田凱兵，王亮，馬駿鵬，王科，張俊廷，吳震

脊索瘤是一種起源于人胚胎殘余組織的惡性腫瘤，其年發(fā)病率為（0.080～0.089）/10萬，占骨腫瘤的1.8%～4.3%［1-3］。脊索瘤主要發(fā)生于顱底和骶尾部，對周圍骨質(zhì)有明顯的破壞作用，且常包繞周圍重要血管、神經(jīng)和其他重要結構，導致手術全切率非常低，且部分患者會出現(xiàn)嚴重術后并發(fā)癥［4-5］。盡管近年來治療脊索瘤的手術和放療技術明顯提高，但腫瘤藥物研究相對落后，而較低的手術全切率、較高的術后并發(fā)癥發(fā)生率和腫瘤復發(fā)率仍困擾著患者和臨床醫(yī)生［6-8］。針對脊索瘤進展、侵襲等生物學行為的機制進行深入研究，有助于改進其治療方法，對改善患者預后、延緩腫瘤復發(fā)具有重要意義。

近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的表觀遺傳、轉錄、翻譯及翻譯后水平被廣泛研究，其可借助蛋白質(zhì)與microRNA網(wǎng)絡實現(xiàn)多種細胞功能的調(diào)控，如染色質(zhì)重塑、轉錄及轉錄后調(diào)控、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞核亞結構形成、干細胞多能性、體細胞重編程、發(fā)育調(diào)控等［9-11］。目前，lncRNA已用于其他疾病的臨床診治，但關于顱底脊索瘤lncRNA的研究報道較少，且未能建立以lncRNA為關鍵點的分子調(diào)控網(wǎng)絡，故深入研究顱底脊索瘤中l(wèi)ncRNA相關的調(diào)控機制對尋找新的診治方法意義重大。本研究從細胞層面和分子層面探討了顱底脊索瘤中l(wèi)ncRNA的促腫瘤作用及機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 篩選lncRNA

1.1.1 材料來源 選擇在首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心存放的3份脊索瘤組織樣本（取自行手術治療的原發(fā)經(jīng)典型脊索瘤患者）和3份脊索組織樣本（取自8～12周齡流產(chǎn)胎兒），樣本取材前均獲得家屬知情同意。所有組織樣本離體后立即凍存于液氮中。本研究通過首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（批號：KYSQ 2018-098-01）。

1.1.2 lncRNA測序及分析 將3份脊索瘤組織樣本和3份脊索組織樣本進行l(wèi)ncRNA測序，由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，采用去除核糖體RNA的方法構建鏈特異性文庫，庫檢合格后進行Illumina PE150測序，采用StringTie軟件對預處理后的Reads進行轉錄本拼接，經(jīng)過轉錄本外顯子個數(shù)、轉錄本外顯子長度、轉錄本抑制注釋、轉錄本表達量、編碼潛能5個篩選步驟后獲取lncRNA集。應用cuffdiff軟件進行差異表達基因分析，得到差異表達轉錄本，以q＜0.05為閾值篩選差異表達顯著的lncRNA。應用NONCODE（http://www.noncode.org）和lncRNAdb（http://www.lncrnadb.org/）數(shù)據(jù)庫對差異表達顯著的lncRNA進行功能預測，篩選出與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切的lncRNA。

1.2 細胞實驗

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用筆者所在課題組自行培育的顱底脊索瘤細胞系HBC-2（專利號：ZL201210052961.8）進行細胞實驗，將IMDM（美國，Thermo Fisher Scientific，21056023）和RPMI1640（美國，Thermo Fisher Scientific，A1049101）作為基礎培養(yǎng)基（4∶1），培養(yǎng)基中加入1×NEAA（美國，Thermo Fisher Scientific，11130077）、1×青鏈霉素（美國，Thermo Fisher Scientific，15070063）和10%胎牛血清（美國，Thermo Fisher Scientific，10099），37 ℃溫箱培養(yǎng)，約3 d傳代1次。

