邵駿菁，楊穎，馬大龍，呂志強，田景振，張曉平，4#（.山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 25055；2.濟寧醫(yī)學院，山東 濟寧 272067；.青島大學附屬醫(yī)院藥品調劑科，山東 青島 266000；4.山東中醫(yī)藥大學青島中醫(yī)藥科學院，山東 青島 2662）

宮頸癌主要由人乳頭瘤病毒引起，是一種會嚴重危害女性健康的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計，宮頸癌的發(fā)病率和病死率均居全球第4位，且近年來呈年輕化的趨勢[2]。中醫(yī)藥在我國腫瘤患者的防治中發(fā)揮著重要作用，調查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤患者的診療過程都有中醫(yī)藥的參與[3-4]。中藥治療具有多途徑、多靶點、副作用小等特點，目前已經成為臨床治療腫瘤不可或缺的手段之一[5-6]。

樺褐孔菌Inonotus obliquus為多孔菌科、褐臥孔菌屬的藥食兩用真菌，味微苦、性偏涼，以扶正為主，兼以祛邪，具有益氣養(yǎng)血、滋陰生津、疏肝解郁等作用[7-9]。動物實驗和長期臨床實踐表明，樺褐孔菌具有良好的抗腫瘤、降血糖和降血脂等藥理活性，且尚未發(fā)現(xiàn)其明顯的不良反應[10]。筆者前期已對樺褐孔菌的抗腫瘤譜和抗腫瘤活性部位進行了篩選，發(fā)現(xiàn)三萜類成分為其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效部位之一，且對人宮頸癌細胞HeLa具有良好的抑制效果，但作用機制尚不清晰[10]。此外還發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌提取物中總三萜含量較低?；诖?，本研究擬先對樺褐孔菌總三萜進行純化，再對純化后的總三萜進行抗腫瘤活性探討，為進一步闡明樺褐孔菌抗腫瘤作用的物質基礎及具體機制提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括UV-6000型紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），F(xiàn)A2014型十萬分之一電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），HF90型CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司），ULH100HG型熒光顯微鏡（日本Olmypus公司），Primaide型倒置顯微鏡（日本Hitachi公司），Epoch2T型酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2 主要藥品與試劑

樺褐孔菌藥材購自神農金康（湖南）原生態(tài)茶業(yè)有限責任公司，經山東中醫(yī)藥大學藥學院張曉平講師鑒定為真品。樺褐孔菌醇對照品（批號B50360，純度≥95%）和順鉑對照品（批號B24462，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；AB-8型大孔吸附樹脂和X-5型大孔吸附樹脂（批號分別為A875381、X875377）均購自上海麥克林生化科技有限公司；D101型大孔吸附樹脂（批號20200624）購自國藥集團化學試劑有限公司；MTT試劑（批號EZ6789C126）購自德國BioFroxx公司；AnnexinⅤ-FITC流式凋亡檢測試劑盒（批號BMS500FI-100）購自美國Invitrogen公司；AO/EB試劑盒（批號BB-4132-100T）購自上海貝博生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）和二甲基亞砜（批號分別為21036449、EZ6789C15 0）均購自蘭杰柯科技有限公司。

1.3 細胞株

人宮頸癌細胞株HeLa購自上海啟達生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 樺褐孔菌總三萜粗提物的制備

經過前期正交實驗，優(yōu)化出樺褐孔菌總三萜的最佳提取工藝如下：取樺褐孔菌粉末適量，置圓底燒瓶中，加12倍量（mL/g，下同）95%乙醇加熱回流2次，每次80 min，合并濾液，回收乙醇至無醇味，冷凍干燥得到樺褐孔菌總三萜粗提物，提取率約為2.136%。

2.2 樺褐孔菌總三萜的含量測定

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取樺褐孔菌醇對照品，加無水乙醇配制成質量濃度為0.16 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取樺褐孔菌藥材粉末5 g，按照“2.1”項下方法提取，冷凍干燥至50 mL，即得。

2.2.3 檢測方法 精密量取“2.2.2”項下供試品溶液50 μL，置10 mL具塞試管中，100℃下水浴蒸干，加入0.2 mL新配制的香草醛-冰醋酸溶液（質量濃度0.05 g/mL）和0.8 mL高氯酸，搖勻，70℃下水浴保溫反應15 min，冷卻至室溫，加乙酸乙酯定容至5 mL，并利用紫外-可見分光光度計檢測其在550 nm波長處的吸光度。

