內質網(wǎng)應激與病毒感染(綜述)

倪敏舒， 陳 麗， 鮑 熹， 惲君雯，3， 徐 悅， 馮 磊

(1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇省農業(yè)科學院動物免疫工程研究所，江蘇南京 210014； 3.揚州大學，江蘇揚州 225009)

1 UPR反應通路介紹

未折疊蛋白反應(UPR)是一種細胞適應性反應，用以恢復內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)以應對內質網(wǎng)應激。通過上調分子伴侶免疫球蛋白重鏈(BIP)結合蛋白以促進蛋白質折疊，抑制蛋白質合成，增強內質網(wǎng)相關降解(ERAD)，消除錯誤折疊和未折疊蛋白質。

BIP又被稱為葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)，是熱休克蛋白家族的一員。BIP是UPR反應的標志性分子，靜息狀態(tài)時與3個近端的UPR傳感分子結合且抑制其活性。3個UPR傳感分子分別為激活轉錄因子6(ATF6)、RNA-依賴的蛋白激酶樣ER駐留激酶(PERK)和Ⅰ型ER轉膜蛋白激酶(IRE1)。

當未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白在內質網(wǎng)中堆積時，BIP被錯誤折疊或未折疊蛋白隔離，斷開與UPR傳感器的連接，相應激活3條反應通路。BIP在細胞中不僅可作為一種伴侶蛋白，促進蛋白的折疊或組裝，在應激反應初期，還可作為檢測未折疊或錯誤折疊的病毒蛋白傳感分子。

1.1 ATF6通路

ATF6轉錄因子是堿性亮氨酸拉鏈蛋白ATF/cAMP反應元件結合蛋白家族的成員，是一種Ⅱ型內質網(wǎng)跨膜蛋白，其NH末端的DNA結合域面向胞漿，COOH末端位于內質網(wǎng)管腔內。ATF6與BIP斷開連接后，移位至高爾基體中，被site-1和site-2蛋白酶切割成活性轉錄因子。被蛋白酶水解釋放的氨基酸末端結構域移位至細胞核中，誘導編碼蛋白或折疊酶基因表達，如BIP、葡萄糖調節(jié)蛋白94和P58IPK。值得一提的是，ATF6通路的末端分子P58IPK是PERK的抑制劑，因此ATF6通路往往與PERK途徑聯(lián)合研究(圖1)。

1.2 PERK-eIF-2α通路

未折疊或錯誤折疊蛋白的積累激活了PERK通路，PERK在絲氨酸51處磷酸化，隨后磷酸化PERK磷酸化eIF-2α，eIF-2α的磷酸化進而誘導激活轉錄因子4(ATF4)的表達，ATF4是一種刺激C/EBP同源蛋白(CHOP)、生長停滯和DNA損傷誘導蛋白34(Gadd34)表達的轉錄因子，其本身也可增加蛋白質分泌，促進細胞存活。

CHOP，也稱為生長停滯和DNA損傷誘導蛋白153(GADD153)，是CCAAT/增強子結合蛋白的顯性負抑制因子。當在哺乳動物細胞中表達時，CHOP/GADD153促進凋亡。

Gadd34在DNA損傷、生長停滯等條件下表達。相關文獻表明，Gadd34是蛋白磷酸酶1的一個調節(jié)亞單位，通過羧基末端招募蛋白磷酸酶1。招募到的蛋白磷酸酶1可使eIF-2α去磷酸化，負反饋調節(jié)PERK通路，緩解內質網(wǎng)應激的翻譯抑制和應激條件的基因表達(圖1)。

12）腳手板操作面的端頭處綁兩道防護欄桿，建筑物頂部腳手架要高出屋面1.0m，高出部分要綁兩道護身欄，并立掛安全網(wǎng)。

1.3 IRE1-XBP-1通路

IRE1是一種在細胞質中含有ER羥氨基末端結構域、跨膜區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域和羧基末端核酸內切酶結構域的蛋白質。當超量的錯誤折疊蛋白質在內質網(wǎng)中堆積，與GRP78結合的IRE1單體釋放并二聚化和交叉磷酸化，會激活IRE1作為核酸內切酶的活性，從XBP-1 mRNA中切割去除26個核苷酸內含子，形成移碼轉錄本拼接的XBP-1(XBP-1s)。未剪接的XBP-1(XBP-1u)mRNA編碼UPR的抑制因子。XBPIs轉錄因子激活靶基因，如促進ER降解的α-甘露糖苷樣蛋白(EDEM)，該蛋白促進錯誤折疊蛋白的降解(圖1)。

