硒、硅對(duì)鎘脅迫下小麥生長(zhǎng)、生理特性及鎘分布的影響

張明輝， 時(shí)曼麗

(南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南南陽(yáng) 473000)

鎘(Cd)是一種劇毒性化學(xué)元素，存在于水體和土壤環(huán)境介質(zhì)中。人類活動(dòng)，包括金屬采礦和冶煉、廢水灌溉、磷肥施用等是環(huán)境Cd污染的主要來(lái)源，人類行為產(chǎn)生的Cd含量比與地質(zhì)自然Cd含量高出3～10倍。Cd是流動(dòng)性較快的重金屬元素之一，并且在水-土壤-植物系統(tǒng)中具有較高的活性；農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中向土壤施入Cd是一種凈匯過(guò)程，這意味著一旦Cd進(jìn)入到環(huán)境介質(zhì)中，很容易在植物中積累，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量，然后通過(guò)食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體，對(duì)人體肝臟、生殖器、心血管、內(nèi)分泌以及肝臟系統(tǒng)造成損害，從而對(duì)環(huán)境和人類健康造成不利影響。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中限制Cd從土壤轉(zhuǎn)移到植物對(duì)于食品安全至關(guān)重要。

目前，已探索了一系列農(nóng)藝措施、生物技術(shù)及土壤鈍化技術(shù)來(lái)管理和修復(fù)Cd污染土壤并控制其在作物中的積累。研究發(fā)現(xiàn)，為植物提供有益元素是減少小麥Cd積累和毒性的最具成本效益、環(huán)境友好的可持續(xù)策略之一。硅(Si)和硒(Se)是廣受關(guān)注的重要有益元素，大量研究表明，Si、Se對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量收獲和抵抗各種生物/非生物脅迫皆具有較佳的作用效果。研究表明，Si可以有效減輕不同作物的重金屬毒性，如玉米、小麥和水稻。在Cd脅迫下，Si可以調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)Cd從外部溶液轉(zhuǎn)運(yùn)到水稻植物根部細(xì)胞的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制Cd吸收。在細(xì)胞中，Si與半纖維素結(jié)合具有凈負(fù)電荷可抑制Cd吸收，使其在細(xì)胞壁上形成共沉積。Cd受到HMA基因家族表達(dá)的調(diào)節(jié)，促進(jìn)液泡中的Cd分離，以減輕Cd在植物中遷移和運(yùn)輸過(guò)程中的毒性。Se是動(dòng)物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，也是植物的有益營(yíng)養(yǎng)元素，Se主要通過(guò)防止氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)光利用率，修復(fù)細(xì)胞損傷和調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)降低Cd毒性。

Si和Se的比較研究在研究人員中也越來(lái)越受到關(guān)注。 Wu等的研究表明，在卷心菜植株中同時(shí)噴灑5 μmol/L Si和Se可顯著降低卷心菜的根系和地上部中的Cd含量。然而，關(guān)于這些必需微量元素的相互作用及其對(duì)緩解Cd毒性影響的認(rèn)識(shí)仍然有限。小麥?zhǔn)侨?0%以上人口的主要食物，小麥中的高Cd積累導(dǎo)致過(guò)量的Cd攝入從而對(duì)人類健康造成巨大威脅；因此，減少小麥從土壤中吸收Cd是一個(gè)至關(guān)重要的糧食安全環(huán)節(jié)?；诖耍狙芯刻剿髁薙e和Si相互作用對(duì)小麥發(fā)育代謝、抗氧化系統(tǒng)、Cd累積分布及相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2021年2—5月在南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行。供試小麥品種為鄭麥1354，種子來(lái)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所。種子采用0.5%次氯酸鈉進(jìn)行表面滅菌15 min，然后用去離子水沖洗數(shù)次并浸泡12 h，然后放置于鋪墊潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)箱暗處理催芽24 h。

供試鎘為氯化鎘(CdCl)，硒為五水亞硒酸鈉(NaSeO·5HO)，硅為九水偏硅酸鈉(NaSiO·9HO)，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

