響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取蒲公英多糖及其抗氧化性的研究

劉嘯宇, 王秀風(fēng), 后夢(mèng)情, 江思雨, 姚 坤, 2, 吳 蕭, 2

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院, 安徽宿州 234200）

蒲公英（Herba Taraxaci）是桔梗目菊科植物, 在一系列的藥食同源類植物中屬于多年生宿根型。在2000年時(shí)我國(guó)的蒲公英栽培種類就有70種[1], 分布相對(duì)較多的地區(qū)為我國(guó)的西南、西北區(qū)[2]。其中, 有27種蒲公英可以藥用, 藥用蒲公英組（Taraxacum officinale）主要應(yīng)用于藥用方面, 如蒙古蒲公英、熱河蒲公英等[3]。蒲公英中含有多種對(duì)人體有益的天然化學(xué)成分, 如蒲公英醇、胡蘿卜素類、植物甾醇類、黃酮類、果膠等。

多糖作為植物蒲公英的重要構(gòu)成組分, 在不同部位的多糖含量也是不一樣的, 有關(guān)研究表明, 同一株蒲公英不同部位的多糖含量為根＞花＞葉[4], 但根中所含的多糖大多屬于貯存性多糖, 而葉與花中的多糖功能性較強(qiáng)。多糖的提取方法也有很多種, 如熱水浸提法[5]、超聲波提取法[6]、微波提取法[7]等。其中, 超聲波提取分離的方法在中藥類植物成分的提取中應(yīng)用較為廣泛。試驗(yàn)旨在研究功能性多糖的抗氧化性, 以蒲公英葉為材料, 采用超聲波提取法, 通過(guò)單因素試驗(yàn), 再利用響應(yīng)面分析軟件確定蒲公英多糖超聲波提取的最佳試驗(yàn)工藝。由于蒲公英多糖具有抗突變、抗疲勞和提高免疫[8-9]等的重要作用, 而試驗(yàn)又旨在探索其抗氧化作用。因此, 利用在最佳工藝水平下提取的蒲公英多糖, 研究其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基（·OH）的清除效果, 探索其抗氧化活性, 以便為更好地開(kāi)發(fā)利用蒲公英多糖資源提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 儀器設(shè)備

HH-30B型多功能粉碎機(jī), 鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；722型可見(jiàn)分光光度計(jì), 上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器, 昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；JA5003N型電子天平, 上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋, 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑

干蒲公英葉, 購(gòu)自宿州市中藥房；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、5 %苯酚、DPPH（分析純）, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；無(wú)水乙醇（分析純）, 安徽安特食品股份有限公司提供；水楊酸（分析純）, 天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；硫酸亞鐵（分析純）, 上海展云化工有限公司提供；30%過(guò)氧化氫（分析純）, 西騰化工股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取50.00 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品放入燒杯中, 加適量蒸餾水溶解, 轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶并定容至刻度線, 配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的葡萄糖溶液待用。從已配制的葡萄糖溶液中分別吸取0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mL依次放入試管中, 并用蒸餾水補(bǔ)足使各試管中溶液達(dá)到2.0 mL, 采用硫酸-苯酚法測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度。記錄數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程, 其中橫坐標(biāo)是葡萄糖溶液質(zhì)量濃度, 縱坐標(biāo)是吸光度。

1.2.2 樣品液的制備

粉碎干蒲公英葉, 用80目篩過(guò)篩備用。稱取1.0 g的蒲公英粉置于錐形瓶中, 加入適量蒸餾水, 超聲提取, 提取液置于離心機(jī)中進(jìn)行離心取上清液, 即得到多糖樣品液。

1.2.3 蒲公英多糖得率的計(jì)算

多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[10], 公式如下：

式中：C——蒲公英多糖的質(zhì)量濃度, mg/mL；

F——多糖提取液的稀釋倍；

V——多糖溶液體積, mL；

m——稱取的蒲公英粉質(zhì)量, g。

1.2.4 蒲公英多糖提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考查超聲溫度（50, 55, 60, 65, 70℃）、提取時(shí)間（20, 30, 40, 50, 60 min）、超聲功率（70, 90, 110, 130, 150 W）、料液比（1∶30, 1∶35, 1∶40, 1∶45, 1∶50）對(duì)蒲公英多糖提取率的影響, 將每次得到的提取液進(jìn)行離心取上清液獲得蒲公英多糖的樣品液, 取適量的樣品液按上述1.2.3操作, 根據(jù)1.2.3中的公式計(jì)算多糖含量。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-benhnken設(shè)計(jì)法, 設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化分析, 并將4個(gè)因素的試驗(yàn)編碼為-1, 0, 1這3個(gè)水平, 試驗(yàn)的響應(yīng)值選擇蒲公英多糖的提取率（Y）。