1.2.2 細胞轉染 FAM230B敲降組采用si-FAM230B進行細胞轉染，對照1組采用si-FNC進行細胞轉染，AC079630.2敲降組采用si-AC079630.2進行細胞轉染，對照2組采用si-ANC進行細胞轉染。根據(jù)本研究篩選出的兩個lncRNA序列設計、構建siRNA對脊索瘤細胞系HBC-2的瞬轉干擾株，引物和siRNA均由上海吉瑪基因公司設計，siRNA設計如下：si-FAM230B（5′-AAGAAAAAU CAA AAU CAG GGA-3′），陰性對照si-FNC（5′-CAG AGA GGA GGA AAG GAG AUU-3′）［12］；si-AC079630.2（5′-GCU AAU CAU UCU CUC UGG A -3′），陰性對照si-ANC（5′-ATC TCG TCC ATA TGA GTC T-3′）。引物設計如下：FAM230B上游引物：5′-GGG GTA CCA GCA GTT GGA CCT CAC AGT GT-3′，下游引物：5′-CGG GAT CCT GTG GGT CAT TTC TTT ATT ATT TT-3′［12］；AC079630.2上游引物：5′-ACT TTG GAC AGC TGC AAC AAC -3′，下游引物：5′-ACT CAG GAT ATG GAG TTG CGA -3′；GAPDH上游引物：5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′，下游引物：5′- GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。

采用siRNA（中國，上海吉瑪基因公司）進行細胞轉染，轉染試劑為siRNA MATETM（中國，上海吉瑪基因公司，G04003），轉染前24 h將生長狀態(tài)良好的貼壁細胞種植于六孔板，約為6×104/孔，無抗生素培養(yǎng)基2 ml/孔。轉染前將6 pmol siRNA加入200 μl Opti-MEM培養(yǎng)基（美國，Thermo Fisher Scientific，31985062），混勻后室溫放置5 min。取15 μl siRNA MATETM加入上述培養(yǎng)基，充分混勻，室溫放置10 min。將siRNA血清加入六孔板并做好標記，原條件培養(yǎng)48 h。

1.2.3 采用實時熒光定量PCR檢測lncRNA敲降率 將轉染好的細胞加入1 ml TRIzol（美國，Thermo Fisher Scientific，15596026）進行RNA提取，使用帶有gDNA Erase的反轉錄試劑盒（日本，Takara，RR047A）進行反轉錄，配制溶液后置于PCR擴增儀，去除組織DNA并進行反轉錄。使用實時熒光定量PCR試劑盒（日本，Takara，RR820L）進行實時熒光定量PCR。靶片段在20 μl系統(tǒng)中擴增。反應過程如下：95 ℃ 30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。計算ΔCT值及敲降率，ΔCT=目的基因CT值-對照基因CT值，敲降率=1-2-ΔCT目的基因/2-ΔCT內(nèi)參基因。實驗重復3次，敲降率≥50%定義為轉染合格。

1.2.4 采用CCK-8法檢測細胞增殖能力 應用CCK-8試劑盒（美國，Abbkine，KTC011001）檢測細胞增殖能力，將細胞接種于96孔板培養(yǎng)，轉染完成后更換含有10% CCK-8的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度，計算細胞活性，細胞活性=（細胞OD值-培養(yǎng)基OD值）/（0 h細胞OD值-0 h培養(yǎng)基OD值）。實驗重復3次。

1.2.5 采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率 應用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I試劑盒（美國，BD Biosciences，559763）檢測細胞凋亡率。將轉染完成的細胞用胰酶消化、離心（250×g）3 min，DPBS洗3次，進行細胞計數(shù)并離心（250×g）3 min，加入1×Binging Buffer并將細胞稀釋為1×106個/ml，取100 μl置于流式管，分別加入5 μl PE Annexin V和5 μl 7-AAD，輕輕混勻后避光室溫反應15 min，加入400 μl 1×Binging Buffer，1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.3 臨床研究

1.3.1 研究對象 選擇2005—2014年在首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術治療的原發(fā)顱底脊索瘤患者83例。納入標準：（1）經(jīng)病理檢查證實為脊索瘤；（2）臨床資料完整。排除標準：（1）合并顱內(nèi)外其他危及生命的嚴重疾??；（2）合并其他部位腫瘤；（3）伴有認知、心理及精神障礙。

