歐江濤, 蔣啟程, 周刻焱, 柳 巧, 欒筱琪, 王資生, 張啟煥
(鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院,江蘇鹽城 224051)
中華絨螯蟹()俗稱河蟹,是我國(guó)特有的優(yōu)質(zhì)淡水蝦蟹養(yǎng)殖品種之一,也是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹種,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。隨著中華絨螯蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化大規(guī)模高速發(fā)展,導(dǎo)致水體環(huán)境狀況急速惡化,病害頻發(fā)且愈發(fā)嚴(yán)重。其中,由螺原體引起的“顫抖病”在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中發(fā)生較為廣泛。中華絨螯蟹作為無(wú)脊椎動(dòng)物主要依賴其先天免疫(包括細(xì)胞和體液免疫)發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。目前,對(duì)于中華絨螯蟹細(xì)菌感染研究報(bào)道較多,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹應(yīng)對(duì)副溶血性弧菌()、金黃色葡萄球菌()和嗜水氣單胞菌()等細(xì)菌侵染的免疫反應(yīng)中,整合素(EsIntegrin)、C型凝集素(EsCTL1和EsCTL2)、L型凝集素(ERGIC-53和VIP36)等可作為識(shí)別受體參與宿主免疫防御;其中,、、等基因是重要的免疫調(diào)控因子,發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能。而關(guān)于它的分子調(diào)控機(jī)制,至今仍是研究熱點(diǎn)。
河蟹螺原體()屬于柔膜體綱(Mollicutes)蟲(chóng)原體目(Entomoplasmatales)螺原體科(Spiroplasmataceae)螺原體屬()。螺原體是上世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn),可廣泛寄生于無(wú)脊椎動(dòng)物中具有嚴(yán)重致病性的一類獨(dú)特微生物,其定植于宿主體內(nèi),在長(zhǎng)期與宿主共存過(guò)程中,相互構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),通過(guò)不同精細(xì)調(diào)控細(xì)菌基因表達(dá),以適應(yīng)不同的生存環(huán)境,并對(duì)不同宿主發(fā)揮毒性作用。螺原體為中華絨螯蟹的主要病原體之一,被侵染后死亡率可達(dá)100%,近年中華絨螯蟹螺原體致使中華絨螯蟹、南美白對(duì)蝦()、日本沼蝦()和克氏原螯蝦()等甲殼經(jīng)濟(jì)動(dòng)物暴發(fā)疫病發(fā)生大面積死亡,對(duì)我國(guó)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。中華絨螯蟹螺原體通過(guò)鰓或外殼感染河蟹,并在1~5 d內(nèi)增殖于其靶細(xì)胞-血淋巴細(xì)胞,5~10 d擴(kuò)散至全身器官及結(jié)締組織,最后在 10~15 d引起中華絨螯蟹附肢顫抖直至死亡。
MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA分子,廣泛存在于真核細(xì)胞中,它通過(guò)與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對(duì)調(diào)節(jié)基因表達(dá),其長(zhǎng)度為19~25 nt,miRNA雖不能直接編碼蛋白質(zhì),但miRNA在不同基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中具有重要作用。第一條miRNA被Lee等發(fā)現(xiàn)后,對(duì)于miRNA的研究引起了廣泛關(guān)注,miRNA在各種生命活動(dòng)中起重要調(diào)控作用,如生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、免疫代謝等。目前,miRNA研究方法主要有基因芯片、RNA-seq、Northern blotting和莖環(huán)qRT-PCR等。其中,微流體芯片高通量可靠檢測(cè)miRNAs的存在和差異表達(dá)情況,在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物研究中已廣泛應(yīng)用。
當(dāng)前,利用微流體芯片技術(shù)系統(tǒng)鑒定與分析中華絨螯蟹螺原體感染血細(xì)胞的miRNA及其表達(dá)情況,至今仍未見(jiàn)報(bào)道。前期,筆者所在實(shí)驗(yàn)室以正常和感染螺原體中華絨螯蟹血細(xì)胞為研究對(duì)象,進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,初步預(yù)測(cè)了血細(xì)胞免疫相關(guān)的miRNA。本研究在前期基礎(chǔ)上,通過(guò)構(gòu)建中華絨螯蟹miRNA的特異微流體芯片,進(jìn)一步系統(tǒng)鑒定血細(xì)胞免疫相關(guān)miRNA并檢測(cè)其表達(dá)情況,對(duì)差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和功能聚類與通路分析,相關(guān)研究結(jié)果將為中華絨螯蟹該疫病的免疫防控和抗病育種提供分子信息。
