紀(jì)雨微 李梓嫣 鄧碩真 汪玉清

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/北京市設(shè)施蔬菜生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

番茄是世界上重要的蔬菜作物，也是我國(guó)各地普遍栽培的主要蔬菜品種。番茄細(xì)菌性潰瘍病(Bacterial canker of tomato)常稱作番茄潰瘍病，是由密執(zhí)安棒形桿菌(

Clavibacter

michiganesis

)引起的一種常見(jiàn)病害，該病害導(dǎo)致的產(chǎn)量損失最高可達(dá)80%以上。番茄潰瘍病最早于1909年在美國(guó)密西根州發(fā)生，隨后蔓延到世界上多個(gè)番茄種植地區(qū)，遍布于北美洲、歐洲、亞洲、非洲和大洋洲等五大洲的80多個(gè)國(guó)家。我國(guó)有關(guān)番茄潰瘍病的記載始于1954年，俞大紱等在大連某市場(chǎng)上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)有類似番茄潰瘍病癥狀的番茄果實(shí)，但是直到1985年劉泮華等才在北京成功分離并鑒定為潰瘍病菌。之后該病在我國(guó)迅速蔓延，目前中國(guó)大陸地區(qū)除了西藏和陜西等少數(shù)幾個(gè)省、市及自治區(qū)外其他省區(qū)及自治區(qū)均有報(bào)道。番茄潰瘍病的發(fā)生對(duì)我國(guó)的番茄生產(chǎn)帶來(lái)了很大的影響和經(jīng)濟(jì)損失，急需有效的防控措施改變目前日益嚴(yán)重的發(fā)展形勢(shì)。

目前為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)防治番茄潰瘍病的有效方法，目前采取的防治措施主要有化學(xué)防治和田間農(nóng)業(yè)管理防治。這些措施均局限于在一定程度上控制病害的發(fā)生與蔓延，不能有效地根治?？共∑贩N的應(yīng)用是防控番茄潰瘍病最簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和有效的途徑。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)鑒定到一些具有抗性的番茄野生種及來(lái)自它們的栽培種衍生系材料，但是至今還沒(méi)有帶有抗性的商業(yè)品種上市。遺傳學(xué)研究表明，番茄潰瘍病的抗性呈多基因位點(diǎn)控制的數(shù)量遺傳，但目前尚未有抗性位點(diǎn)或基因被克隆。因此需要繼續(xù)利用抗性種質(zhì)資源構(gòu)建遺傳分離群體進(jìn)行抗性遺傳研究，定位并克隆抗性基因。而建立穩(wěn)定又準(zhǔn)確的人工接種鑒定體系是篩選抗病種質(zhì)資源和遺傳群體交換單株以及進(jìn)行藥劑控制技術(shù)研究的前提。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的人工接種方法有噴霧法、剪頂法、真空滲透法和注射法。番茄潰瘍病是一種侵染維管束的系統(tǒng)性病害，最終會(huì)引起植株全株萎蔫死亡，因而人工接種植株發(fā)病后，植株死亡對(duì)于后續(xù)的性狀分析及留種后代觀察表型極為不利，尤其是在遺傳群體的交換單株鑒定過(guò)程中。因此，需要尋找1種既能區(qū)分抗感材料發(fā)病差異，又能在一定時(shí)期內(nèi)植株不會(huì)死亡的接種方式。本研究擬通過(guò)采用剪頂法、噴霧法、復(fù)葉柄注射法、莖頂端注射法和莖基部注射法這5種常見(jiàn)的人工接種方式，分析不同接種方式引起的發(fā)病率和死亡率，并比較病原菌在番茄抗感材料莖內(nèi)部的傳播規(guī)律，以期為番茄抗?jié)儾〔牧翔b定與篩選提供合適的人工接種方式。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

感病番茄：品種‘OH88119’、‘Ailsa Craig’(AC)和栽培番茄LA3172；抗病番茄：栽培番茄IBL2353和野生多毛番茄LA407。

供試菌株：

Clavibacter

michiganesis

病原菌GS12102菌株采集于甘肅省，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)羅來(lái)鑫老師提供，經(jīng)毒性檢測(cè)鑒定為具有高致病力毒性菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

1

.

2

.

1

接種體活化制備

所用材料均需滅菌。配制LB固體培養(yǎng)基，將菌株均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，然后置于28 ℃生化培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，約48～72 h長(zhǎng)出黃色菌層后收集。用無(wú)菌的1 mmol/L的MgSO溶液重懸至OD為0.5，備用。

1

.

2

.