1.3.2 研究方法 收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、術前KPS評分、FAM230B水平、腫瘤體積、腫瘤分型、腫瘤分期、腫瘤分隔情況、腫瘤血供情況、腫瘤質(zhì)地、腫瘤切除程度、病理分型。磁共振成像檢查結果由兩位具備5年以上顱底腫瘤診斷經(jīng)驗的放射科醫(yī)生進行評估，計算腫瘤體積，腫瘤分型包括骨侵襲性腫瘤（侵犯周圍骨）和非骨侵襲性腫瘤，腫瘤分期包括硬膜破壞和無硬膜破壞，腫瘤分隔情況包括瘤內(nèi)無纖維分隔和瘤內(nèi)有纖維分隔，腫瘤血供情況分為豐富和不豐富，腫瘤質(zhì)地分為質(zhì)軟和質(zhì)硬（質(zhì)硬包括軟韌不均成分的腫瘤），腫瘤切除程度包括侵襲性切除（切除程度＞90%）和非侵襲性切除（切除程度≤90%）。組織學標本由至少兩名有5年以上脊索瘤分析經(jīng)驗的病理學醫(yī)師觀察，根據(jù)國際癌癥研究機構的脊索瘤病理分型，包括經(jīng)典型、軟骨樣型和未分化型［13］，本研究無未分化型。主要隨訪方式為門診隨訪，不能門診隨訪的患者采用電話隨訪，記錄患者術后腫瘤進展情況。術后腫瘤進展定義為殘余腫瘤再長或腫瘤復發(fā)。

1.4 lncRNA與蛋白關系的研究 應用AnnoLnc數(shù)據(jù)庫（http://annolnc.cbi.pku.edu.cn/）篩選與FAM230B相互作用的蛋白。RNA pull-down實驗中預先制備細胞裂解液并測定蛋白濃度，設置無探針組、實驗組（應用轉錄自FAM230B基因的lncRNA干擾）、陽性對照組（未經(jīng)處理的HBC-2細胞裂解液）和陰性對照組（應用試劑盒中不能與蛋白結合的RNA作為陰性對照），應用Pierce?磁性RNA-蛋白Pull-Down試劑盒（美國，Thermo Fisher Scientific，20164）進行磁珠與生物素標記探針結合、探針與RNA雜交、RNA與蛋白結合復合物洗脫，最后應用Western blot法檢測結合蛋白表達情況。Western blot法步驟如下：應用細胞裂解液（中國，上海碧云天生物技術有限公司，P0013）裂解細胞，離心取上清液，采用BCA試劑（中國，碧云天，P0012）測定蛋白濃度，配置分離膠和濃縮膠，經(jīng)過上樣、電泳、濕轉、封閉、一抗（英國，Abcam，ab32199/ab38449/ab8245）孵育、二抗（中國，北京全式金生物技術有限公司，HS201-01/HS101-01）孵育，最后應用immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrote試劑盒（德國，Merckmillipore，WBKLS0500）進行顯色。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展的影響因素分析采用單因素及多因素Cox回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA篩選結果 lncRNA測序結果顯示，篩選后獲取2 153個lncRNA集，包括差異表達的lncRNA 169個，其中顯著高表達lncRNA 11個、顯著低表達lncRNA 4個，見圖1～2。功能測序結果顯示，共兩個lncRNA（FAM230B和ACO79630.2）與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。

圖1 差異表達基因維恩圖Figure 1 Plot venn diagram of differentially expressed genes

圖2 火山圖Figure 2 Volcano map

2.2 細胞實驗結果 FAM230B敲降組FAM230B敲降率為90%，AC079630.2敲降組AC079630.2敲降率為87%。培養(yǎng)24、48、72 h，F(xiàn)AM230B敲降組細胞活性低于對照1組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1；培養(yǎng)24、48、72 h，AC079630.2敲降組和對照2組細胞活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。FAM230B敲降組細胞凋亡率為（18.74±1.06）%，高于對照1組的（4.75±0.65）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=19.519，P＜0.01）；ACO79630.2敲降組細胞凋亡率為（5.22±0.90）%，與對照2組的（4.36±1.17）%比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.015，P=0.367）。

表1 FAM230B敲降組和對照1組不同時間細胞活性比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of cell activity between FAM230B knockdown group and control group 1 at different time points

表1 FAM230B敲降組和對照1組不同時間細胞活性比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of cell activity between FAM230B knockdown group and control group 1 at different time points