供試土壤取自河南省南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)附近原始土，土壤類型為中性沙壤土。土壤經(jīng)風(fēng)干后混勻過(guò) 3 mm 網(wǎng)篩，土壤pH值為7.11，土壤有機(jī)質(zhì)含量10.06 g/kg，全氮含量0.85 g/kg，堿解氮含量 42.80 mg/kg，有效磷含量12.23 mg/kg，速效鉀含量75.29 mg/kg，全鎘含量0.04 mg/kg，根據(jù)GB 15618—2018《農(nóng)用地土壤污染土壤環(huán)境質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)控制標(biāo)準(zhǔn)》，當(dāng)土壤6.5

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：CK，不施用鎘、硒、硅；Cd處理：僅施用鎘，不施用硒、硅；Cd+Si處理：施用鎘、硅，不施用硒；Cd+Se處理：施用鎘、硒，不施用硅；Cd+Si+Se處理：施用鎘、硒、硅。各處理重復(fù)4次。其中Cd用量為15 mg/kg，Si、Se單一元素用量皆為4 mg/kg。

盆栽裝置為黑色方形塑料盒(20 cm×15 cm×15 cm)，每盆裝土2.5 kg。Cd、Se、Si皆采用水溶方式提前施入。每盆施入小麥種子20粒，出苗后減至10株。為保證幼苗的正常生長(zhǎng)及養(yǎng)分平衡，每周向盒中加入50 mL小麥營(yíng)養(yǎng)液。共培育35 d，種植期間不定時(shí)加入無(wú)菌水，其他管理措施同作物培育方法。

1.3 樣品采集及測(cè)定分析

1.3.1 小麥植株生物量、Cd濃度及Cd亞細(xì)胞分布測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后將小麥植株地上部、根系分開，采用直尺測(cè)量根長(zhǎng)及株高參數(shù)，將植株105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干至恒質(zhì)量以計(jì)算生物量。Cd濃度采用HNO消解，采用電感耦合等離子體光譜儀(ICP-OES)測(cè)定樣品中的Cd濃度。

細(xì)胞壁(Fcw)、細(xì)胞質(zhì)(Fs)和細(xì)胞器(Fo)分級(jí)用于確定Cd的亞細(xì)胞分布，相關(guān)方法參考Xin等的研究并略有修改，即將冷凍小麥植物樣品稱量到冷砂漿中，并用預(yù)冷的250 mmol/L蔗糖和1 mmol/L二硫代甲狀腺素醇(DTT)混合緩沖溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5)提取樣品。然后將勻漿以7 000 r/min離心30 s，沉淀物即為Fcw，在上清液以15 000 r/min進(jìn)一步離心45 min后，上清液溶液和沉積物分別鑒定為Fs和Fo。

1.3.2 光合特征參數(shù)及葉綠素含量測(cè)定 光合色素包含葉綠素a、葉綠素b均采用丙酮-乙醇混合浸提，采用紫外分光光度計(jì)(UV-755B，青島聚創(chuàng)華業(yè)分析儀器有限公司)在665、649 nm處測(cè)定吸光度，具體步驟參照李合生等的研究。采用LI-6400便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)(LI-6400；LI-COR，America)測(cè)定葉片的凈光合速率()、胞間CO濃度()、蒸騰速率()和氣孔導(dǎo)度()等指標(biāo)，葉室溫度設(shè)置為(25±1) ℃，CO濃度為440 μmol/mol，光量子密度為800 μmol/(m·s)。

1.3.3 丙二醛(MDA)、抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)和植物螯合肽(PC)含量的測(cè)定 丙二醛含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，抗壞血酸含量的測(cè)定采用2，4-二硝基苯肼比色法。

采用三氯乙酸(DTPA)和5%磺基水楊酸順時(shí)針快速研磨獲得粗提物，GSH含量的測(cè)定參照韓丹的方法，即抽取0.25 mL上述提取物加入 2.6 mL 150 mmol/L NaHPO(pH值7.7)和 0.18 mL 5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)試劑。采用30 ℃水浴振蕩5min，采用紫外分光光度計(jì)在412 nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的GSH含量。PC含量測(cè)定：將1 mL粗提物與2.2 mL的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 值7.0)和0.3 mL的DTNB試劑混合，隨后在30 ℃水浴振蕩10 min，然后測(cè)量412 nm處的吸光度。

