丁燦燦 朱浩 張安妮 何圓培 聶敏海 李適廷

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-2是轉化生長因子-β超家族成員之一，它可以通過與胞膜上的受體相結合，激活胞質中Smad1/5/9復合體磷酸化及其核轉運，促使靶基因轉錄，誘導骨細胞增殖、膠原分泌和骨形成等[1]。此外，BMP-2也可以激活MAPK通路(如：Erk1/2、p38和JNK)，調節(jié)細胞和組織功能[2]。在牙髓損傷后修復過程中，BMP-2參與調控成牙本質分化標志性基因牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)的表達，并通過Smad1/5通路促進人牙髓細胞(human dental pulp cells，hDPCs)成牙本質分化[3]。

連接蛋白(connexin，Cx)43由Gja1基因編碼，是機體表達最廣泛的跨膜連接蛋白，它構成縫隙連接通道(gap junction，GJ)或半通道(hemichannel，HC)，促使細胞間或胞內(nèi)外傳遞分子量小于1 200的物質，介導多種組織細胞的生理和病理活動[4]。生理狀態(tài)下，Cx43主要表達于牙髓組織內(nèi)的成牙本質細胞層；在牙齒損傷過程中，成牙本質細胞排列模式發(fā)生輕微改變伴隨Cx43的表達上調，并且在修復性牙本質形成過程中Cx43高表達于規(guī)則排列的成牙本質細胞樣細胞內(nèi)[5-6]，表明Cx43參與調控了牙髓組織的損傷和修復過程。研究發(fā)現(xiàn)，胞外Ca2+通過BMP-2介導Smad1/5/9和Erk1/2通路促進hDPSCs成牙本質分化，Cx43介導Erk1/2信號促進胞外Ca2+誘導的hDPSCs成牙本質分化，并且Cx43的功能實現(xiàn)可能與其介導的GJ有關[7-8]。

以上研究表明，BMP-2和Cx43在hDPCs成牙本質分化過程中均起到重要的調控作用，并且均可通過Erk1/2信號發(fā)揮生物學功能。然而，兩者在這一過程中是否相互調控還不明確。為此，本研究在hDPCs中過表達Cx43并施以BMP-2刺激，探討B(tài)MP-2和Cx43在hDPCs成牙本質分化過程中的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

pLVX-GJA1-EGFP-3FLAG慢病毒(lv-Cx43)和對照空病毒(mock)(上海生博)；DSPP抗體(Santa cruz公司，美國)；Cx43和osterix抗體(Abcam公司，英國)；p-Smad1/5/9和p-Erk1/2抗體(CST公司，美國)；rhBMP-2、PD98059(Sigma公司，美國)等。

1.2 hDPCs提取和培養(yǎng)

選擇14～28 歲患者因正畸或阻生拔除的完整、健康牙齒。收集樣本前，所有患者知情同意且實驗方案獲得西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)學院倫理委員會批準(批號：20180511001)。hDPCs參照文獻報道的方法培養(yǎng)細胞[9]。以5×104/mL密度接種于無菌塑料培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)液為α-MEM+10%FBS，培養(yǎng)條件為100%濕度、37 ℃、5%CO2孵箱。每3 d換液。實驗所用hDPCs為3～10 代。BMP-2刺激濃度為300 ng/mL，刺激時間為1 h[3]。

1.3 細胞轉染

將hDPCs接種培養(yǎng)皿的30%～40%，更換為含有l(wèi)v-Cx43和mock的培養(yǎng)液(滴度分別為40和20)感染細胞24 h，隨后更換為生長培養(yǎng)基孵育3 d，0.6 μg/mL嘌呤霉素篩選陽性細胞5 d，qRT-PCR和Western blot檢測轉染效率。

1.4 實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

hDPCs培養(yǎng)至接近融合，提取細胞內(nèi)總RNA。將0.5 μg RNA去除gDNA 污染，反轉錄cDNA，于-80 ℃冰箱保存、備用。qRT-PCR反應按照產(chǎn)品說明書使用(Takara公司)。應用PRISM?7500 Real-time PCR System(ABI，美國)進行擴增反應。每一樣品做3 個復孔，取其平均值。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.5 蛋白質印跡法(Western blot)