組別 培養(yǎng)24 h 培養(yǎng)48 h 培養(yǎng)72 h對照1組 1.166±0.040 1.731±0.036 2.385±0.060 FAM230B敲降組 1.586±0.058 2.465±0.036 3.963±0.016 t值 10.306 24.941 44.023 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表2 AC079630.2敲降組和對照2組不同時間細胞活性比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cell activity between AC079630.2 knockdown group and control group 1 at different time points

表2 AC079630.2敲降組和對照2組不同時間細胞活性比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cell activity between AC079630.2 knockdown group and control group 1 at different time points

組別 培養(yǎng)24 h 培養(yǎng)48 h 培養(yǎng)72 h對照2組 1.541±0.152 2.404±0.092 3.612±0.259 AC079630.2敲降組 1.509±0.133 2.494±0.294 3.548±0.260 t值 0.271 0.508 0.300 P值 0.800 0.638 0.779

2.3 臨床研究結果

2.3.1 原發(fā)顱底脊索瘤患者臨床資料及隨訪結果 83例患者中男40例，女43例；年齡11～62歲，平均39歲；術前KPS評分40～100分，平均80分；FAM230B水平8～18，平均13；腫瘤體積1.9～139.4 cm3，平均21.1 cm3；腫瘤分型：骨侵襲性腫瘤74例，非骨侵襲性腫瘤9例；腫瘤分期：硬膜破壞38例，無硬膜破壞45例；腫瘤分隔：瘤內(nèi)有纖維分隔53例，瘤內(nèi)無纖維分隔30例；腫瘤血供：豐富45例，不豐富38例；腫瘤質(zhì)地：質(zhì)軟35例，質(zhì)硬41例；腫瘤切除程度：侵襲性切除41例，非侵襲性切除42例；病理分型：經(jīng)典型67例，軟骨樣型16例；術后腫瘤進展52例。

2.3.2 原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展的影響因素分析 將臨床資料作為自變量，將原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展（賦值：否=0，是=1）作為因變量，進行單因素Cox回歸分析，結果顯示，術前KPS評分、FAM230B水平、腫瘤質(zhì)地及腫瘤切除程度是原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展的影響因素（P＜0.05），見表3。將術前KPS評分、FAM230B水平、腫瘤質(zhì)地及腫瘤切除程度作為自變量（賦值同表3），將原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展（賦值：否=0，是=1）作為因變量，進行多因素Cox回歸分析，結果顯示，F(xiàn)AM230B水平、腫瘤質(zhì)地和腫瘤切除程度是原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展的獨立影響因素（P＜0.05），見表4。

表3 原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展影響因素的單因素Cox回歸分析Table 3 Univariate Cox regression analysis of influencing factors of postoperative tumor progression in patients with primary skull base chordoma

表4 原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展影響因素的多因素Cox回歸分析Table 4 Multivariate Cox regression analysis of influencing factors of postoperative tumor progression in patients with primary skull base chordoma

2.4 lncRNA與蛋白關系的研究結果 與FAM230B相關的PTEN蛋白得分較高（96.025 1分，P=1.14e-3）。RNA pull-down實驗結果顯示，F(xiàn)AM230B可與PTEN蛋白直接結合，見圖3。Western blot法結果顯示，實驗組干擾前后PTEN蛋白條帶無明顯變化；與干擾前相比，實驗組干擾后PTEN通路關鍵蛋白磷酸化蛋白激酶B（phosphorated protein kinase B，p-AKT）條帶明顯減弱，提示FAM230B干擾后細胞中p-AKT表達降低，見圖4。

圖3 RNA pull-down實驗結果Figure 3 RNA pull-down results

圖4 實驗組干預前后p-AKT、PTEN蛋白表達的電泳圖Figure 4 Electrophoretogram of p-AKT and PTEN protein expression before and after intervention in the experimental group