中華絨螯蟹購(gòu)于江蘇省南京市某養(yǎng)殖戶,(100±10) g共100只,在試驗(yàn)前放置于10 L帶有循環(huán)水、紫外滅菌、充氧及控溫系統(tǒng)(26~28 ℃)中培育,通過(guò)PCR技術(shù)及負(fù)染技術(shù)證實(shí)研究所用中華絨螯蟹為螺原體陰性。試驗(yàn)所用螺原體分離自患螺原體病的中華絨螯蟹,R2培養(yǎng)基中培育 48 h 備用。
2012年6月在南京師范大學(xué)將中華絨螯蟹分為對(duì)照組和試驗(yàn)組,各50只,培養(yǎng)20 d備用;對(duì)照組注射100 μL R2培養(yǎng)基,試驗(yàn)組注射100 μL含螺原體(培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期)R2培養(yǎng)基。飼養(yǎng)溫度保持 28 ℃,間歇性供氧。抽取血液,采用Trizol提取法從血細(xì)胞中提取RNA,并對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。
由表1可知,基于miRBase中收錄的中華絨螯蟹、淡水枝角水蚤()、日本對(duì)蝦()、克氏原螯蝦()4種動(dòng)物共897條成熟miRNA序列作為本研究探針。采用Cy3染料標(biāo)記RNA樣品,可通過(guò)檢測(cè)分析Cy3的熒光強(qiáng)度來(lái)尋找2組樣品差異表達(dá)的miRNAs。
在總RNA質(zhì)檢通過(guò)后,進(jìn)入芯片試驗(yàn)階段,由LC Science參與完成。使用Array-Pro圖像分析軟件進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。首先,減除背景值,再使用LOWESS過(guò)濾進(jìn)行信號(hào)歸一化。衡量雜交結(jié)果可靠性的標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)值<0.5;(2)探針信號(hào)值大于3倍背景值與標(biāo)準(zhǔn)偏差的和。滿足以上2點(diǎn)為表達(dá)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
表1 中華絨螯蟹微流體芯片探針
通過(guò)微流體芯片檢測(cè),可獲得正常和感染螺原體中華絨螯蟹共同表達(dá)miRNA及兩者差異表達(dá)miRNA。為了解2組中華絨螯蟹差異miRNA功能,選用分析軟件“miRanda,PITA和TargetScan”進(jìn)行預(yù)測(cè)差異顯著miRNA的所有靶基因,結(jié)合三者預(yù)測(cè)結(jié)果,取交集,獲取共有靶基因。根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行功能分析,根據(jù)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行Pathway分類,而得到Path way分類。
設(shè)計(jì)莖環(huán)引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR試驗(yàn),反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)PCR程序?yàn)椋?2 ℃ 60 min,70 ℃ 15 min。RT-qPCR程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min 95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s 60 ℃ 15 s,39次循環(huán)。每個(gè)樣品均為3復(fù)孔,-為內(nèi)參基因,miRNA差異表達(dá)水平用2-ΔΔ方法計(jì)算。采用Primer 5.0 (ABI)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),采用特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,共設(shè)計(jì)9對(duì)引物,引物序列見(jiàn)表2。
表2 miRNA的引物序列
試驗(yàn)組和對(duì)照組各使用3張芯片進(jìn)行檢測(cè),每張芯片都設(shè)計(jì)多重質(zhì)控探針,保證了樣品標(biāo)記和雜交試驗(yàn)的質(zhì)量控制。對(duì)于正常和感染中華絨螯蟹血細(xì)胞中不同miRNA,根據(jù)芯片所產(chǎn)生的不同反應(yīng)信號(hào),通過(guò)分析這些芯片雜交信號(hào)值,選取Signal>200及<0.05為分析基準(zhǔn),數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后進(jìn)行-Test和Cluster分析。由圖1可知,6張芯片總共鑒定出中華絨螯蟹血細(xì)胞miRNA為303個(gè),試驗(yàn)組和對(duì)照組共表達(dá)miRNA有48個(gè),其中,有27個(gè)表達(dá)miRNA差異顯著(<0.05),6個(gè)表達(dá)miRNA差異極顯著(<0.01);在這些差異表達(dá)的miRNA中,12個(gè)miRNA顯著下調(diào),15個(gè)miRNA顯著上調(diào)(<0.05)。
