體表面積換算為成人一日劑量的6倍，蒸餾水配制為終濃度10 mg/mL，灌胃2 mL，每日一次；西藥即醋酸潑尼松，按人鼠體表面積換算為10 mg/kg灌胃，每日一次；模型組及空白組灌服等量蒸餾水，每日一次。給藥21日后取材。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 組織病理學(xué)檢測(cè) 頸椎脫臼處死所有大鼠，將大鼠第3、4對(duì)乳腺組織及乳腺周?chē)つw剝離，取其中1個(gè)乳腺福爾馬林溶液固定。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片厚度為4 μm，運(yùn)用HE染色及雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)免疫組化染色。

1.5.2 炎癥因子檢測(cè) 腹主動(dòng)脈取血常溫凝血15分鐘，3000 r/分鐘，離心15分鐘，取上層血清。Elisa法進(jìn)行白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-18檢測(cè)。

1.5.3 組織勻漿檢測(cè) 組織稱(chēng)重后加入含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA裂解液，組織∶裂解液=1∶10，剪碎至無(wú)明顯大顆粒，超聲儀超聲10秒，冰上裂解30分鐘。12000 r/分鐘離心裂解液收集上清，BCA法蛋白定量后將蛋白濃度調(diào)至5 μg/uL，加5× loading buffer，沸水煮10分鐘。SDS-PAGE凝膠電泳(100 V，1小時(shí)30分鐘)，每泳道上樣50 μg，轉(zhuǎn)膜至NC膜(200 mA，1小時(shí)30分鐘)。5%脫脂牛奶室溫封閉1小時(shí)，一抗4℃孵育過(guò)夜，濃度：IL-18(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、半胱胺蛋白酶-1(caspase-1，1∶1 000)、消皮素-D(Gasdermin-D，GSDMD，1∶1 0000)。隔日室溫下二抗(1∶10 000)，孵育1小時(shí)，用 Image QuantTmlAS-4000Mini Imager攝圖，ImageJ 180量化。

1.5.4 其他一般指標(biāo)檢測(cè) 使用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠第3對(duì)、第4對(duì)乳腺直徑，并測(cè)量大鼠體重，每日一次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 托里透膿湯對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠一般體征的影響

給藥第21天，與空白組比較，肉芽腫小葉性乳腺炎模型組的乳腺直徑顯著增加(P<0.001)，體質(zhì)量無(wú)明顯變化，提示肉芽腫小葉性乳腺炎使乳腺組織總體積增加；與模型組相比，西藥組及托里透膿湯組乳腺直徑顯著減小(P<0.001)，西藥組體質(zhì)量無(wú)明顯變化，托里透膿湯組體質(zhì)量明顯增加(P<0.01)，具體見(jiàn)表1～2。

表1 不同時(shí)間糖皮質(zhì)激素及托里透膿湯對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠乳腺直徑的影響

2.2 托里透膿湯對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠乳腺組織病理學(xué)的影響

空白組乳腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)層次完整，可見(jiàn)乳腺大導(dǎo)管的上皮樣增生，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及其他改變；模型組可見(jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)管內(nèi)大量物質(zhì)潴留，乳腺小葉結(jié)構(gòu)消失，伴膿腫形成及大量脂質(zhì)空泡，邊界不清；西藥組可見(jiàn)乳腺小葉結(jié)構(gòu)存在，炎細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯；托里透膿湯組可見(jiàn)膿腫邊界清晰，膿腫內(nèi)主要成分為多核巨細(xì)胞，膿腫外較模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少。見(jiàn)圖1。

注：A空白組，B模型組，C西藥組，D托里透膿湯組。

2.3 托里透膿湯對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠乳腺組織ER、PR表達(dá)的影響

與模型組相比，空白組、西藥組、托里透膿湯組相較模型組乳腺組織的ER表達(dá)增加，棕黃色陽(yáng)性染色面積更高，其主要原因?yàn)橥暾橄俳M織量的不同；空白組、托里透膿湯組相較模型組PR表達(dá)增加，棕黃色陽(yáng)性染色面積更高。見(jiàn)表3、圖2。

表2 不同時(shí)間糖皮質(zhì)激素及托里透膿湯對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠體重的影響