2 內質網(wǎng)應激與自噬和凋亡之間的聯(lián)系

自噬是一個細胞主要的分解代謝過程，它將蛋白質、細胞質成分和細胞器碎片運送到溶酶體中進行降解循環(huán)。目前，已鑒定出30多個自噬相關基因(ATG)精心編碼自噬程序?，F(xiàn)已證明，PERK-eIF2α 在內質網(wǎng)應激中的自噬誘導中起關鍵作用，PERK途徑下游信號分子ATF4和CHOP在轉錄過程中上調出超過12個ATG基因。

在IRE1途徑中，依賴于腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的激活導致Bcl-2磷酸化，使Beclin-1(一種自噬調節(jié)蛋白)解離，進而激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)復合物和自噬。

在內質網(wǎng)應激下，所產生的ERAD主要是通過泛素-蛋白酶系統(tǒng)(UPS)降解被泛素化的未折疊或錯誤折疊的蛋白，而自噬也是一種非典型的ERAD途徑。一些因為形成聚合體或一些特殊結構不能被典型的ERAD機制降解的錯誤折疊蛋白質，可通過自噬高效的降解去除。如突變的A1-抗胰蛋白酶或錯誤折疊的促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)。

與內質網(wǎng)有著密切聯(lián)系的另一個細胞生理活動是凋亡，細胞為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制程序性死亡。凋亡是細胞面對內環(huán)境失調，能夠更好地適應環(huán)境所選擇的主動過程。在凋亡過程中，半胱氨酸蛋白酶家族扮演重要角色。通過半胱氨酸蛋白酶家族成員Caspase-8招募誘導死亡的刺激復合物(DISC)激活凋亡；或通過Caspase-9，在線粒體損傷后介導凋亡信號。當內質網(wǎng)應激長時間處于高度緊張狀態(tài)而無法緩解時，UPR反應也可最終調控細胞凋亡。因此，內質網(wǎng)應激也被認為是細胞死亡的另一個調控中心。IRE1可招募TRAF2，并反過來招募激活c-Jun N末端激酶(JNK)途徑的近端成分ASK。ASK和JNK的長期激活會導致細胞凋亡。內質網(wǎng)調控細胞凋亡的另一條路徑是誘導線粒體釋放細胞色素和激活Caspase-8途徑。Bcl-2/CB5蛋白是一種針對內質網(wǎng)的Bcl-2蛋白，能夠抑制內質網(wǎng)應激介導的細胞色素c釋放。網(wǎng)格蛋白家族中的RNT-Xs通過內質網(wǎng)與Bcl-2相互作用，可以降低Bcl-2和Bcl-XL在衣霉素誘導的細胞死亡中的抗凋亡活性(圖1)。

3 內質網(wǎng)應激和病毒感染

病毒在其感染過程中，合成大量病毒蛋白使內質網(wǎng)處于應激狀態(tài)。細胞為了維持自身穩(wěn)態(tài)，常常會啟動 UPR 介導的蛋白降解途徑(ERAD)及宿主細胞凋亡、自噬等調控機制，抑制或降解病毒蛋白的合成和堆積來維持細胞穩(wěn)態(tài)。與此同時，病毒則會通過反調控或利用UPR反應，為其在宿主體內復制增殖提供適宜的環(huán)境，最終成功復制。病毒感染引起的持續(xù)UPR和炎癥反應可能也是病毒疾病的重要病因之一。病毒誘發(fā)內質網(wǎng)應激過程中，會特異性調控UPR反應中的某一特定通路，使UPR反應能夠以有利于病毒復制；或者通過調控內質網(wǎng)應激所誘導的細胞自噬，緩解細胞自身壓力，讓細胞免于凋亡，最終實現(xiàn)持續(xù)感染。接下來將對幾種會誘發(fā)內質網(wǎng)應激的病毒作簡要概述。