1.3.4 Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)水平測(cè)定 采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)對(duì)小麥根系進(jìn)行總RNA提取，使用DNaseI-Verso cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)構(gòu)建cDNA。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit從總RNA合成第一鏈cDNA。實(shí)時(shí)PCR采用SYBR Premix ExⅡ 與 7500快速實(shí)時(shí)PCR序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。以為看家基因，相關(guān)Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的引物序列見表1。熱曲線程序：90 ℃30 s，95 ℃15 s，60 ℃30 s和72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線進(jìn)行分析和瓊脂糖凝膠電泳以保證擴(kuò)增子。具體反應(yīng)體系、反應(yīng)程序步驟見Zhou等的研究，采用2-ΔΔ斷層掃描方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度。

表1 Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的qRT-PCR 引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(=0.05)，采用Origin 2021進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒、硅對(duì)鎘脅迫下小麥生長(zhǎng)及葉綠素含量的影響

由表2可知，株高和根長(zhǎng)中，各處理均表現(xiàn)為Cd處理

表2 硒、硅對(duì)鎘脅迫下小麥生長(zhǎng)參數(shù)及葉綠素含量的影響

2.2 硒、硅對(duì)鎘脅迫下小麥光合特征參數(shù)的影響

由圖1-A可知，凈光合速率指標(biāo)中，以CK最高，Cd+Si+Se處理次之，二者無(wú)顯著差異，均顯著大于其他3個(gè)處理，且Cd、Cd+Si、Cd+Se這3個(gè)處理間差異不顯著。由圖1-B可知，胞間CO濃度指標(biāo)中，以Cd處理最低，CK、Cd+Se處理、Cd+Si處理、Cd+Si+Se處理較Cd處理分別顯著提高173.63%、104.74%、136.80%、153.82%。氣孔導(dǎo)度指標(biāo)中，CK處理最高，Cd處理、Cd+Se處理、Cd+Si處理、Cd+Si+Se處理較CK分別顯著降低75.34%、64.38%、67.12%、57.53%，同時(shí)這4個(gè)處理處理間差異不顯著(圖1-C)。蒸騰速率指標(biāo)中，各處理表現(xiàn)為Cd處理

2.3 硒、硅對(duì)鎘脅迫下小麥鎘吸收及轉(zhuǎn)移的影響

由圖2-A可知，鎘脅迫下，各處理根系的Cd濃度為地上部濃度的7.03～45.08倍，表明鎘脅迫下小麥根系是主要的Cd累積器官。地上部中，以Cd處理濃度最高，為239.61 μg/g，其他處理較其顯著降低34.04%～69.69%；Cd+Si+Se處理的鎘濃度最低，其他處理較其顯著增加112.57%～229.95%。各處理根系鎘濃度規(guī)律與地上部相反，Cd+Si+Se處理鎘濃度最高，Cd、Cd+Si、Cd+Se處理較Cd+Si+Se處理顯著降低48.55%、26.33%、53.94%，且Cd+Si處理的濃度顯著高于Cd、Cd+Se處理。鎘轉(zhuǎn)移系數(shù)為地上部濃度與根系濃度之比，因此，在轉(zhuǎn)移系數(shù)中各處理呈Cd+Si+Se處理

2.4 硒、硅對(duì)鎘脅迫下小麥鎘亞細(xì)胞分布的影響

小麥地上部和根系的細(xì)胞被分成細(xì)胞壁(Fcw)、細(xì)胞質(zhì)(Fo)和細(xì)胞器(Fs)3個(gè)亞細(xì)胞部分。對(duì)亞細(xì)胞鎘濃度的分析(圖3-A)表明，各處理地上部的亞細(xì)胞鎘總濃度均低于地下部，尤其是Cd+Si+Se處理。地上部中，亞細(xì)胞鎘總濃度以CK處理最高，Cd、Cd+Si、Cd+Si+Se處理較CK處理降低67.37%～88.73%；根系中，各處理亞細(xì)胞鎘總濃度表現(xiàn)為Cd+Se處理