3 討論

脊索瘤是一種少見的低度惡性腫瘤，好發(fā)于人體中軸骨，其中顱底脊索瘤約占所有脊索瘤的1/3［14］。脊索瘤呈浸潤性生長，對周圍骨質(zhì)破壞嚴重，術后易復發(fā)，患者遠期預后差，且目前尚無治療該病的有效藥物。為了明確脊索瘤發(fā)生發(fā)展的作用因子及機制，本研究著重探討了與顱底脊索瘤發(fā)生發(fā)展相關的lncRNA。

lncRNA是一類長度為200 bp以上、不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子［15］，其與DNA、RNA及蛋白復合物相互作用，在轉錄及轉錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［16］。研究表明，lncRNA在多種腫瘤組織中表達異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預后相關［17］；脊索瘤組織中高表達的lncRNA在促進腫瘤細胞增殖和侵襲、抑制腫瘤細胞凋亡及腫瘤生長過程中具有明顯作用［18-22］，其中NONHSAT114552高表達的患者持續(xù)無瘤生存期短于NONHSAT114552低表達的患者，提示NONHSAT114552與腫瘤進展相關［20］；XIST和KRT8P41高表達與患者生存率降低相關［20，22］。本研究結果證實，lncRNA FAM230B在顱底脊索瘤中具有促進腫瘤細胞增殖和抑制腫瘤細胞凋亡等作用。

lncRNA FAM230B位于22號染色體長臂，長度為3 464 bp，其在甲狀腺乳頭狀癌中呈高表達，并可通過與miR-378-3p競爭WNT5A的3'-UTR結合位點，抑制miR-378-3p作用，促進WNT5A表達，進而促進甲狀腺乳頭狀癌細胞轉化為間質(zhì)細胞［23］。一項胃癌研究結果表明，F(xiàn)AM230B可以競爭性地抑制miR27a-5p表達，間接促進TOP2A表達，從而促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲［13］。SONG等［24］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM230B可以促進骨肉瘤細胞增殖，其機制可能為：FAM230B通過抑制miR-203成熟，從而減弱成熟miR-203對腫瘤細胞增殖的抑制作用。CAO等［25］研究顯示，F(xiàn)AM230B在肺腺癌組織和肺腺癌患者血漿中呈高表達，提示FAM230B高表達對肺腺癌可能具有診斷價值。另外，有研究證實，F(xiàn)AM230B在急性白血病和高血壓引起的尿蛋白升高中發(fā)揮著重要作用［26-27］。

目前，F(xiàn)AM230B在顱底脊索瘤中的作用尚未見報道，細胞實驗結果顯示，F(xiàn)AM230B敲降組培養(yǎng)24、48、72 h細胞活力低于對照1組，細胞凋亡率高于對照1組，提示FAM230B可抑制顱底脊索瘤細胞增殖并促進顱底脊索瘤細胞凋亡，進而起到抗腫瘤作用；臨床試驗結果顯示，F(xiàn)AM230B水平升高是原發(fā)顱底脊索瘤患者術后腫瘤進展的危險因素。本研究進一步進行RNA pull-down實驗，結果證實FAM230B可與PTEN蛋白直接結合，并可抑制PTEN蛋白的下游蛋白p-AKT的表達。PTEN蛋白與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，其主要通過抑制下游關鍵因子蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的磷酸化而發(fā)揮抑癌作用［28-29］。筆者所在課題組的前期研究結果顯示，PTEN蛋白低表達與脊索瘤的強侵襲性明顯相關［30］。另一項研究證實，PTEN蛋白表達水平與顱底脊索瘤質(zhì)地相關，PTEN低表達的顱底脊索瘤患者術后無腫瘤進展期明顯縮短［31］。LEE等［32］研究證實，PTEN缺乏的脊索瘤細胞增殖率升高，凋亡率降低，提示PTEN在抑制脊索瘤細胞增殖和促進脊索瘤細胞凋亡的過程中發(fā)揮了調(diào)控作用。結合本研究結果，推測顱底脊索瘤中高表達的FAM230B與PTEN蛋白結合，進而使PTEN蛋白的作用受到抑制，導致AKT磷酸化水平升高，進而促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，lncRNA FAM230B在顱底脊索瘤組織中呈高表達，其可與PTEN蛋白結合，導致AKT磷酸化水平升高，進而發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡的作用。

作者貢獻：田凱兵、王亮、吳震進行文章的構思與設計；田凱兵、王亮、馬駿鵬、王科、張俊廷、吳震進行研究的實施與可行性分析，結果分析與解釋；田凱兵、王亮、馬駿鵬、王科進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；田凱兵負責撰寫、修訂論文；吳震負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。