2

5種人工接種方式

準(zhǔn)備濃度為3×10cfu/mL的菌懸液，每種接種方式設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)為20株。具體方法如下：

剪頂法：取長(zhǎng)勢(shì)均勻的2～3葉齡幼苗，將14 cm手術(shù)剪的前端蘸取菌懸液，在莖頂部新葉處將主莖頂部剪斷。

噴霧法：取長(zhǎng)勢(shì)均勻的4～5葉齡幼苗，噴霧接種前2～3 h對(duì)待接種植株進(jìn)行噴水。之后將菌懸液置于壓力噴壺中，對(duì)整體植株(包括葉片背面)噴霧接種。噴菌后，套袋保濕3～4 d。

莖基部注射法：取長(zhǎng)勢(shì)均勻的4～5葉齡幼苗，在莖基部2片子葉節(jié)之間用1 mL注射器對(duì)莖表面注射接種，每株大約接種200 μL。

莖頂端注射法：取長(zhǎng)勢(shì)均勻的4～5葉齡幼苗，在莖頂端生長(zhǎng)點(diǎn)與上部第1片真葉之間用1 mL注射器對(duì)莖表面注射接種, 每株大約接種200 μL。

復(fù)葉柄接種法：取長(zhǎng)勢(shì)均勻的4～5葉齡幼苗，在幼苗植株下部第2或第3葉序的復(fù)葉葉柄處用1 mL注射器注射接種，每株大約接種200 μL。

所有接種方式均采用1 mmol/L的MgSO溶液作為對(duì)照。接種后，將番茄幼苗放入人工培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)(相對(duì)濕度為90%～100%)48 h后，移至溫室正常管理。噴霧接種的植株移至溫室后繼續(xù)套袋2 d。溫室培養(yǎng)條件：白天25～28 ℃，晚上18～22 ℃，平均濕度80%左右。

1

.

2

.

3

接種后番茄體內(nèi)活菌的測(cè)量

接種后0 d，分別取距離注射孔向下3 cm和向上6 cm處莖部組織研磨作為初始濃度對(duì)照；接種后10 d莖基部注射植株取樣位置為注射孔向上6 cm處，莖頂端注射植株取樣位置為注射孔向下3 cm處；接種后20 d，莖基部注射植株取樣位置為注射孔向上12 cm處，莖頂端注射植株取樣位置為注射孔向下9 cm處。取樣前，用棉花球蘸取75%消毒酒精輕輕擦拭取樣部位，用滅菌刀片在取樣部位橫切莖部，每株取樣量0.05 g。樣品研磨液重懸后稀釋至10倍涂于平板，3～4 d后統(tǒng)計(jì)平板菌落數(shù)。之后將菌落濃度換算成log值進(jìn)行比較。

菌落濃度

1

.

2

.

4

接種后植株表型鑒定

接種3～4 d后開(kāi)始調(diào)查植株發(fā)病情況，參考Coaker等單個(gè)接種植株的病情分級(jí)方法調(diào)查葉片及植株整株發(fā)病情況。番茄潰瘍病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：將病情分為0～5級(jí)(0級(jí)為無(wú)癥狀，5級(jí)為整株復(fù)葉均萎蔫至死亡)，單株病情指數(shù)IDRS(Individual disease rating score)對(duì)應(yīng)病級(jí)分別為：IDRS為0級(jí)：葉片無(wú)病斑萎蔫，莖部注射孔無(wú)病斑或開(kāi)裂產(chǎn)生；IDRS為1級(jí)：0<葉片萎蔫比例≤0.2，注射孔無(wú)病斑或開(kāi)裂產(chǎn)生；IDRS為2級(jí)：0.2<葉片萎蔫比例≤0.4，注射孔有輕微程度開(kāi)裂；IDRS為3級(jí)：0.4<葉片萎蔫比例≤0.6，注射孔有明顯開(kāi)裂或菱形病斑；IDRS為4級(jí)：0.6<葉片萎蔫比例≤0.8，注射孔有較大開(kāi)裂或菱形病斑；IDRS為5級(jí)：0.8<葉片萎蔫比例≤1.0，整株復(fù)葉枯萎至死亡，莖部注射孔嚴(yán)重開(kāi)裂或折斷。

病情指數(shù)計(jì)算方法：

病情指數(shù)

1

.

2

.