2.5 硒、硅對(duì)鎘脅迫下小麥抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)的影響

由圖4-A可知，各處理地上部的丙二醛含量明顯高于根系，與CK相比，Cd脅迫處理顯著增加了MDA含量，其地上部、根系增幅分別為38.20%、28.43%，在此基礎(chǔ)上添加Si、Se、Si+Se顯著降低了小麥植株地上部和根系的MDA含量，地上部的降幅為64.44%、19.69%、56.85%；根系的降幅為20.74%、18.73%、38.13%。由圖4-B可知，AsA含量指標(biāo)中，與相應(yīng)部位的CK相比，Cd處理地上部、根系的AsA含量分別顯著降低34.66%、40.08%，而施用硒、硅單一和組合處理的地上部顯著提高30.01%～45.68%，根系提高8.14%～61.59%。而在GSH含量指標(biāo)中，各處理的GSH含量與AsA含量的規(guī)律趨于一致，即與CK相比，鎘脅迫降低了地上部和根系的GSH含量，施用硒、硅單一及組合處理則增加了地上部和根系的GSH含量(圖4-C)。由圖4-D可知，PC含量指標(biāo)中，與CK相比，Cd、Cd+Si、Cd+Se、Cd+Si+Se處理的地上部和根系分別顯著降低18.18%～48.27%和65.27%～81.52%；無(wú)論地上部還是根系，均以Cd處理的PC含量最低，與Cd處理相比，Cd+Si、Cd+Se、Cd+Si+Se處理的地上部和根系分別顯著提高33.89%、30.54%、58.16%和84.92%、81.16%、87.94%。

2.6 硒、硅對(duì)鎘脅迫下小麥鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)的影響

測(cè)定小麥中參與鎘轉(zhuǎn)運(yùn)的基因(、、和)的相對(duì)表達(dá)量，以了解硒和硅緩解小麥耐鎘的分子機(jī)制。由圖5-A可知，與CK相比，Cd處理降低了水稻根系中、和的相對(duì)表達(dá)量，增加了的表達(dá)水平；與Cd處理相比，添加Si、Si+Se使的表達(dá)水平分別顯著上調(diào)118.18%、122.73%。與Cd處理相比，單施Si、Se使的相對(duì)表達(dá)量分別降低了30.51%、52.54%，而Si+Se處理的相對(duì)表達(dá)量增加了83.62%，與單施Si、Se相比，Si+Se的表達(dá)水平分別顯著增加了164.23% 和286.90%(圖5-B)。此外，與Cd處理相比，Si、Se和Si+Se的添加均顯著抑制了表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量降幅分別為55.17%、64.66%、32.76%(圖5-C)。與其他基因的表達(dá)趨勢(shì)不同，與Cd處理相比，Si、Se的添加均降低了的相對(duì)表達(dá)量，而Si+Se處理使該基因相對(duì)表達(dá)量顯著增加了1.25倍(圖5-D)。

3 結(jié)論與討論

土壤Cd濃度超標(biāo)已成為影響農(nóng)業(yè)安全發(fā)展的制約因子，Si、Se是植物生長(zhǎng)發(fā)育的有益元素，大量研究表明，脅迫環(huán)境下Si、Se對(duì)作物生理的影響存在積極作用。本研究結(jié)果表明，鎘脅迫下，植物株高、根長(zhǎng)及干物質(zhì)累積量受到顯著影響，在此基礎(chǔ)上添加Si、Se可有效緩解上述生長(zhǎng)參數(shù)，同時(shí)在Si與Se結(jié)合處理(Cd+Si+Se)下得到進(jìn)一步促進(jìn)，其長(zhǎng)勢(shì)與CK處理大體相當(dāng)。此外，各處理小麥葉片的凈光合速率、胞間CO濃度、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和葉綠素含量整體表現(xiàn)為Cd處理