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.6 蒲公英多糖抗氧化性的研究

（1）對(duì)DPPH自由基清除力的測(cè)定。參照李敏等人[11]的方法, 采用DPPH法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)1.2.5的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果, 并在此條件下提取蒲公英多糖, 將提取液的質(zhì)量濃度配制為1 mg/mL。首先把多糖提取液按比例稀釋成質(zhì)量濃度為1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5 mg/mL的一系列樣品液。接著配置DPPH溶液, 準(zhǔn)確稱量DPPH 7.00 mg, 用無(wú)水乙醇溶解, 在100 mL容量瓶中定容, 放置備用。分別吸取DPPH溶液2.0 mL于各試管中, 再加入1.5 mL不同質(zhì)量濃度的多糖提取液, 最后加0.5 mL蒸餾水, 搖勻, 置于暗處反應(yīng)30 min, 于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度。蒲公英多糖對(duì)DPPH自由基的清除率計(jì)算公式：

式中：A0——用蒸餾水代替多糖溶液的吸光度；

A1——用蒸餾水代替DPPH-乙醇溶液的吸光度；

A2——不同梯度多糖溶液的吸光度。

（2）對(duì)羥基自由基清除力的測(cè)定。參考付學(xué)鵬等人[12]的方法, 采用水楊酸比色法。根據(jù)1.2.5的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果, 并在此條件下提取蒲公英多糖, 將提取液的質(zhì)量濃度配制為1 mg/mL。再用蒸餾水將配制好的多糖提取液按比例稀釋為不同質(zhì)量濃度0.03, 0.06, 0.09, 0.12, 0.15 mg/mL的樣品溶液。在各試管中依次加入濃度8 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、8 mmol/L水楊酸溶液2.0 mL、不同質(zhì)量濃度的多糖提取液2.0 mL, 最后加入2.0 mL 8 mmol/L的H2O2溶液, 待各試管中溶液反應(yīng)10 min后, 于510 nm處測(cè)定吸光度。蒲公英多糖對(duì)羥基自由基清除率計(jì)算公式：

式中：A0——用蒸餾水代替多糖溶液所測(cè)吸光度；

A1——不同質(zhì)量濃度多糖提取液所測(cè)吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配置的不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 使用可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度, 以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo), 吸光度作為縱坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 蒲公英多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲溫度對(duì)蒲公英多糖得率的影響

超聲溫度對(duì)蒲公英多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)蒲公英多糖得率的影響

由圖2可知, 剛開(kāi)始蒲公英多糖得率隨超聲溫度升高而逐漸增大, 當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí), 多糖得率同樣達(dá)到最高值。而當(dāng)溫度大于60℃時(shí), 多糖得率又逐漸下降。這是因?yàn)楫?dāng)溫度過(guò)高時(shí), 空化作用減弱且過(guò)高的溫度也會(huì)影響多糖活性。因此, 多糖提取溫度應(yīng)選定60℃左右。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)蒲公英多糖得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)蒲公英多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)蒲公英多糖得率的影響

由圖3可知, 超聲時(shí)間為20～40 min時(shí), 蒲公英多糖得率逐漸升高, 在40 min時(shí)得率達(dá)到頂峰, 后期的蒲公英多糖得率隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降。這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的提取會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu), 造成多糖的損失, 從而影響多糖得率。因此, 蒲公英多糖提取超聲時(shí)間應(yīng)該控制在40 min左右。

2.2.3 超聲功率對(duì)蒲公英多糖得率的影響

超聲功率對(duì)蒲公英多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲功率對(duì)蒲公英多糖得率的影響