2.2.4 方法學考察 按2020年版《中國藥典》（四部）“分析方法驗證指導原則”進行方法學考察。結果顯示，樺褐孔菌醇的回歸方程為Y＝0.058 9X-0.063 2（R2＝0.999 7）（式中Y為吸光度，X為待測物質量濃度），線性范圍為3.20～17.60 μg/mL；精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的RSD分別為0.71%、1.27%、0.89%（n＝6）；平均回收率為97.82%，RSD為2.35%（n＝6）?？疾旖Y果均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.2.5 樺褐孔菌總三萜粗提物的含量測定 精密稱取“2.1”項下樺褐孔菌總三萜粗提物粉末2 mg，用無水乙醇溶解并定容至10 mL，按“2.2.3”項下方法處理后測定吸光度，代入回歸方程計算質量濃度，再計算得樺褐孔菌總三萜粗提物中總三萜的含量為34.36%。

2.3 樺褐孔菌總三萜的純化

2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理 將大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，然后裝柱，用95%乙醇以5 mL/min的流速洗脫至洗脫液澄清，再用蒸餾水洗脫至無醇味即可。

2.3.2 大孔吸附樹脂種類的篩選 取預處理后的AB-8型、X-5型、D101型大孔吸附樹脂分為7組，分別為單用組、兩兩等比例混合的聯(lián)用組以及三者等比例混合的混用組，分別加至具塞錐形瓶中，各加入樺褐孔菌總三萜粗提物溶液20 mL（溶劑為水，質量濃度為2.0 mg/mL，總三萜含量約為0.687 mg/mL，下同），振蕩24 h（25℃、110 r/min，下同），過濾，取續(xù)濾液按“2.2.3”項下方法處理后測定吸光度，代入回歸方程計算質量濃度。另將過濾后的大孔吸附樹脂加至具塞錐形瓶中，加乙醇20 mL，振蕩24 h，按上述方法計算其中總三萜的質量濃度。按下列公式計算吸附量、吸附率和解析率（表1）：吸附量＝V（c0-ce）/m，吸附率＝（c0-ce）/c0×100%，解析量＝V1c1/m，解析率＝V1c1/[V（c0-ce）]×100%，式中c0、ce、c1分別為樺褐孔菌總三萜的加入質量濃度、平衡質量濃度、解析后質量濃度，V和V1分別為吸附液（樺褐孔菌總三萜粗提物溶液）及解析液（乙醇）體積，m為大孔吸附樹脂質量。結果顯示，AB-8型大孔吸附樹脂的吸附量和吸附率最高，解析率僅略低于X-5型大孔吸附樹脂。綜合考慮，最終選用AB-8型大孔吸附樹脂純化樺褐孔菌總三萜。

表1 不同類型大孔吸附樹脂對樺褐孔菌總三萜吸附、解析的影響

2.3.3 靜態(tài)吸附曲線的繪制 精密稱取預處理后的AB-8型大孔吸附樹脂5 g（濕質量，下同），置具塞錐形瓶中，加樺褐孔菌總三萜粗提物溶液20 mL，振蕩24 h進行吸附，每小時測定溶液中樺褐孔菌總三萜的含量，并計算吸附量和吸附率，繪制靜態(tài)吸附曲線（圖1）。圖1顯示，在吸附5 h后吸附量趨于平衡，最終吸附率為93.48%，表明AB-8型大孔吸附樹脂對樺褐孔菌總三萜具有較好的吸附性能，在吸附5 h時基本達到吸附飽和。

圖1 AB-8型大孔吸附樹脂對樺褐孔菌總三萜的靜態(tài)吸附曲線

2.3.4 動態(tài)吸附曲線的繪制 精密稱取預處理后的AB-8型大孔吸附樹脂25 g，平行7份，濕法裝柱（2.0 cm×30 cm，徑高比為2∶11），用2.0 mg/mL的樺褐孔菌總三萜粗提物溶液上樣，上樣速率為1.0 mL/min，每流出20 mL流出液測定1次樺褐孔菌總三萜的質量濃度，繪制動態(tài)吸附曲線（圖2）。圖2顯示，第7份流出液中樺褐孔菌總三萜質量濃度為0.063 75 mg/mL，接近初始上樣液質量濃度的1/10，即認為吸附飽和[11]，故選擇上樣體積為140 mL。

圖2 樺褐孔菌總三萜在AB-8型大孔吸附樹脂中的動態(tài)吸附曲線

2.3.5 上樣液質量濃度對動態(tài)吸附的影響 同“2.3.4”項下方法裝柱，上樣速率為1.0 mL/min，上樣體積為140 mL，考察不同質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的樺褐孔菌總三萜粗提物上樣溶液對吸附率的影響。結果顯示，上述上樣液的吸附率分別為98.61%、96.55%、95.63%、94.74%、89.38%、74.69%、65.82%，可見當樺褐孔菌粗提物溶液的質量濃度為0.5～2.0 mg/mL時，吸附率均大于90%，考慮到生產周期和成本，最終選擇上樣液質量濃度為2.0 mg/mL。

