張倩鴻，王紹軍，田瑩，王犖，毛俊霞，王許波，王慶志，常亞青，郝振林*

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.山東省漁業(yè)發(fā)展和資源養(yǎng)護(hù)總站，山東 濟(jì)南 250013；3.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023)

香螺NeptuneacumingiiCrosse隸屬于軟體動物門Mollusca腹足綱Gastropoda新腹足目Neogastropoda蛾螺科Buccinidae香螺屬Neptunea，是一種具有增養(yǎng)殖潛力的經(jīng)濟(jì)貝類。主要分布于中國、朝鮮和日本北部等海域[1]。香螺營養(yǎng)豐富、味道鮮美，市場需求量巨大[2]。目前，香螺主要依靠采捕野生資源，但近年來，隨著對香螺捕撈強(qiáng)度的增加及環(huán)境破壞壓力的增大，其資源量衰退嚴(yán)重，尤其是香螺大規(guī)模人工增養(yǎng)殖技術(shù)尚未突破，致使其資源量恢復(fù)難度較大。因此，開展香螺繁殖發(fā)育方面的研究，探明香螺的最適生長環(huán)境，對于盡快實現(xiàn)香螺的全人工增養(yǎng)殖具有重要的意義。

溶解氧(dissolved oxygen，DO)是非常重要的海水理化因子，其濃度大小對水產(chǎn)動物的行為、存活等相關(guān)生理生態(tài)指標(biāo)均會產(chǎn)生顯著影響[3]，因此，研究不同DO濃度下香螺生理生態(tài)指標(biāo)的變化規(guī)律，明確香螺的最適DO濃度范圍，對實現(xiàn)香螺全人工增養(yǎng)殖尤為重要。目前，國內(nèi)外對于香螺的研究報道較少，主要對香螺的肌肉營養(yǎng)成分[2]、胚胎發(fā)育過程[4]、遺傳多樣性[5]、DNA多態(tài)位點[6]，以及對香螺貝殼成分[7]和生殖系統(tǒng)[8-10]進(jìn)行了一些研究。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，香螺的最適養(yǎng)殖溫度為8～16 ℃。但關(guān)于不同DO濃度對香螺存活、行為等相關(guān)生理生態(tài)影響的研究鮮見報道。本研究中，采用行為學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)等手段，研究了不同DO濃度下香螺的行為、組織結(jié)構(gòu)及抗氧化酶活性的變化規(guī)律，以期明確香螺最適DO環(huán)境及其對DO的耐受范圍，從而為實現(xiàn)香螺的全人工增養(yǎng)殖提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用香螺采自遼寧省大連市旅順口海域，潮濕低溫環(huán)境下運(yùn)回農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，暫養(yǎng)于15個50 L水族箱中，香螺濕體質(zhì)量為(85.3±9.3)g，暫養(yǎng)溫度為(9±1)℃，鹽度為30±1，DO為7.5 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 資料顯示，2008—2017年，渤海海域海水的平均DO為7.7 mg/L[12]。因此，本試驗中設(shè)置了0、2、4、6、8 mg/L 5個DO質(zhì)量濃度(以下簡稱為濃度)，每個濃度設(shè)置3個平行，每個平行放置100只健康香螺。

不同DO濃度的維持方法參照江天棋等[13]的方法，略有改動。具體如下：

8 mg/L DO組(對照組)：通過持續(xù)通入空氣的方法維持DO為8 mg/L。

0 mg/L DO組：先將試驗水體煮沸冷卻，后通入純氮?dú)庖耘艃粞鯕猓瑥亩S持DO為0 mg/L。

2、4、6 mg/L DO組：通過持續(xù)通入氮?dú)夂涂諝饣旌蠚怏w的方法，保持試驗需要的DO濃度。

通入氣體后，待水體DO濃度穩(wěn)定，表面用液體石蠟密封，防止水面與空氣進(jìn)行氣體交換，導(dǎo)致局部DO濃度不一致。

香螺于試驗前斷食2 d，以減小香螺食欲對試驗的影響，后將香螺從暫養(yǎng)水體直接放到對應(yīng)試驗水體，觀察其在不同DO濃度下的存活和行為特征，6 h后取樣，從每個平行取20只香螺，進(jìn)行組織學(xué)和相關(guān)抗氧化酶指標(biāo)的測定。剩余香螺繼續(xù)留在試驗水體直至試驗結(jié)束。

1.2.2 行為特征觀察 香螺有4種行為狀態(tài)：正常狀態(tài)、活躍狀態(tài)、脫吸狀態(tài)和死亡狀態(tài)。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)：正常狀態(tài)是指運(yùn)動較少，長時間靜止吸附在池底或池壁；活躍狀態(tài)是指香螺靜止時間較短，移動時間較長；脫吸狀態(tài)是指香螺足部水腫，吸附池壁能力下降，吸不住池壁；死亡狀態(tài)是指軟體部無法完全縮入殼中。

