蛋白激發(fā)子AMEP提高大豆抗旱性的高通量表型分析

王思文， 杜艷麗， 劉 權(quán)， 殷奎德

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶 163319； 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

大豆是我國重要的油料作物，其生長過程受到干旱脅迫影響，嚴重時可導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。目前，提高大豆抗旱性主要是通過選育抗旱品種和改進栽培等方法，而利用蛋白激發(fā)子提高植物抗旱性是目前研究的熱點。

蛋白激發(fā)子作為一種環(huán)境友好的外源性刺激因子，可以調(diào)控基因的表達，進而誘導(dǎo)體內(nèi)一系列代謝循環(huán)，促進植物生長發(fā)育，提高植物對非生物脅迫的抗性。目前，有報道稱蛋白激發(fā)子可以提高植物的抗旱性。蛋白激發(fā)子AMEP是從枯草芽孢桿菌中分離純化的一種新型蛋白激發(fā)子，它可以刺激植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)，引起活性氧的積累，提高抗逆相關(guān)蛋白酶的活性等防衛(wèi)反應(yīng)。這些防衛(wèi)反應(yīng)會進一步激活植物的免疫系統(tǒng)，從而緩解外界脅迫帶來的傷害。然而，蛋白激發(fā)子AMEP是否能夠提高植物的抗旱性，還有待進一步驗證。

近年來，植物高通量表型分析技術(shù)逐漸成熟，該技術(shù)可利用自動化、遠程操控及圖像數(shù)據(jù)分析而應(yīng)用于各類植物表型的研究中，具有數(shù)據(jù)精準(zhǔn)度高且對植株無損傷的特性。隨著高通量植物表型分析技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，形成了大體量數(shù)據(jù)、多種學(xué)科技術(shù)相融合、數(shù)據(jù)多樣的植物表型組學(xué)體系，該體系覆蓋了植物從細胞到群體的不同方向、不同生長環(huán)境下其性狀的遺傳與變異，以及植物對非生物脅迫的響應(yīng)等。

本研究利用多光譜植物激光三維掃描儀、葉綠素測定儀、葉綠素?zé)晒鈨x、光合儀對大豆形態(tài)參數(shù)、生理參數(shù)進行實時測定，以期利用快捷、方便的高通量表型數(shù)據(jù)分析技術(shù)解析蛋白激發(fā)子AMEP對大豆幼苗抗旱性的提升作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗設(shè)計

以大豆品種綏農(nóng)26為試驗品種，于2021年5月5日進行盆栽試驗。在打孔塑料盆(上口徑 9.0 cm，下口徑5.5 cm，高17.5 cm)中裝入0.4 kg土后用水澆透，于第 2 天清晨每盆播 4 粒已經(jīng)消毒且色澤均勻、大小一致的大豆種子，種子上均勻覆蓋0.1 kg土壤，大豆生長至V1期時每盆保留1 株生長均勻一致的幼苗。

于大豆第3節(jié)期(V1)期土壤相對含水量達到80%時，停止?jié)菜娛〢MEP蛋白(濃度為 0.5 mg/mL)，對照噴施蒸餾水后連續(xù)干旱，根據(jù)土壤含水量的百分比可分為3個干旱程度：輕度干旱組LD(土壤相對含水量為>60%～70%)，中度干旱組MD(土壤相對含水量為>50%～60%)，重度干旱組SD(土壤相對含水量為35%～50%)。對照組CK相對含水量保持在80%左右。本試驗設(shè)1個對照和2個處理，即對照CK(噴施蒸餾水+非干旱處理)，DS處理(噴施蒸餾水+干旱處理)，ADS處理(噴施蛋白激發(fā)子AMEP+干旱處理)。在停止?jié)菜畷r噴灑蒸餾水或蛋白激發(fā)子AMEP。重復(fù)3 次。

1.2 測量項目與方法

1.2.1 土壤含水量測定

引用周明欣的干燥法測定土壤的水分含量。從大豆幼苗盆中取出土壤，置于 105 ℃ 的烘箱中進行烘干處理，干燥后損失的水分就是土壤的含水量。烘干前土壤質(zhì)量為，烘干前土壤質(zhì)量減去烘干后土壤質(zhì)量即為土壤水分質(zhì)量，土壤的含水量計算公式為：土壤含水量=×100。