2.3.6 上樣流速對動態(tài)吸附的影響 同“2.3.4”項下方法裝柱，用2.0 mg/mL的樺褐孔菌總三萜粗提物溶液上樣，上樣體積為140 mL，考察不同上樣速率（1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min）對吸附率的影響。結果顯示，上述上樣速率下的吸附率分別為93.59%、90.52%、88.21%、84.68%，可見當上樣速率為1.0 mL/min時，吸附率最高，最終選擇上樣流速為1.0 mL/min。

2.3.7 洗脫劑體積分數(shù)對洗脫效果的影響 同“2.3.4”項下方法裝柱、上樣，吸附飽和后用200 mL的7種不同體積分數(shù)（20%、30%、40%、50%、60%、75%、95%）的乙醇進行洗脫，測定洗脫液中樺褐孔菌總三萜的質量濃度，按解析率公式計算洗脫率。結果顯示，上述體積分數(shù)乙醇洗脫液的洗脫率分別為15.27%、19.05%、33.40%、40.14%、57.77%、61.26%、98.16%，可見洗脫率和乙醇體積分數(shù)呈正相關。以體積分數(shù)＜50%的乙醇洗脫后經濃縮凍干得到的固體呈深褐色，可見雜質較多；體積分數(shù)為60%和70%的乙醇洗脫率較低；以體積分數(shù)為95%的乙醇洗脫后經濃縮凍干得到的固體呈淡黃色，且洗脫率最高。因此本實驗最終確定先用50%的乙醇進行洗脫，棄去非目標部分，然后用95%的乙醇進行洗脫，收集目標部分。

2.3.8 洗脫劑用量對洗脫效果的影響 同“2.3.4”項下方法裝柱、上樣，吸附飽和后先用50%的乙醇40 mL除雜，再用95%的乙醇以1.0 mL/min流速進行洗脫，每流出20 mL洗脫液測定1次洗脫率，考察20～240 mL的95%乙醇對洗脫率的影響。結果顯示，第1～12份洗脫液的洗脫率分別為39.94%、15.35%、13.88%、6.42%、6.19%、4.05%、3.33%、2.97%、1.24%、1.09%、0.73%、0.62%，可見第9～12份洗脫液的洗脫率很低，且差異不大，表明此時大孔吸附樹脂吸附的總三萜成分已被充分洗脫，故選擇洗脫劑用量為160 mL。

2.3.9 洗脫流速對洗脫效果的影響 同“2.3.4”項下方法裝柱、上樣，吸附飽和后先用50%的乙醇40 mL除雜，再用95%的乙醇160 mL以不同流速進行洗脫，考察1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min的流速對洗脫率的影響。結果顯示，上述流速下的洗脫率分別為84.67%、87.49%、92.29%、70.12%，可見當流速為3.0 mL/min時，洗脫率最高，故選擇流速為3.0 mL/min。

2.3.10 純化工藝驗證 稱取同一批樺褐孔菌總三萜粗提物3份，按照最佳純化工藝條件進行純化，即選用AB-8型大孔吸附樹脂，上樣液質量濃度為2.0 mg/mL，上樣體積為140 mL，上樣流速為1.0 mL/min；洗脫時先用50%的乙醇40 mL除雜，再用95%的乙醇160 mL洗脫，洗脫流速為3.0 mL/min，考察純化前后樺褐孔菌總三萜粗提物的質量和總三萜質量分數(shù)（表2）。表2顯示，與純化前相比，總三萜質量分數(shù)明顯升高，純化后總三萜質量分數(shù)的RSD為1.05%（n＝3），說明本純化工藝合理、可行。

表2 樺褐孔菌總三萜粗提物純化的驗證試驗結果

2.4 樺褐孔菌總三萜純化物的體外抗腫瘤活性研究

2.4.1 供試品溶液的制備 精密稱取樺褐孔菌總三萜純化物適量，置EP管中，加二甲基亞砜渦旋溶解，加RPMI1640細胞維持液稀釋至二甲基亞砜的體積分數(shù)為0.1%，渦旋混勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，質量濃度為1 mg/mL。

2.4.2 陽性對照藥物溶液的制備 精密稱取順鉑適量，置EP管中，按“2.4.1”項下方法制成陽性對照藥物溶液，質量濃度為0.4 mg/mL。

2.4.3 細胞增殖實驗 HeLa細胞經3次傳代后，用乙二胺四乙酸-0.25%胰酶消化至游離狀態(tài)，進行細胞計數(shù)，稀釋細胞液至1×106個/mL。將細胞接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)至細胞鋪滿孔80%時即可使用。實驗設置對照組、順鉑組和樺褐孔菌總三萜組。取上述供試品溶液和陽性對照藥物溶液，均二倍比稀釋制得8個梯度濃度，然后接種于細胞長至80%以上的96孔板中，培養(yǎng)48 h，每個濃度設6個復孔。采用MTT染色法測定490 nm波長處的光密度，計算得樺褐孔菌總三萜純化物和順鉑對HeLa細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為184.20、20.10 μg/mL，可見樺褐孔菌總三萜純化物對HeLa細胞具有一定的抑制作用。