3.1 RNA病毒

3.1.1 登革熱病毒(DENV) DENV在病毒感染的不同時期會誘發(fā)UPR反應的不同通路，在感染早期激活PERK通路，在感染中期激活IRE1通路，在感染后期激活ATF6通路。通過早期的PERK通路所帶來的蛋白質翻譯削弱而抑制病毒的復制，可隨后該通路被病毒迅速逆轉，確保蛋白質的翻譯水平，從而順利裝配病毒粒子。中期激活IRE1途徑，并且激活XBP-1的靶基因，如EDEM。這類靶基因有利于降解部分蛋白質緩解內質網(wǎng)壓力，使細胞免于凋亡，有利于病毒持續(xù)感染。XBP-1通路的激活是由ER相關的DENV糖蛋白(PRM、E和NS1)和較小的疏水性ER錨定病毒蛋白(NS2A、NS2B和NS4B)誘導的；并且DENV能夠抑制該通路的下游凋亡基因，提高細胞存活率，有利于病毒感染。DENV所介導的內質網(wǎng)應激和UPR會激活細胞自噬反應，在感染過程中PERK途徑上調了對維持高自噬水平有著重要作用的活性氧(ROS)，有利于產生成熟和具有感染性的病毒顆粒。而自噬的激活過程中，所形成的雙膜小泡為病毒復制提供平臺，最終使細胞內外的病毒載量提高，同時促進細胞脂質的氧化，為病毒提供三磷酸腺苷?？傊珼ENV所誘導的ERS可通過調控UPR和自噬反應，促進自身復制。

3.1.2 丙型肝炎病毒(HCV) HCV的基因組編碼2個包膜蛋白E1和E2，它們在內質網(wǎng)中成熟，形成非共價鍵結合的天然復合物和二硫鍵結合的聚集體。該病毒的非結構蛋白在核周區(qū)網(wǎng)狀的ER膜上形成核糖核蛋白復合體，在病毒基因組復制和肝細胞建立感染過程中起關鍵性作用。這種病毒蛋白給內質網(wǎng)帶來了巨大壓力，誘導內質網(wǎng)應激，隨后引起未折疊蛋白反應。HCV所誘導的UPR反應中，ATF6切割水平明顯增高，誘導了UPR的標志性分子GRP78。在UPR另外一條道路PERK中，病毒抑制eIF-2α的磷酸化，阻斷了該通路的翻譯抑制，是病毒蛋白正常表達。HCV復制改變了UPR信號通路的典型特征，延長病毒存活時間，從而有利于病毒自身的增殖。

3.1.3 豬流行性腹瀉病毒(PEDV) PEDV的結構蛋白S、M以及非結構蛋白ORF3，均可誘發(fā)內質網(wǎng)應激，并且誘導BIP升高。這些蛋白主要激活UPR信號通路中的PERK通路，使 PERK 和 eIF-2α 的磷酸化水平明顯增加。病毒對ATF6的蛋白酶切割水平和IRE1通路中XBP-1轉錄編碼的剪切作用卻無明顯影響。PEDV通過誘導內質網(wǎng)應激進一步刺激細胞自噬，從而導致細胞死亡。在感染PEDV的細胞中，使用特異性增強PERK信號通路激活的藥物Salubrinal處理能夠抑制病毒的復制，這也提示了內質網(wǎng)通過PERK途徑抑制病毒感染。關于PEDV是否可抵抗UPR的抑制作用，還需更加深入研究。