1.2.2 表型測定 使用多光譜植物激光三維掃描儀Plant Eye F500對植株進行表型測定，測定時為了減少多株葉片重疊覆蓋對測量數(shù)據(jù)的影響，測量前保持每盆1株植株。將植株放在掃描范圍內(nèi)對大豆幼苗的株高、數(shù)字生物量以及3D葉面積、葉片傾斜度、Hue(色相)、歸一化植被指數(shù)(NDVI)等進行掃描測量。

葉片傾斜度=3D葉面積/投影葉面積；

數(shù)字生物量=3D葉面積×株高。

1.2.3 SPAD值測定 SPAD值可以用來表示葉綠素的相對含量。在大豆幼苗長到V1期時使用Minolta SPAD502便攜式葉綠素儀，選擇大豆幼苗的第一復(fù)葉中3張小葉的不同部位進行SPAD值的測量。

1.2.4 光合測定 使用LI-6400光合儀(Li-Cor，Hunting)，在晴天上午10：00時，測定了無病蟲害和機械損傷的大豆第一復(fù)葉的光合參數(shù)。待實測參數(shù)穩(wěn)定后，測定葉片胞間CO濃度(intercellular COconcentration，)、葉片的蒸騰速率(transpiration rate，)、葉片凈光合速率(net photosynthetic rate，)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，)的數(shù)值，其中測定的葉室溫度 20 ℃，光照度為1 000 μmol/(m·s)。

1.2.5 葉綠素?zé)晒鉁y定 使用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(FMS-2，Hansatech，England)測量大豆幼苗葉片的葉綠素?zé)晒猓跍y量暗反應(yīng)前先選擇大豆的第1張復(fù)葉進行避光處理30 min，然后在 2 000 μmol/(m·s) 的飽和光強條件下測量出最大熒光 () 、最大光化學(xué)效率 (/)、初始熒光()。在光適應(yīng)下打開遠紅光，可測量出光化學(xué)淬滅系數(shù)() 、非光化學(xué)淬滅系數(shù)()、PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)量[Y(Ⅱ)]、PSⅡ調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y(NPQ)]、光合電子轉(zhuǎn)移速率(ETR)的值。

1.3 統(tǒng)計分析

最后得到的數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行分析，利用制圖軟件Origin 9.0進行制圖，SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白激發(fā)子AMEP對干旱脅迫下大豆幼苗形態(tài)及參數(shù)的影響

干旱脅迫會導(dǎo)致大豆幼苗植株葉片萎蔫下垂，水分失去平衡，莖生長緩慢，大豆幼苗的株高降低，莖比正常小。圖1為3種干旱程度下大豆幼苗形態(tài)對比，可以看出隨著干旱脅迫的加重，大豆幼苗葉面受損也隨之加重。在輕度干旱脅迫下，蛋白激發(fā)子AMEP處理后的大豆幼苗與對照葉片損傷差異不明顯；在中度、重度干旱下，由于水分逐漸缺失，DS處理較ADS處理受脅迫也逐漸加重，且在重度干旱脅迫下效果最為明顯。在重度干旱脅迫下DS處理的葉片萎蔫程度較ADS處理更明顯，葉綠素含量也較ADS處理更少，說明蛋白激發(fā)子AMEP可以有效提高大豆幼苗的抗旱性。

由表1可知，干旱會降低大豆幼苗數(shù)字生物量，噴施蛋白激發(fā)子AMEP后可顯著提高數(shù)字生物量，在重度干旱下差異最大，ADS處理較DS處理增加37.99%；干旱會影響株高，噴施蛋白激發(fā)子AMEP后株高提升顯著，在輕度、中度、重度干旱下分別較DS處理高20.35%、23.41%、9.47%；噴施蛋白激發(fā)子AMEP后可提高大豆幼苗色調(diào)值Hue；顯著增加了3D葉面積，在輕度、中度、重度干旱下分別較DS處理增加27.57%、19.10%、40.78%；在輕度、中度干旱條件下，噴施蛋白激發(fā)子AMEP后投影面積略有增加，在重度干旱脅迫下投影面積沒有變化；3種脅迫程度下，噴施蛋白激發(fā)子AMEP后光穿透深度值較DS處理分別增加45.97%、43.64%、37.58%，光穿透深度值的增加說明蛋白激發(fā)子AMEP處理下的大豆葉片層疊程度更小。歸一化植被指數(shù)(NDVI)能夠體現(xiàn)出植物的生長狀況。張佳華等認為，NDVI也可以體現(xiàn)植株的光合作用強弱。蛋白激發(fā)子AMEP能夠提高干旱脅迫下的歸一化植被指數(shù)，并在輕度、中度、重度干旱下分別較DS處理增加1.15%、19.64%、19.67%。干旱脅迫影響了大豆幼苗的生長，隨著干旱程度加重其影響越大，施用蛋白激發(fā)子AMEP可以緩解干旱對大豆幼苗不利生長的影響。