提取細胞總蛋白，BSA法檢測蛋白質濃度。取等量蛋白裂解液(50～100 μg)進行SDS-PAGE電泳、轉膜和封閉；分別加入p-Smad1/5/9(1∶1 000)、p-Erk1/2(1∶1 000)和osterix(1∶500)一抗4 ℃過夜，TBST洗膜，浸入二抗稀釋液，37 ℃孵育2 h，Image quant Las 4000數(shù)字成像系統(tǒng)采集影像，以β-actin為內(nèi)參進行分析。蛋白條帶使用Image J軟件定量分析。

1.6 免疫熒光法(IF)

hDPCs接種于蓋玻片，4%多聚甲醛固定20 min，0.1% Triton X-100可滲透化處理15 min，1% BSA封閉1 h。隨后，細胞孵育一抗(DSPP 1∶10)，4 ℃過夜，TBST沖洗，孵育FITC熒光二抗(1∶300)1.5 h，細胞核DAPI 復染5 min。激光共聚焦顯微鏡(upright DM4000B，Leica,德國)觀察細胞熒光強度。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 過表達Cx43上調hDPCs內(nèi)Cx43表達

轉染mock和lv-Cx43的hDPCs培養(yǎng)7 d，細胞接近融合，形態(tài)呈梭形，鏡下呈綠色熒光(圖1A)；分別提取轉染后的hDPCs RNA和蛋白，qRT-PCR和WB檢測結果顯示，過表達Cx43顯著上調hDPCs內(nèi)Cx43 RNA(P<0.05)和蛋白水平(圖1B～C)。

圖1 hDPCs中分別轉染lv-Cx43和mock

2.2 過表達Cx43促進BMP-2誘導的hDPCs成牙本質分化

與mock組相比，BMP-2刺激hDPCs 1 h顯著上調hDPCs內(nèi)osterix、DSPP、DMP-1、ALP和OCN RNA水平；過表達Cx43明顯增強BMP-2對DSPP等的誘導作用(P<0.05)，特別是osterix RNA表達為單獨施加BMP-2刺激的2 倍，但僅過表達Cx43并未顯著上調hDPCs內(nèi)DSPP 等的表達水平(P>0.05)(圖2A)。同樣，BMP-2明顯上調hDPCs內(nèi)osterix蛋白水平，過表達Cx43增強hDPCs內(nèi)BMP-2誘導的osterix蛋白表達。定量分析顯示，其與BMP-2+mock組比存在顯著性差異(P<0.05)(圖2C)；與mock組相比，過表達Cx43上調了osterix蛋白表達，但無顯著性差異(圖2B和C)。IF結果顯示，DSPP表達于細胞質內(nèi)；與mock組相比，BMP-2增強hDPCs內(nèi)DSPP熒光強度，過表達Cx43促進BMP-2誘導的hDPCs內(nèi)DSPP表達(圖2D)。結果表明，BMP-2促進DSPP等的表達及hDPCs成牙本質分化；僅過表達Cx43不會上調hDPCs內(nèi)DSPP等表達水平，但卻增強BMP-2對hDPCs成牙本質分化的誘導作用。

圖2 過表達Cx43促進BMP-2誘導的hDPCs成牙本質分化

2.3 Cx43通過Erk1/2增強BMP-2誘導的hDPCs成牙本質分化

明確Cx43對BMP-2誘導hDPCs成牙本質分化的作用后，進一步探討Cx43發(fā)揮功能的途徑。前文已述，BMP-2與Cx43均可通過Erk1/2發(fā)揮生物學功能。由此推測：BMP-2與Cx43可能通過Erk1/2信號發(fā)生串聯(lián)，實現(xiàn)對hDPCs成牙本質分化的促進作用。研究顯示，在hDPCs中，BMP-2激活Smad1/5通路[3]。于是，分別檢測了Smad1/5/9和Erk1/2。結果顯示，BMP-2激活了hDPCs內(nèi)Smad1/5/9信號；然而，與mock組相比，Erk1/2磷酸化水平無明顯改變(圖3A)，提示BMP-2促進hDPCs成牙本質分化可能與Erk1/2無關聯(lián)；過表達Cx43顯著上調BMP-2刺激下Erk1/2磷酸化水平(P<0.05)，但對Smad1/5/9無明顯促進作用(P>0.05)(圖3A)。結果表明，Cx43促進hDPCs成牙本質分化可能是通過Erk1/2，而與BMP-2介導的Smad1/5/9無關。