5

數(shù)據(jù)分析采用Microsoft 2019和SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用ANOVA法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(

P

<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種接種方式下番茄植株潰瘍病的發(fā)病情況

采用5種接種方式對(duì)感病材料‘OH88119’接菌后，進(jìn)行植株病情調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同接種方式下番茄潰瘍病起始發(fā)病時(shí)間(接種后天數(shù))和病情嚴(yán)重程度不同(圖1和表1)。剪頂法接種后4 d多數(shù)植株開(kāi)始出現(xiàn)小葉萎蔫，10 d開(kāi)始有少量植株整株萎蔫死亡，至40 d時(shí)接種植株死亡率高達(dá)96.7%(圖1(a))。噴霧法接種方式下病原菌引起植株發(fā)病較慢，14 d開(kāi)始有少量植株復(fù)葉上1～2片小葉有萎蔫或邊緣焦枯癥狀，至30 d發(fā)病率僅為58.3%，40 d死株率僅為5.0%(圖1(b))。復(fù)葉柄接種方式下發(fā)病起始時(shí)間表現(xiàn)中等，病情指數(shù)和死株率均較低(圖1(c))。莖頂端注射接種方式下7 d開(kāi)始發(fā)病(圖1(d))，30 d時(shí)發(fā)病率為100.0%。莖基部注射接種時(shí)病原菌引起發(fā)病起始時(shí)間較早，5 d開(kāi)始有一些植株下部復(fù)葉萎蔫，注射孔變大；至30 d時(shí)全部發(fā)病，且病情指數(shù)(81.5)僅次于剪頂法，但是死株率遠(yuǎn)低于剪頂法(圖1(e))。

剪頂法和莖部注射接種法番茄潰瘍病發(fā)病率均高達(dá)100.0%，平均病情指數(shù)均在75.0以上，誘發(fā)發(fā)病效果顯著高于噴霧法和復(fù)葉柄注射法。但是剪頂法死亡率最高，在30 d時(shí)已達(dá)80.0%左右，40 d時(shí)接近于全部死亡，不利于后續(xù)的結(jié)構(gòu)或遺傳分析及留種。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，莖頂端注射和莖基部注射法比較適合于番茄潰瘍病的致病性評(píng)價(jià)。

2.2 莖部注射接種方式下潰瘍病病原菌在番茄內(nèi)部的傳播規(guī)律

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果以及前人對(duì)潰瘍病菌在番茄體內(nèi)沿木質(zhì)部向上運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)論，本研究繼續(xù)在番茄不同抗感材料上對(duì)莖頂端和莖基部注射接種法進(jìn)行了致病效果的比較。選取感病材料‘OH88119’和抗病材料LA407同時(shí)進(jìn)行2種方式接種，比較病情發(fā)展情況。10 d后莖基部注射方式下感病材料在距離注射點(diǎn)6 cm處內(nèi)部潰瘍病菌濃度已經(jīng)達(dá)到9.03，極顯著高于抗病材料；而20 d時(shí)在距離注射點(diǎn)12 cm處病原菌濃度高達(dá)9.28，極顯著高于抗病材料，說(shuō)明病原菌至少已經(jīng)向上傳播至12 cm處并且在此處有大量增殖(圖2(a))。莖頂端注射方式下病原菌沿維管束向下擴(kuò)散，10 d后在距離注射點(diǎn)更近的3 cm處活菌濃度與莖基部注射的6 cm處相似，抗病材料內(nèi)部活菌濃度低于原始注射濃度；20 d后距離注射點(diǎn)9 cm處感病材料內(nèi)部活菌濃度為8.14，低于莖基部注射后同樣時(shí)間更遠(yuǎn)距離12 cm處的濃度，而抗病材料則降至更低為5.53，表明病原菌沒(méi)有在此處增殖(圖2(b))。以上表明，莖基部注射方式下病原菌的傳播速度遠(yuǎn)高于莖頂端注射方式，莖基部注射方式更有利于番茄植株發(fā)病。

(a)剪頂法接種30 d后整株萎蔫死亡；(b)噴霧法接種40 d后下部葉片萎蔫；(c)復(fù)葉柄注射接種30 d后注射葉片和相鄰葉片萎蔫；(d)莖頂端注射法接種30 d后整株單側(cè)葉片萎蔫；(e) 莖基部注射法接種30 d后整株單側(cè)葉片萎蔫，下部葉片蔫黃脫落。

表1 不同接種方式下番茄潰瘍病發(fā)病情況
Table 1 The disease phenotype traits induced by different inoculation methods