表1 不同程度干旱脅迫下大豆幼苗形態(tài)特征

2.2 蛋白激發(fā)子AMEP對干旱脅迫下大豆幼苗葉片光合特性的影響

圖2至圖5顯示，在干早脅迫下大豆幼苗葉片中胞間CO濃度()、凈光合速率()、氣孔導(dǎo)度()、蒸騰速率()的參數(shù)均有所降低。隨著土壤含水量的減少，大豆幼苗水分缺失不斷加劇，蛋白激發(fā)子AMEP處理后，在輕度、中度、重度干旱下，與DS處理相比，ADS處理的分別增加了11.73%、

23.07%、44.44%，分別增加24.00%、18.18%、35.29%，分別增加17.64%、25.00%、50.00%，分別增加14.81%、22.72%、38.89%。干旱脅迫下，由于大豆葉片氣孔的關(guān)閉，降低和的值，從而影響光能捕捉能力，導(dǎo)致凈光合速率降低。施用蛋白激發(fā)子AMEP可以不同程度地提高葉片的光合參數(shù)，說明干旱條件下噴施蛋白激發(fā)子AMEP可以提高大豆光合作用效率。

2.3 蛋白激發(fā)子AMEP對干旱脅迫下大豆幼苗葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

從圖6可以看出， 蛋白激發(fā)子AMEP顯著提高了大豆葉片的SPAD值(<0.05)，在輕度、中度、重度干旱條件下，ADS處理分別比DS處理提高了4.87%、18.75%、28.00%。由圖7至圖10可知，在干旱脅迫下測定的大豆幼苗葉片的PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率 ()、潛在光化學(xué)效率(/)、光能轉(zhuǎn)化效率(/)、表觀電子轉(zhuǎn)移速率(ETR)均較CK有所下降，隨著干旱程度的加重，各項指標(biāo)下降明顯，在重度干旱脅迫下差異最顯著，分別下降7.14%、9.37%、7.69%、6.06%。輕度干旱脅迫下大豆幼苗的/、、/、ETR與CK無顯著差異，說明輕度干旱脅迫對大豆幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響不大。干旱脅迫下，蛋白激發(fā)子AMEP能顯著提高大豆幼苗葉片的/、/、ETR、，在中度干旱和重度干旱條件下與CK相比分別提高35.00%、20.37%、25.00%、18.18%和46.66%、25.00%、33.33%、20.00%。蛋白激發(fā)子AMEP能在一定程度上緩解干旱脅迫對大豆幼苗/、/、ETR、的影響。

3 討論

蛋白激發(fā)子可以激活植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)，進而激活植物免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)植物生長和代謝，提高植物抗逆性，促進植物生長。前期研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白激發(fā)子AMEP能夠有效引起煙草葉片的過敏反應(yīng)，增加抗氧化酶防御、相關(guān)蛋白酶的表達和提高植物抗逆性等早期防衛(wèi)反應(yīng)，如抗旱性。本研究表明，在干旱脅迫下蛋白激發(fā)子AMEP可以改善大豆幼苗表型受損程度，提高大豆的光合速率、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒馓匦?，進而緩解干旱對大豆幼苗生長的抑制，減輕干旱脅迫的損害。