表3 各組肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠ER、PR面積陽(yáng)性占比的比較

注：A空白組陰性對(duì)照，B空白組ER，C空白組PR；D模型組陰性對(duì)照，E模型組ER，F(xiàn)模型組PR；H西藥組陰性對(duì)照，I西藥組ER，J西藥組PR；K托里透膿湯組陰性對(duì)照，L托里透膿湯組ER，M托里透膿湯組PR。

2.4 托里透膿湯對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠炎性因子及細(xì)胞焦亡相關(guān)性指標(biāo)的影響

與模型組比較，西藥組及托里透膿湯組血清IL-18含量降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4；組織勻漿中caspase-1、GSDMD-n、IL-1β、cleaved IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5、圖4。

注：A空白對(duì)照組；B模型組；C西藥組；D托里透膿湯組。

表4 各組肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠血清IL-18含量的比較

表5 托里透膿湯對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠細(xì)胞焦亡相關(guān)指標(biāo)的影響

3 討論

課題組經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，認(rèn)為托里透膿湯治療肉芽腫小葉性乳腺炎的關(guān)鍵成分主要為黃酮類(lèi)化合物槲皮素、山奈酚、芒柄花素、柚皮素、異鼠李素，人參皂苷類(lèi)化合物人參皂苷Rh2與芍藥苷等[13]；且認(rèn)為其主要作用靶點(diǎn)為IL-1β、IL-6、TNF、CCL2、CXCL8，主要作用為抑制細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的作用、抗炎作用、類(lèi)激素作用及免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示托里透膿湯能使肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠的病灶局限化、降低血清中IL-18水平及組織IL-1β水平，增加乳腺組織局部ER及PR的表達(dá)，體現(xiàn)其類(lèi)激素作用及抗炎作用。caspase-1/GSDMD信號(hào)通路為細(xì)胞焦亡的典型信號(hào)通路，其主要過(guò)程為活化的caspase-1切割GSDMD，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段即GSDMD-n，使細(xì)胞膜穿孔水解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[14]；除此之外，活化的caspase-1切割I(lǐng)L-1β及IL-18并釋放到胞外，募集炎癥細(xì)胞聚集，使炎癥反應(yīng)迅速擴(kuò)大。該信號(hào)通路臨床表現(xiàn)主要為迅速擴(kuò)散的炎癥反應(yīng)，符合肉芽腫小葉性乳腺炎突發(fā)乳房腫塊、迅速紅腫破潰的臨床表現(xiàn)。當(dāng)GSDMD的水解降低，即GSDMD-n的表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞焦亡受到一定程度限制，但不影響IL-18及IL-1β的表達(dá)[14]。在本研究中，糖皮質(zhì)激素與托里透膿湯均可降低GSDMD-n的表達(dá)，因而可以認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素與托里透膿湯在傳統(tǒng)抗炎作用之上，具有一定程度抑制肉芽腫小葉性乳腺炎組織內(nèi)細(xì)胞焦亡的可能。在既往研究中，雌激素可以通過(guò)改變線粒體功能與減輕炎癥相關(guān)的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路降低組織損傷[16]，同樣符合托里透膿湯的類(lèi)激素作用及抗炎效果推測(cè)。

綜上所述，caspase-1/GSDMD信號(hào)通路可能在肉芽腫小葉性乳腺炎中存在異常表達(dá)現(xiàn)象，其主要誘導(dǎo)因素可能為乳腺導(dǎo)管內(nèi)某種抗原誘發(fā)的炎癥因子風(fēng)暴。托里透膿湯的主要作用機(jī)制為通過(guò)下調(diào)IL-1β及IL-18、caspase-1、GSDMD等細(xì)胞焦亡信號(hào)通路相關(guān)的炎癥因子以達(dá)到中止細(xì)胞焦亡在乳腺組織中誘發(fā)的連鎖反應(yīng)，并使炎癥反應(yīng)局限在局部，達(dá)到托里透膿、加快康復(fù)的目的。本實(shí)驗(yàn)的不足為：尚未對(duì)托里透膿湯給藥濃度進(jìn)行進(jìn)一步研究，且需進(jìn)一步探討該藥物對(duì)趨化因子的影響。