2.4.4 細胞遷移實驗 實驗設置對照組、順鉑組和樺褐孔菌總三萜低、中、高劑量組，對照組細胞加入含2%胎牛血清和0.5%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，藥物組細胞加入含100、150、200 μg/mL供試品溶液（或20 μg/mL陽性對照藥物溶液）、2%胎牛血清和0.5%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，每個濃度設3個復孔，采用倒置顯微鏡分別記錄培養(yǎng)0 h和48 h的劃痕間距（圖3），使用Image J V1.53c軟件計算細胞遷移率，并使用GraphPad 8.0.2軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。結果顯示，對照組、順鉑組和樺褐孔菌總三萜低、中、高劑量組的細胞遷移率分別為（43.04±1.60）%、（12.64±0.40）%、（26.99±0.73）%、（16.32±0.34）%、（9.78±0.41）%，RSD分別為3.71%、3.17%、2.72%、2.07%、4.22%（n＝3），可見細胞遷移率隨著樺褐孔菌總三萜純化物質量濃度的升高而降低。與對照組相比，各藥物組的細胞遷移率均顯著降低（P＜0.01）。

圖3 樺褐孔菌總三萜純化物對HeLa細胞劃痕間距的影響（×40）

2.4.5 細胞凋亡實驗 （1）采用AnnexinⅤ-FITC流式凋亡檢測試劑盒進行檢測。按“2.4.4”項下分組、加藥，培養(yǎng)48 h，收集細胞，PBS清洗，重懸計數(shù)，參照AnnexinⅤ-FITC流式凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用流式細胞儀分析細胞早期、晚期凋亡率（表3、圖4）。與對照組相比，各藥物組細胞的晚期凋亡率均顯著升高（P＜0.01）。

圖4 樺褐孔菌總三萜純化物對HeLa細胞凋亡影響的流式細胞圖

（2）采用AO/EB試劑盒進行檢測。按“2.4.4”項下分組、加藥，培養(yǎng)48 h，收集細胞，PBS清洗，調整細胞在1×106個以內，參照AO/EB試劑盒說明書操作，采用熒光顯微鏡觀察染色結果（圖5，綠色為正?；罴毎蛟缙诘蛲黾毎?，橙紅色為晚期凋亡細胞），使用Image J V1.53c軟件進行熒光定量計數(shù)，計算細胞凋亡率（表3）。與對照組相比，各藥物組的細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 樺褐孔菌總三萜對HeLa細胞凋亡影響的熒光染色圖（×30）

表3 樺褐孔菌總三萜純化物對HeLa細胞凋亡率的影響

3 討論

目前樺褐孔菌總三萜的純化手段以大孔吸附樹脂純化為主[12]?？紤]到總三萜類成分極性較小，因此本實驗篩選了AB-8型、D101型、X-5型3種極性較小的大孔吸附樹脂。通過對其吸附和解析能力進行考察，最終選用AB-8型大孔吸附樹脂進行樺褐孔菌總三萜純化。經過單因素實驗考察，篩選出最佳純化工藝為：AB-8型大孔吸附樹脂，上樣液質量濃度為2.0 mg/mL，上樣體積為140 mL，上樣流速為1.0 mL/min；洗脫時先用50%的乙醇40 mL除雜，再用95%的乙醇160 mL洗脫，洗脫流速為3.0 mL/min。

筆者前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，三萜類成分是樺褐孔菌抗腫瘤的有效活性部位之一，對肝癌細胞HepG2、宮頸癌細胞HeLa、黑色素瘤細胞A375、胃癌細胞AGS、乳腺癌細胞T47D均具有良好的抑制效果，其中對HeLa細胞的抑制效果最優(yōu)。因此本實驗采用HeLa細胞作為體外實驗研究對象，觀察樺褐孔菌總三萜純化物的抗腫瘤活性。結果顯示，樺褐孔菌總三萜純化物可抑制HeLa細胞增殖和遷移，促進其凋亡，主要促進腫瘤細胞晚期凋亡。

綜上所述，本研究建立了樺褐孔菌總三萜提取物的純化工藝，其純化物可抑制HeLa細胞增殖和遷移，促進其凋亡。但是其誘導凋亡的具體機制尚不清楚，下一步仍需要深入研究。