重金屬的亞細(xì)胞分布是植物中最主要的重金屬解毒機(jī)制之一，植物細(xì)胞壁是保護(hù)原生質(zhì)體免受鎘毒害的首道屏障，它可提供羥基或羧基等極性物質(zhì)與重金屬離子結(jié)合，細(xì)胞壁上的離子交換位點(diǎn)飽和后，進(jìn)入細(xì)胞的重金屬會(huì)被隔離到液泡中，從而降低游離重金屬離子的活性，進(jìn)一步降低鎘對(duì)植物細(xì)胞器的干擾。本研究中，在Cd含量較高的根系中，Cd主要集中在細(xì)胞壁中，且與細(xì)胞器相比，Si處理的鎘在細(xì)胞質(zhì)中的分布比例更小。這與Zhang的研究結(jié)論趨于一致，即硅可以通過(guò)增加細(xì)胞壁中Cd的含量和比例來(lái)減少Cd在細(xì)胞質(zhì)中的分布。本研究中，與相應(yīng)部位的CK相比，添加硒對(duì)根系細(xì)胞器中的Cd濃度沒(méi)有影響，但卻增加了地上部細(xì)胞器的濃度和比例；因此，地上部細(xì)胞器沉淀重金屬可能是硒減輕小麥根系鎘毒性的主要機(jī)制之一。當(dāng)Si和Se結(jié)合使用時(shí)，小麥根系Cd濃度最高，轉(zhuǎn)移系數(shù)最低，且與其他處理差異顯著(圖2)；此外，地上部、根系細(xì)胞質(zhì)中的Cd濃度及比例進(jìn)一步降低，地上部細(xì)胞器的Cd含量增加(圖3)。這說(shuō)明Si和Se的協(xié)同作用可以顯著抑制Cd上移，且促進(jìn)地上部細(xì)胞壁螯合Cd。

氧化還原失衡是鎘脅迫的另一個(gè)重要毒性表現(xiàn)。丙二醛是脅迫下過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞膜造成嚴(yán)重破壞；抗壞血酸是緩解細(xì)胞高度氧化的重要還原物質(zhì)，可中和過(guò)氧化物質(zhì)；而谷胱甘肽和植物螯合肽含有硫醇基團(tuán)(—SH)，在重金屬解毒的螯合和分離過(guò)程中起重要作用。本研究中，Cd處理增加了小麥中的MDA含量，這表明Cd存在氧化損傷，在此基礎(chǔ)上Si、Se單一或結(jié)合使用均顯著降低了地上部、根系MDA含量(圖4-A)，各處理AsA含量變化趨勢(shì)與MDA相反，這意味著Si、Se結(jié)合使用可有效調(diào)控MDA與AsA的區(qū)室化中和作用以減輕Cd毒性。此外，Si、Se單一或結(jié)合使用皆增加了GSH和PC含量(圖4-C、圖4-D)，GSH分泌增加可以直接螯合重金屬，且較高的GSH含量會(huì)增加PC的產(chǎn)生，進(jìn)而螯合細(xì)胞中的Cd形成PC-Cd復(fù)合物，這些復(fù)合物通過(guò)液泡膜ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，從而降低細(xì)胞質(zhì)中的Cd濃度。

金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控對(duì)于調(diào)控植物中重金屬的積累和分布至關(guān)重要。在小麥植株中，位于根皮和內(nèi)胚層末端的是吸收Cd的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與細(xì)胞Cd植物內(nèi)的吸收和Cd運(yùn)輸，于小麥根細(xì)胞的液泡膜，負(fù)責(zé)將Cd螯合到根液泡中，于細(xì)胞質(zhì)膜上，介導(dǎo)Cd從根系向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究中，Cd處理降低了小麥根系的表達(dá)(圖5-A)，添加Si、Se后，的相對(duì)表達(dá)量增加，與根系中Cd濃度變化趨勢(shì)一致(圖2)，同時(shí)Cd處理上調(diào)了的表達(dá)，添加Si、Se后，的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(圖 5-C)，這會(huì)導(dǎo)致較少的Cd轉(zhuǎn)移到地上部，這與小麥地上部的Cd濃度趨勢(shì)一致(圖2)。值得注意的是，Si+Se處理后，的相對(duì)表達(dá)量較單一Si、Se處理發(fā)生顯著上調(diào)，而地上部Cd濃度和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著降低。此外，Cd處理抑制了和的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上Si+Se處理的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖5-B、圖5-D)，這與根中Cd亞細(xì)胞分布一致(圖4)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，Si和Se的協(xié)同作用可以通過(guò)調(diào)節(jié)和的表達(dá)來(lái)促進(jìn)Cd向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低根系Cd毒性。