干旱脅迫是影響大豆生長的主要脅迫因素。干旱脅迫會導(dǎo)致大豆的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生異常生理反應(yīng)，如葉片萎蔫、枯黃，植株矮化，甚至?xí)?dǎo)致死亡。干旱脅迫通過誘導(dǎo)部分葉片脫落來改變冠層的形態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致葉片面積更小、更厚，從而減少水分的消耗和損失，同時增強持水能力，提高植物對缺水環(huán)境的適應(yīng)性。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下噴施蛋白激發(fā)子AMEP可以提高大豆幼苗的株高、投影葉面積、3D葉面積、光穿透深度、葉片傾角等形態(tài)參數(shù)。這說明蛋白激發(fā)子AMEP能緩解干旱脅迫對大豆幼苗生長的影響，具有提升大豆抗旱性的作用。

光合作用是植物最重要的生理過程之一，其中光合參數(shù)作為植物生長和抗逆性的重要指標(biāo)，能反映植物對環(huán)境的適應(yīng)性。一般來說，影響植物光合作用的因素可分為氣孔因子和非氣孔因子。農(nóng)開云等發(fā)現(xiàn)，凈光合速率下降的主要因素在輕度干旱脅迫下是由于氣孔限制引起的，而重度干旱脅迫下，則是由于非氣孔限制。本研究結(jié)果表明，噴施AMEP蛋白緩解了干旱脅迫引起的氣孔導(dǎo)度下降，從而提高了、、光合速率。光合速率的增加可以促進光合產(chǎn)物的運輸和積累，減輕細胞在干旱脅迫下的氧化損傷。SPAD值反映了植物的相對葉綠素含量，在一定條件下，SPAD值可以用來代替葉綠素含量評估植物健康狀況。噴施蛋白激發(fā)子AMEP可有效提高大豆幼苗葉片的相對葉綠素含量和光合效率，從而減少干旱脅迫的危害。葉綠素?zé)晒馓匦钥梢苑从橙~片光合系統(tǒng)對光能的吸收、傳輸和分布，通過研究葉綠素的熒光特性，我們可以了解植物在脅迫下的生理狀態(tài)。干旱脅迫抑制光合速率，導(dǎo)致光能的過度吸收，從而導(dǎo)致活性氧的積累和光合系統(tǒng)的損害。光合系統(tǒng)受損導(dǎo)致碳同化能力減弱，形成惡性循環(huán)，/、/、PSⅡ、ETR降低。隨著干旱脅迫的加重，光系統(tǒng)的損傷加重，蛋白激發(fā)子AMEP可以提高光合效率、電子傳遞速率、光能轉(zhuǎn)化效率。

傳統(tǒng)的植物表型測量主要依靠人工，不僅勞動量大、效率低，而且測量質(zhì)量受人為因素影響較大，幾乎不可能對大量樣本的生長發(fā)育進行測量。近年來，包括光學(xué)成像技術(shù)在內(nèi)的高通量表型分析技術(shù)以其快速、高效、無損傷、高靈敏度的優(yōu)點，為獲取植物葉片/冠層形態(tài)生長模型、脅迫響應(yīng)、光合作用等信息提供了極大幫助。本研究利用高通量植物表型分析技術(shù)，對不同程度干旱脅迫下蛋白激發(fā)子AMEP對大豆幼苗的影響進行表型測定分析，為蛋白激發(fā)子AMEP提高大豆幼苗植株抗旱性提供高效快速的表型數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

通過高通量表型分析技術(shù)研究了蛋白激發(fā)子AMEP對干旱脅迫下大豆幼苗生長的影響，包括大豆幼苗表型、光合參數(shù)、熒光參數(shù)等。形態(tài)表型檢測表明蛋白激發(fā)子AMEP可顯著緩解干旱對大豆幼苗生長的抑制，減輕干旱脅迫的損害。光合參數(shù)和熒光參數(shù)指標(biāo)檢測結(jié)果表明，蛋白激發(fā)子AMEP可以通過調(diào)節(jié)氣孔導(dǎo)度、細胞間CO濃度、蒸騰速率來提高大豆的凈光合速率，進而提升葉綠素含量、光能轉(zhuǎn)換潛力、電子傳遞效率、PSⅡ光化學(xué)效率，提高光合效率。由此可見，通過高通量表型分析技術(shù)，可實現(xiàn)對蛋白激發(fā)子AMEP提高大豆抗旱性進行快速準(zhǔn)確的鑒定。