為進一步確定Erk1/2的作用，在BMP-2誘導前施加10 μM PD98059(Erk1/2抑制劑)刺激1 h。結果顯示，與BMP-2+lv-Cx43組相比，抑制Erk1/2顯著下調osterix、DSPP、DMP-1、ALP和OCN RNA水平(P<0.05)(圖3B)，且明顯減弱osterix蛋白表達(圖3C～D)和DSPP熒光強度(圖3E)，表明Cx43通過Erk1/2促進BMP-2誘導hDPCs成牙本質分化。

圖3 Cx43通過Erk1/2促進BMP-2誘導hDPCs成牙本質分化

3 討 論

Cx43表達于牙髓中的成牙本質細胞內(nèi)。牙齒損傷過程中，Cx43表達水平上調[6]，表明Cx43參與調控牙齒的損傷后修復，但作用機制不明。本研究顯示，BMP-2激活hDPCs中Smad1/5/9信號，而不是Erk1/2；過表達Cx43不能上調DSPP等表達，但增強BMP-2誘導的hDPCs成牙本質分化，Cx43功能的實現(xiàn)與Erk1/2信號有關。

Runx2和osterix均為重要調節(jié)牙本質發(fā)生的轉錄因子[10-11]。項目前期研究發(fā)現(xiàn)，Runx2促進牙乳頭細胞向成牙本質細胞分化，但抑制成牙本質細胞終末成熟，導致牙本質發(fā)生異常[12]。Osterix能夠促進成牙本質細胞增殖和成熟，對牙本質發(fā)生不可或缺[13]；此外，BMP-2通過osterix誘導成牙本質細胞DSPP表達[14-15]。因此，本研究僅檢測了與BMP-2關系密切的osterix。

本研究發(fā)現(xiàn)，僅過表達Cx43未能上調DSPP等的表達，說明過量Cx43對hDPCs成牙本質分化無作用，但過表達Cx43卻能促進BMP-2的誘導作用，提示Cx43功能實現(xiàn)可能是通過間接作用。研究顯示，BMP-2可以通過Smad1/5促進hDPCs成牙本質分化[3]。本研究驗證了前人的結果，并檢測了Cx43對BMP-2介導的Smad1/5/9的影響。結果發(fā)現(xiàn)，過表達Cx43并未上調BMP-2介導的Smad1/5/9磷酸化水平，說明Cx43可能是通過其他途徑發(fā)揮作用。因此，檢測了Erk1/2信號的活性。結果顯示，過表達Cx43顯著上調了hDPCs中Erk1/2磷酸化水平。隨后，施加了PD98059刺激，發(fā)現(xiàn)抑制Erk1/2減弱Cx43上調的osterix和DSPP等表達水平，表明Cx43促進BMP-2誘導的hDPCs成牙本質分化與Erk1/2有一定的關聯(lián)。

然而，BMP-2并未上調hDPCs中Erk1/2的磷酸化水平，過表達Cx43又是如何通過Erk1/2促進BMP-2的誘導作用呢？Cx43主要通過形成縫隙通道在細胞間或胞內(nèi)外傳遞小分子物質而發(fā)揮作用。在hDPCs中，BMP-2刺激可能激活了細胞內(nèi)與Cx43相關的小分子物質，過表達Cx43上調其介導的通道活性，增加了細胞間的通透性，可能促進被BMP-2激活的小分子物質在細胞間傳遞，進而激活Erk1/2信號并促進hDPCs成牙本質分化，而跟BMP-2介導的Smad1/5/9可能不存在必然聯(lián)系。因此，Cx43在hDPCs成牙本質分化中的機制還需進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2誘導hDPCs成牙本質分化與Smad1/5/9有關，非Erk1/2；過表達Cx43不能上調DSPP等表達，卻通過Erk1/2促進BMP-2誘導的hDPCs成牙本質分化。