接種方式Inoculation method接種后發(fā)病時(shí)間/dDays of diseaseemerging接種植株數(shù)/株No. ofinoculatedseedlings平均發(fā)病率/%Averageincidence 平均病情指數(shù)Averageindex平均死株率/%Averagedeath rate剪頂法Top-pruning460100.096.5 aA96.7噴霧法Spraying146058.334.3 dD5.0復(fù)葉柄注射法Complex leafstalk injection66090.047.3 cC8.3莖頂端注射法Stem top injection760100.077.7 bB35.0莖基部注射法Stem base injection560100.081.5 bB45.3

注：平均發(fā)病率和平均病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)時(shí)間為接種后30 d，平均死株率統(tǒng)計(jì)時(shí)間為接種后40 d。同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示0.05水平下差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平下差異顯著。

Note: The statistical time of average incidence and disease index were 30 days post inoculation; The statistical time of average death rate was 40 days post inoculation. Within the Average index column, different lowercase letters represent significant differences between two inoculation methods (<0.05), different capital letters represent very significant differences between two inoculation methods (<0.01).

(a)感病材料‘OH88119’和抗病材料LA407幼苗莖基部注射接種后10 d時(shí)距離接種點(diǎn)6 cm處和接種20 d后距離接種點(diǎn)12 cm處體內(nèi)活菌數(shù)量；(b)感病材料‘OH88119’和抗病材料LA407幼苗莖頂端注射接種后10 d距離接種點(diǎn)3 cm處和接種20 d后距離接種點(diǎn)9 cm處體內(nèi)活菌數(shù)量。**表示二者差異極顯著(P<0.01)。

2.3 莖基部注射法接種在番茄潰瘍病抗感材料上的致病情況

基于前兩部分的試驗(yàn)結(jié)果，可以得出：使用莖基部注射法進(jìn)行人工接種最適于番茄潰瘍病抗感材料的鑒定與篩選。接下來(lái)同時(shí)對(duì)3份感病材料和2份抗病材料進(jìn)行莖基部注射接種，觀測(cè)比較潰瘍病發(fā)病情況和體內(nèi)活菌生長(zhǎng)情況(表2)。接種后發(fā)現(xiàn)，3份感病材料起始發(fā)病時(shí)間均在第5～7天，均早于抗病材料的第10～12天；而且3份感病材料到30 d的發(fā)病率均到了100.0%，病情指數(shù)均在80.0左右；而2份抗病材料的病情指數(shù)在30.0左右，說(shuō)明此種接種方式能很好地區(qū)分抗感材料。

為了驗(yàn)證莖基部注射法同樣適用于遺傳群體的表型分析，我們對(duì)抗感親本構(gòu)建的F群體(179株)和雜合F株得到的F群體(748株)這2份遺傳群體使用莖基部注射法進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果表明，F(xiàn)群體中基因型與感病親本一致的純合單株(38株)接種后40 d時(shí)植株病級(jí)在2級(jí)以上表型感病的有38株，發(fā)病率達(dá)100.0%，整體病情指數(shù)為84.7；基因型與抗病親本一致的純合單株(44株)接種后病級(jí)在2級(jí)及以下表型為抗病的有41株，基因型與表型一致度為93.2%；在F群體的純合感病基因型(182株)中，整體病情指數(shù)為80.2，病級(jí)在2級(jí)以上的有180株，基因型與表型一致度為98.9%；F群體的純合抗病基因型178株，病情指數(shù)為32.6，與另外2份抗病材料病指無(wú)明顯差異。2份群體的基因型純合單株病級(jí)頻率分布結(jié)果見(jiàn)圖3。上述結(jié)果表明，莖基部注射法適用于番茄潰瘍病不同抗感材料及遺傳分離群體抗感單株的鑒定與篩選。

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)對(duì)番茄潰瘍病的抗性主要來(lái)源于4種野生種：

S.

pimpinellifolium

、

S.

peruvianum

、

S.

habrochaites

、

S.