由圖4可知, 當(dāng)功率達(dá)到110 W時(shí), 多糖得率最大。伴隨著超聲功率的不斷升高, 多糖得率開(kāi)始不斷下降, 且趨勢(shì)非常明顯。這是因?yàn)樵谶^(guò)高的功率作用下多糖分子結(jié)構(gòu)遭到破壞, 造成溶液中多糖量的損失。因此, 超聲萃取蒲公英多糖時(shí)的超聲功率控制在110 W左右。

2.2.4 料液比對(duì)蒲公英多糖得率的影響

料液比對(duì)蒲公英多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)蒲公英多糖得率的影響

由圖5可知, 隨著料液比的增加蒲公英多糖得率先上升后下降, 以1∶45的料液比為轉(zhuǎn)折點(diǎn), 多糖得率開(kāi)始下降。當(dāng)料液比較小時(shí), 蒲公英粉不能在溶劑中充分溶解, 導(dǎo)致多糖得率值不大, 隨著料液比中溶劑量的增多, 樣品與其接觸就更充分, 多糖的溶出量增大, 從而使多糖得率增加。但過(guò)大的料液比會(huì)相應(yīng)的增加成本和時(shí)耗。因此, 料液比選擇在1∶45左右。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)模型建立與分析

根據(jù)四因素三水平設(shè)計(jì)的29組試驗(yàn), 得出試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。

Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值見(jiàn)表2。

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合, 得到二次多項(xiàng)式回歸模型方程為：

表2 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值

回歸模型方差表（ANOVA）見(jiàn)表3。

由表3可知, 決定系數(shù)（R2）為0.8009和調(diào)整后的決定系數(shù)（R2Adj）為0.6018, 這2個(gè)系數(shù)反映了實(shí)際測(cè)量值與預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性。而模型中的失擬項(xiàng)Prob＞F的值為0.4455, 大于0.05, 則表明此模型的擬合度良好, 完全可以采取模型方程取代試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)來(lái)對(duì)分析和預(yù)測(cè)試驗(yàn)值, 且一次項(xiàng)系數(shù)X1對(duì)于蒲公英多糖超聲提取的影響是極顯著, 而系數(shù)X2、X4僅為影響顯著。比較F值可以得出, 各單因素對(duì)蒲公英多糖得率的影響力強(qiáng)弱為超聲溫度＞超聲時(shí)間＞料液比＞超聲功率。

表3 回歸模型方差表（ANOVA）

2.3.2 響應(yīng)面交互作用的分析

（1）超聲溫度與其他因素間的交互作用。

超聲溫度和超聲時(shí)間的等高線和3D曲面圖見(jiàn)圖6, 超聲溫度和超聲功率的等高線和3D曲面圖見(jiàn)圖7, 超聲溫度和液料比的等高線和3D曲面圖見(jiàn)圖8。

圖6 超聲溫度和超聲時(shí)間的等高線和3D曲面圖

由圖6～圖8可知, 超聲溫度分別與超聲時(shí)間、超聲功率、料液比間兩兩作用對(duì)多糖得率的影響。在圖6中, 由于其3D曲面圖整體坡度較陡, 即代表超聲溫度與超聲時(shí)間相互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大。蒲公英多糖得率的最佳條件為超聲溫度55～65℃, 超聲時(shí)間35～45 min。而圖7、圖8中曲面圖較為平坦, 表明這兩對(duì)因素交互作用對(duì)多糖得率的影響沒(méi)有圖6顯著。

圖7 超聲溫度和超聲功率的等高線和3D曲面圖

圖8 超聲溫度和料液比的等高線和3D曲面圖

（2）超聲時(shí)間與超聲功率、料液比間的交互作用。

超聲時(shí)間和超聲功率的等高線和3D曲面圖見(jiàn)圖9, 超聲時(shí)間和液料比的等高線和3D曲面圖見(jiàn)圖10。

由圖9、圖10可知, 2組圖的3D曲面圖都是彎曲度較大的, 說(shuō)明超聲時(shí)間與超聲功率、料液比對(duì)多糖得率有一定程度影響。圖中多糖得率較大的點(diǎn)從時(shí)間上看在35～45 min, 其中一個(gè)超聲功率在106～122 W, 另一個(gè)的料液比在1∶39～1∶45。