由表3可知,通過(guò)利用3款分析軟件“miRanda、PITA和TargetScan”對(duì)差異顯著的27個(gè)miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)合三者數(shù)據(jù)取交集,共得78個(gè)靶基因,預(yù)測(cè)靶基因大多數(shù)為各種蛋白和酶的基因,參與調(diào)節(jié)各種生命活動(dòng),尤其是在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用的proPO、ALF-2、Peroxinectin、Relish免疫因子等。
表3 miRNA的預(yù)測(cè)靶基因
由圖2-A可知,對(duì)預(yù)測(cè)到的78個(gè)靶基因進(jìn)行GO注釋,共有116個(gè)GO通路被注釋,明顯富集于24個(gè)GO,包括:蛋白水解、cAMP生物合成和鈣離子結(jié)合等;由圖2-B可知,通過(guò)KEGG注釋,發(fā)現(xiàn)63個(gè)通路被注釋,14個(gè)主要通路,包括:嘌呤代謝、趨化因子信號(hào)通路和GnRH信號(hào)通路等。
為驗(yàn)證微流體芯片的檢測(cè)結(jié)果,由圖3可知,隨機(jī)選取PC-esi-137-3p、PC-esi-14-5p、PC-esi-140-5p、PC-esi-229-3p、PC-esi-262-3p、PC-esi-33-3p、PC-esi-394-5p、PC-esi-433-5p、PC-esi-69-3p這9個(gè)明顯差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證,利用莖環(huán)RT-qPCR法檢測(cè)miRNA的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明,這9個(gè)miRNA表達(dá)水平均上調(diào),與微流體芯片結(jié)果一致。
miRNA通過(guò)與靶標(biāo)基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ),抑制mRNA表達(dá)或直接裂解mRNA,調(diào)控各種生理和病理作用。miRNA也是至今研究最廣泛的一類非編碼RNA,已被證明在調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。因此,鑒定和篩選免疫相關(guān)的miRNA,解析其在宿主與病原體中的相互關(guān)系,將在疾病防控和抗病育種中發(fā)揮重要作用。在miRNA研究中,微流體芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用,微流體芯片技術(shù)是高通量、特異性和敏感性強(qiáng)的一種基因鑒定和差異檢測(cè)方法,在動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫應(yīng)答等方面運(yùn)用較多。李升等選用不同月齡香豬的肝臟組織RNA,與微流體芯片雜交,結(jié)果表明不同月齡肝臟miRNA的表達(dá)水平存在差異。關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物研究,何耀東等利用微流體芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),在注射自噬誘導(dǎo)劑后對(duì)蝦血淋巴中有15個(gè)miRNA明顯上調(diào),17個(gè)miRNA明顯下調(diào),表明相關(guān)差異表達(dá)miRNA在白斑綜合癥病毒(WSSV)侵染對(duì)蝦的過(guò)程中發(fā)揮作用?,F(xiàn)今,微流體芯片技術(shù),因其具有微量化、快速、高通量等特點(diǎn),近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用到癌癥、微生物和營(yíng)養(yǎng)等多個(gè)領(lǐng)域研究中。隨著微流體芯片的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用,將極大促進(jìn)功能性調(diào)控miRNA的發(fā)現(xiàn)與鑒定,為進(jìn)一步研究免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
中華絨螯蟹屬于無(wú)脊椎動(dòng)物,完全依賴先天免疫(包括細(xì)胞和體液免疫),而缺乏適應(yīng)性免疫來(lái)抵御細(xì)菌和病毒等。甲殼動(dòng)物血細(xì)胞是主要的免疫細(xì)胞,在宿主的先天免疫活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用,包括識(shí)別、吞噬、黑化、細(xì)胞毒性和細(xì)胞間信號(hào)傳遞等。因此,識(shí)別和鑒定參與先天免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子(如非編碼RNA和轉(zhuǎn)錄因子)至關(guān)重要。前期研究通過(guò)對(duì)正常和感染螺原體的血細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序分析,結(jié)合生物信息學(xué)分析,共鑒定出735個(gè)miRNA;在被螺原體侵染后,本研究發(fā)現(xiàn)228個(gè)miRNA表達(dá)量存在明顯差異,133個(gè)miRNA顯著上調(diào),95個(gè)miRNA顯著下調(diào)。