parviflorum

及來(lái)源于它們的栽培種衍生系。在將野生抗源向栽培種導(dǎo)入過(guò)程中，建立穩(wěn)定的致病評(píng)價(jià)體系是篩選抗病種質(zhì)資源的前提。因此對(duì)材料人工接種進(jìn)行抗感表型鑒定是十分重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，研究者們嘗試了不同的人工接種方式以達(dá)到最好的鑒定區(qū)分效果。2005年羅來(lái)鑫等使用打頂(剪頂)法、剪葉法、莖上針刺法和浸根法等4種方式侵染番茄幼苗，其中打頂法接種后植株發(fā)病率達(dá)到87.5%～100.0%，病情指數(shù)在不同品種上的范圍為43.75～82.29；2018年史娜艷等通過(guò)莖上注射法、浸根法、剪頂法和拌土法來(lái)侵染番茄，發(fā)現(xiàn)剪頂法和莖上注射法接種效果最好，二者發(fā)病率均達(dá)到100.0%，病情指數(shù)分別為91.0和90.0。本試驗(yàn)也表明剪頂法接種后番茄潰瘍病發(fā)病率為100.0%，病情指數(shù)在30 d時(shí)達(dá)到96.5，與前人研究結(jié)果相似。但是，上述2個(gè)研究表型分析僅調(diào)查至接菌后14～21 d，當(dāng)本試驗(yàn)繼續(xù)觀察至30～40 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)剪頂法的植株死亡率高達(dá)96.7%，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的顯微結(jié)構(gòu)或遺傳分析及繁收種子。同時(shí)本試驗(yàn)使用莖部注射法群體發(fā)病率也高達(dá)100.0%，病情指數(shù)達(dá)到80.0左右，說(shuō)明致病效果并無(wú)異于剪頂法。因此，在保證致病效果的條件下，當(dāng)進(jìn)行抗病品種鑒定和篩選時(shí)需要更久時(shí)間(大于21 d)來(lái)觀測(cè)表型或繁收留種，相比于高死亡率的剪頂法莖部注射法更適用。

表2 莖基部注射接種方式下不同番茄材料潰瘍病發(fā)病情況
Table 2 The disease incidence of different tomato materials in the stem base injection method

材料名稱Line name接種后發(fā)病時(shí)間/dThe time ofdisease emerging群體數(shù)量/株No. of plantpopulation病情指數(shù)Diseaseindex感病材料‘OH88119’Susceptible ‘OH88119’56083.8感病材料LA3172Susceptible LA317266084.5感病材料‘Ailsa Craig’Susceptible ‘Ailsa Craig’76079.8F2群體中感病基因型純合株Homozygous individual with susceptible genotype in F2 populations53884.7F3群體中感病基因型純合株Homozygous individual with susceptible genotype in F3 populations518280.2抗病材料 IBL2353Resistant material IBL2353106031.8野生抗病材料LA407Wild resistant material LA407126029.7F2群體中抗病基因型純合株Homozygous individual with resistant genotype in F2 populations104435.5F3群體中抗病基因型純合株Homozygous individual with resistant genotype in F3 populations1017832.6

圖3 F2和F3群體內(nèi)基因型純合單株病級(jí)頻率分布圖Fig.3 Frequency distribution histogram on disease score of homozygous individuals in F2 and F3populations

以往研究認(rèn)為番茄潰瘍病菌在植株體內(nèi)是隨木質(zhì)部水流向上部傳播，本研究發(fā)現(xiàn)該菌在番茄體內(nèi)既可以沿維管束向莖的上部傳播，也可以通過(guò)維管束向莖的下部傳播，但是向下的擴(kuò)散速度顯著低于向上的擴(kuò)散速度。這種現(xiàn)象可能需要進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)研究，以確定潰瘍病菌是否進(jìn)入了韌皮部系統(tǒng)，并隨著韌皮部液流向下傳播。莖頂端注射接種方式可以達(dá)到較好的致病效果，但是結(jié)合內(nèi)部病原細(xì)菌的傳播速度及人工操作的便利性(莖頂端直徑細(xì)易折)考慮，采用莖基部子葉節(jié)處注射接種具有最佳效果。國(guó)外很多關(guān)于番茄潰瘍病的研究大多數(shù)采用了莖基部注射法，說(shuō)明這種方法致病效果真實(shí)可靠。而且本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，莖基部注射法群體發(fā)病率達(dá)到100.0%，感病材料病情指數(shù)達(dá)到80.0左右，抗病材料及群體病情指數(shù)在30.0左右；感病群體死亡率約45.0%，抗病群體死亡率很低，為3.0%～8.3%，表明這種方法可以很好地區(qū)分番茄植株對(duì)潰瘍病的抗感表型，并且能夠保存植株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)及留種。前人尚未有剪頂法、噴霧法、莖基部注射法、莖頂端注射法和復(fù)葉柄注射法這5種不同接種方式同時(shí)進(jìn)行詳盡比較試驗(yàn)的報(bào)道，本研究經(jīng)過(guò)大量植株的人工接種及致病效果分析，從這5種人工接種方式中篩選到莖基部注射的接種方式適用于對(duì)不同番茄材料及遺傳群體的潰瘍病抗性鑒定，結(jié)果具有新穎性，并且這種接種方式效果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，對(duì)日后篩選抗?jié)儾〉姆巡牧霞芭嘤剐云贩N具有積極意義。