圖9 超聲時(shí)間和超聲功率的等高線和3D曲面圖

圖10 超聲時(shí)間和料液比的等高線和3D曲面圖

（3）超聲功率與料液比間的交互作用。

超聲功率和料液比的等高線和3D曲面圖見(jiàn)圖11。

由圖11可知, 適宜提取蒲公英多糖的條件在超聲功率108～122 W、料液比為1∶39～1∶45。但由于這組圖中的3D曲面圖更接近于平面圖, 所以在多糖提取時(shí)超聲功率與料液比間的交互作用對(duì)其提取率影響不大。

圖11 超聲功率和料液比的等高線和3D曲面圖

2.3.3 最優(yōu)工藝的調(diào)整和驗(yàn)證

根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件中的模型得到4個(gè)變量的最優(yōu)值, 分別是超聲溫度63.97℃, 超聲時(shí)間41.13 min, 超聲功率115.16 W, 料液比1∶43.21（g∶mL）, 該模型預(yù)測(cè)在最優(yōu)條件下蒲公英多糖得率為2.47 %。為驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化得出的試驗(yàn)方法是否可行, 對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行調(diào)整, 在調(diào)整后的最優(yōu)條件下提取。

試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

同樣, 把超聲波清洗器調(diào)到最優(yōu)水平, 3次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行提取, 測(cè)定求出多糖得率, 結(jié)果表明在最優(yōu)條件下多糖得率為2.32%, 與預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)較為接近, 可以驗(yàn)證模型的可行性。

2.4 蒲公英多糖抗氧化性研究結(jié)果

2.4.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

以多糖的不同質(zhì)量濃度梯度為橫坐標(biāo), 于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算清除率。

不同多糖質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基的清除能力見(jiàn)圖12。

圖12 不同多糖質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖12可知, 蒲公英多糖對(duì)DPPH自由基具有明顯的清除效果, 并且其清除能力隨多糖質(zhì)量濃度增大而上升, 當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.4 mg/mL時(shí), 清除率已達(dá)到82.43%清晰的表明多糖有較好的抗氧化性。

2.4.2 對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定

以多糖的不同質(zhì)量濃度梯度為橫坐標(biāo), 于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算清除率。

不同多糖質(zhì)量濃度對(duì)羥基自由基的清除能力見(jiàn)圖13。

圖13 不同多糖質(zhì)量濃度對(duì)羥基自由基的清除能力

由圖13可知, 蒲公英多糖的質(zhì)量濃度與其對(duì)羥自由基的清除力呈正相關(guān), 隨多糖質(zhì)量濃度的上升, 清除效果明顯增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為4.5 mg/mL時(shí), 清除率為43.79%；在4.5～5.0 mg/mL時(shí), 多糖對(duì)羥自由基的清除率上升不明顯, 基本趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用Box-behnken Design（BBD）優(yōu)化超聲波提取蒲公英多糖的工藝條件, 結(jié)果表明多糖得率在超聲溫度63.97℃, 超聲時(shí)間41.13 min, 超聲功率115.16 W, 料液比1∶43.21（g∶mL）的條件下提取最佳, 多糖提取率達(dá)到2.47%。而在實(shí)際操作中, 對(duì)響應(yīng)面軟件給出的最優(yōu)條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整, 在超聲溫度64℃, 超聲時(shí)間41 min, 超聲功率115 W, 料液比1∶43（g∶mL）下, 多糖得率為2.32%與預(yù)測(cè)值接近。

通過(guò)多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除率反映其顯著的抗氧化能力, 在多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.4 mg/mL時(shí), 對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到82.43%；當(dāng)質(zhì)量濃度為4.5 mg/mL時(shí), 清除率為43.79%。從數(shù)據(jù)中可以明顯看出, 蒲公英多糖所具有的抗氧化性, 對(duì)于開(kāi)發(fā)利用蒲公英葉資源提供參考。但試驗(yàn)在多糖提取時(shí)缺少蒲公英多糖的分離純化步驟, 僅進(jìn)行了多糖的粗提取, 并且沒(méi)有根據(jù)蒲公英的成長(zhǎng)階段、生產(chǎn)地點(diǎn)等方面分類進(jìn)行精細(xì)研究, 還需進(jìn)一步研究。