3.2 DNA病毒

3.2.1 乙型肝炎病毒(HBV) HBV可通過表達病毒調節(jié)蛋白X(HBx)，誘導內質網(wǎng)應激，激活未折疊蛋白反應(UPR)的IRE1-XBP-1通路?，F(xiàn)有研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原HBSAG是HBV誘導內質網(wǎng)應激的主要原因。XBP-1的靶基因EDEM與HBV的生命周期緊密相連，有趣的是，病毒并未抑制其靶基因的轉錄，而是刺激內質網(wǎng)相關降解(ERAD)途徑，上調、等相關降解基因。進而減少包膜蛋白數(shù)量，減輕內質網(wǎng)壓力，抑制因長時間內質網(wǎng)應激所帶來的細胞凋亡，從而促進病毒增殖，建立持續(xù)感染。在感染HBV小鼠中發(fā)現(xiàn)了磨玻璃肝細胞(GGH)現(xiàn)象。GGH的形成是由于內質網(wǎng)中表面抗原過多而導致細胞質均勻暗淡，最終呈現(xiàn)玻璃樣外觀。慢性HBV與肝癌細胞緊密相關，而GGH被證實是肝細胞癌的標志物，這些線索可能暗示由乙型肝炎病毒所誘發(fā)的肝癌細胞與內質網(wǎng)應激有某種內在聯(lián)系。

3.2.2 人巨細胞病毒(HCMV) HCMV誘發(fā)ERS，可調控3條UPR反應通路從而利于自身復制。HCMV誘導PERK和eIF-2α的磷酸化，有研究表明，在HCMV感染的細胞中，磷酸化的eIF-2α并未造成翻譯抑制。在ATF6通路中，HCMV會誘導ATF6糖基化，并轉位至高爾基體中，卻抑制其在高爾基體中的剪切，也就抑制了ATF6的轉錄活性，導致下游的BIP或GRP94的表達受阻。在IRE1通路中，HCMV感染刺激了XBP-1mRNA的剪接，然而在HCMV感染的細胞中未檢測到XBP-1靶基因EDEM。EDEM等蛋白的表達能夠抑制病毒復制，病毒通過抑制這類蛋白，觸發(fā)UPR反應，從而創(chuàng)造利于自身復制的條件。在HCMV感染過程中，病毒的US12家族基因可編碼1種離子通道的病毒蛋白US12，減少Ca在細胞內質網(wǎng)中的堆積，緩解內質網(wǎng)應激，使細胞免于持續(xù)的內質網(wǎng)應激而凋亡，從而促進細胞存活，延長病毒復制時間?？傊?，在HCMV感染期間，UPR被誘導，但以有利于病毒感染的方式進行修飾，抑制不利于病毒復制的作用，維持有利的作用。

3.2.3 偽狂犬病病毒(PRV) 在PRV感染的早期階段，BIP的表達增加，誘導了內質網(wǎng)應激。PK-15細胞在感染早期，BIP被上調，強化內質網(wǎng)中的蛋白質折疊功能，有利于病毒感染。隨后BIP表達被抑制，以免嚴重的內質網(wǎng)應激，而導致細胞凋亡，阻礙病毒的持續(xù)感染。對UPR 3個分支的檢測表明，IRE1-XBP-1通路在PRV感染過程中被激活，但抑制該通路的表達對病毒復制并無顯著影響，內在的復雜機制還未得到很好解釋。

3.2.4 豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) PCV2 ORF5蛋白定位于內質網(wǎng)，會誘發(fā)內質網(wǎng)腔發(fā)生擴張和腫脹，上調應激標志分子BIP和GRP94的蛋白水平，從而誘導內質網(wǎng)應激?，F(xiàn)有研究表明，PCV2激活PERK途徑，并且選擇性激活通路的下游因子，在用丹參素抑制了 eIF-2α 去磷酸化后，PCV2的復制也明顯被抑制。因此，PCV2可能通過eIF-2α的去磷酸化恢復細胞翻譯水平，加強病毒蛋白表達，有利于自身復制。?；切苋パ跄懰?TUDCA)本身可通過強化蛋白質折疊而緩解內質網(wǎng)應激，在使用TUDCA處理細胞后，PCV2的復制得到明顯加強。TUDCA配合PCV2衣殼蛋白的折疊裝配，與其本身的抗凋亡作用，也為PCV2的感染提供有利場所。

4 內質網(wǎng)應激與病毒感染導致的代謝綜合征

在細胞的生理活動中，內質網(wǎng)不僅作為蛋白質的折疊加工及分泌場所，在脂肪和葡萄糖代謝中也起著關鍵作用，許多代謝通道的傳感、信號機制存在于內質網(wǎng)膜上或結構域中。如負責調控脂質代謝的關鍵因子SREBPs，在正常狀態(tài)下附著在內質網(wǎng)膜上，當機體脂質水平較低時，便會移位至高爾基體，并被蛋白酶水解切割活化，轉移至細胞核內調控脂質基因，內質網(wǎng)通過這種途徑啟動膽固醇合成。通過這種途徑，內質網(wǎng)應激與多種病毒性肝炎密切關聯(lián)。在各種肝臟病毒所誘導的慢性內質網(wǎng)應激中，也會誘發(fā)脂質代謝的紊亂。