在此基礎(chǔ)上,本研究選擇微流體芯片和莖環(huán)RT-qPCR技術(shù),對(duì)細(xì)胞免疫相關(guān)miRNAs進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選鑒定與驗(yàn)證。由于μParaflo?微流體芯片相比于傳統(tǒng)點(diǎn)樣芯片具有更可靠、準(zhǔn)確和靈活特點(diǎn),本研究利用該技術(shù)鑒定出中華絨螯蟹血細(xì)胞miRNA共303個(gè);健康組和試驗(yàn)組共表達(dá)miRNA有48個(gè),其中,差異顯著miRNA為27個(gè)(占比56.25%);差異極顯著miRNA為6個(gè)(占比12.50%)。隨機(jī)選擇9個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行莖環(huán)RT-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果與芯片結(jié)果一致,說(shuō)明芯片檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
近年,隨著測(cè)序成本的下降和技術(shù)的不斷發(fā)展,miRNA在蝦蟹免疫調(diào)控中發(fā)揮作用的研究已較為廣泛。Ou等研究發(fā)現(xiàn),pcl-miR-34、pcl-miR-7、PN-pcl-let-7、pcl-miR-1和pcl-miR-2b在克氏原螯蝦應(yīng)對(duì)螺原體侵染過(guò)程中發(fā)揮著積極作用,且在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中高度保守。Bao等研究發(fā)現(xiàn),microRNA-589-5p在凡納濱對(duì)蝦可調(diào)節(jié)抗WSSV免疫應(yīng)答中血藍(lán)蛋白的表達(dá)。Soo等發(fā)現(xiàn),bta-miR-4286、dre-miR-107b 在斑節(jié)對(duì)蝦()應(yīng)對(duì)副溶血弧菌侵染過(guò)程中與對(duì)肌蛋白基因表達(dá)、鈣濃度有調(diào)控作用。本研究通過(guò)利用3款分析軟件“miRanda、PITA和TargetScan”對(duì)差異顯著的27 個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),取三者交集,共得到78個(gè)靶基因,涉及多個(gè)重要免疫通路,其中,()、()、和等多個(gè)靶基因是參與免疫調(diào)控的重要免疫因子。
酚氧化酶(proPO)系統(tǒng)是無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫的重要組成部分之一,過(guò)氧化物酶可與proPO相關(guān)的細(xì)胞黏附因子相互作用來(lái)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。免疫缺陷同系物(immune deficiency homolog,IMD)信號(hào)通路是調(diào)節(jié)甲殼動(dòng)物固有免疫的主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑,而Relish是IMD信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子,Bai等發(fā)現(xiàn),Relish參與了中華絨螯蟹對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的免疫防御過(guò)程;Zhang等發(fā)現(xiàn),Relish在克氏原螯蝦中能誘導(dǎo)基因的表達(dá);絲裂原激活的蛋白激酶途徑(MAPK)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)蛋白來(lái)發(fā)揮調(diào)控功能,如細(xì)胞分化、凋亡、增殖和免疫反應(yīng)。筆者所在課題組前期運(yùn)用RNA-seq測(cè)序技術(shù),結(jié)合本研究的微流體芯片技術(shù),全面分析了正常和感染螺原體的中華絨螯蟹血細(xì)胞mRNA和miRNA轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示,許多免疫相關(guān)miRNA及其靶基因均表達(dá)顯著差異。它們參與了一些典型免疫相關(guān)途徑,包括補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)途徑、VEGF信號(hào)途徑、Wnt信號(hào)途徑、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、MAPK信號(hào)途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑和溶酶體途徑。
本研究同時(shí)通過(guò)對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行了GO和KEGG功能分析,共注釋到116個(gè)GO通路和63個(gè)KEGG通路,主要集中于宿主的多種酶活性、代謝和免疫通路等,包括細(xì)胞免疫涉及的包囊、結(jié)節(jié)形成和吞噬作用,與體液免疫涉及的酚氧化酶激活系統(tǒng)(proPO系統(tǒng))、凝血級(jí)聯(lián)和抗菌肽(AMP)的合成等。以上研究結(jié)果可為進(jìn)一步深入研究中華絨螯蟹免疫機(jī)制提供科學(xué)理論依據(jù),為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物蝦蟹該疫病的綜合防控奠定基礎(chǔ)。