并且現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，內質網(wǎng)應激與糖尿病、動脈粥樣硬化也均有意想不到的聯(lián)系。正常狀態(tài)下，激活的胰島素受體磷酸化酪氨酸殘基上的近端信號分子，也稱胰島素受體底物(IRS-1)，與胞漿靶標相互作用發(fā)揮胰島素功能。在肥胖、遺傳、飲食不當?shù)惹闆r下，這種磷酸化被JNK關聯(lián)的IRS-1絲氨酸磷酸化通路抑制，而與肥胖相關的JNK激活機制與內質網(wǎng)應激有關。內質網(wǎng)應激通過IRE1通路，直接觸發(fā)JNK級聯(lián)反應。通過激活JNK家族，內質網(wǎng)參與了脂毒作用途徑，進而誘導代謝綜合征，其特征就是葡萄糖耐受和胰島素抵抗。

在研究肝炎病毒或其他一些誘發(fā)生命體代謝紊亂的相關病毒及代謝綜合征中，內質網(wǎng)的系列途徑也是未來非常重要的探究方向。

5 總結

細胞產生的內質網(wǎng)應激屬于細胞自身適應環(huán)境的機制，以不同的通路選擇解決各種因外部環(huán)境所造成的內質網(wǎng)壓力，其目的是為了讓細胞存活的概率提高。當這種應激狀態(tài)進一步破壞生物體整體生存利益時，細胞將會采用自噬或者凋亡的手段，維持生物體的穩(wěn)態(tài)。

當病毒侵入宿主細胞，大量的病毒蛋白翻譯合成，在內質網(wǎng)中堆積，或造成內質網(wǎng)Ca失衡時，均會造成內質網(wǎng)應激，不同病毒在面對內質網(wǎng)應激時的拮抗反應不同。一方面，有些病毒可控制內質網(wǎng)應激反應，誘導UPR從而利于病毒蛋白折疊和病毒復制，或者通過自噬使病毒能夠對機體造成持續(xù)感染。另一方面，UPR的結果，如減弱翻譯、ERAD和細胞凋亡，均限制病毒復制。在對抗UPR反應的過程中，不同的病毒有著不同的策略。單純皰疹病毒1型(HSV-1)觸發(fā)PERK的激活并介導 eIF-2α-p 去磷酸化，HSV-1的糖蛋白B(gB)通過與PERK相關來調節(jié)病毒蛋白的積累，以維持內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。HSV-1被發(fā)現(xiàn)能在病毒感染的早期有效解除UPR武裝，并在HSV-1復制的最后階段激活eIF2α-ATF4信號通路。然而，蜱傳腦炎病毒(TBEV)觸發(fā)了UPR的IRE1途徑和ATF6，IRE1抑制劑(3，5-二溴水楊醛)顯著限制了TBEV在Vero E6細胞中的復制。

對內質網(wǎng)應激的研究不僅是理解病毒對細胞感染的復雜機制，也是在目前對抗病毒、利用病毒的重要手段。在上述中的TBEV中，采用UPR抑制劑便可作為全新的治療策略來對抗病毒感染。在HIV蛋白酶抑制劑的研究過程中，藥物本身雖然可提高艾滋病患者的生存質量，也可造成脂質失調和動脈硬化，其關鍵原因便是藥物本身對內質網(wǎng)應激的激活。

深入研究內質網(wǎng)應激及隨后的UPR與細胞自噬、凋亡、代謝過程密切結合，能夠更加深入透徹地研究病毒，也為研究病毒和一些復雜的生理特征提供了全新的方向。在對抗病毒的過程中，UPR反應中的各個因子也可能是抑制病毒復制的有效靶點，針對這些靶點開發(fā)新的藥物或疫苗對減少病毒對人體或動物的侵害具有重大意義。