1.2.3 組織學(xué)觀察 參照Chen等[14]的組織切片制作方法。取香螺新鮮鰓和嗅檢器組織，用Bouin液固定24 h以上，再進(jìn)行常規(guī)伊紅(H.E)染色，并在Leica顯微鏡(型號DM4 B)下觀察并拍照。

1.2.4 抗氧化酶活性測定 采用南京建成生物工程研究所試劑盒，測定香螺鰓和肝胰腺組織的總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力，具體參照說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey’s法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 行為特征

從表1可見：香螺進(jìn)入低DO濃度(0、2、4 mg/L)的水體后，會出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)；當(dāng)DO為4 mg/L時，香螺12 h內(nèi)出現(xiàn)脫吸現(xiàn)象，24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，96 h內(nèi)全部死亡；當(dāng)DO為2 mg/L時，香螺6 h內(nèi)出現(xiàn)脫吸現(xiàn)象，48 h內(nèi)全部死亡；當(dāng)DO為0 mg/L時，香螺24 h內(nèi)全部死亡。

表1 不同DO濃度下香螺死亡率及行為特征Tab.1 Mortality and behavior of whelk Neptunea cumingii under different DO concentrations

2.2 香螺鰓和嗅檢器組織結(jié)構(gòu)

2.2.1 鰓結(jié)構(gòu) 不同DO濃度下，香螺鰓絲結(jié)構(gòu)變化見圖1，對照組香螺鰓絲表面褶皺不明顯，組織結(jié)構(gòu)完整，鰓小片呼吸上皮細(xì)胞排列有序(圖1E)，隨著DO濃度的降低，鰓絲呼吸上皮細(xì)胞腫大脫落明顯，因脫落形成的細(xì)胞凹陷亦愈顯著，最終呈鋸狀(圖1A～D)。

A～E—不同DO濃度下的鰓組織結(jié)構(gòu)，A、B、C、D、E，DO濃度分別為0、2、4、6、8 mg/L。GF—鰓絲，MC—黏液細(xì)胞，GFI—鰓絲間隔，PVC—呼吸上皮細(xì)胞，CC—泌氯細(xì)胞。A-E—gill histological structure under different dissolved oxygen concentration, A, B, C, D and E are 0, 2, 4, 6 and 8 mg/L respectively.GF—gill filament, MC—mucous cells, GFI—gill filament interval, PVC—respiratory epithelial cells, CC—secretory chloride cell.圖1 不同DO濃度下香螺鰓的組織結(jié)構(gòu)Fig.1 Gill histological structure of whelk Neptunea cumingii under different DO concentrations

不同DO濃度下，香螺鰓絲間隔變化顯示：隨著DO濃度的降低，鰓絲間隔總體上呈先增大后減小的變化趨勢；DO為4 mg/L時，鰓絲間隔最大，之后逐漸減小，DO為0 mg/L時絲間隔雖再次增大，但與DO為4 mg/L時無顯著性差異(P>0.05)(表2)。不同DO濃度下，香螺鰓黏液細(xì)胞數(shù)量變化顯示：隨著DO濃度的降低，鰓的黏液細(xì)胞數(shù)量總體上呈先增加后降低的變化趨勢；DO為6 mg/L時，鰓黏液細(xì)胞數(shù)量最多，對照組(8 mg/L)黏液細(xì)胞數(shù)量最少，且低DO濃度組(0～6 mg/L)鰓黏液細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組(P<0.05)(表3)。

2.2.2 嗅檢器結(jié)構(gòu) 不同DO濃度下，香螺嗅檢器組織結(jié)構(gòu)變化見圖2，嗅檢器細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且排列有序，變化不顯著。

A～E—不同DO濃度下嗅檢器的組織結(jié)構(gòu)，A、B、C、D、E，DO濃度分別為0、2、4、6、8 mg/L。OF—嗅檢器絲，MC—黏液細(xì)胞，OFI—嗅檢器絲間隔。A-E—osphradiuml histological structure under different dissolved oxygen concentration, A, B, C, D and E are 0, 2, 4, 6 and 8 mg/L respectively. OF—osphradium filament, MC—mucous cells, OFI—osphradium filament interval.圖2 不同DO濃度下香螺嗅檢器的組織結(jié)構(gòu)Fig.2 Osphradium histological structure of whelk Neptunea cumingii under different DO concentrations

不同DO濃度下，香螺嗅檢器絲間隔變化顯示，DO濃度對香螺嗅檢器絲間隔的影響顯著，當(dāng)DO為4 mg/L時，香螺嗅檢器絲間隔最大，且顯著大于其他組(P<0.05)(表2)。不同DO濃度下，香螺嗅檢器黏液細(xì)胞數(shù)量變化顯示：隨著DO濃度的降低，嗅檢器黏液細(xì)胞數(shù)量呈先上升后下降的變化趨勢；DO為6 mg/L時黏液細(xì)胞數(shù)量最多，DO為0 mg/L時黏液細(xì)胞數(shù)量最少；0、2 mg/L DO處理組黏液細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，4、6 mg/L DO處理組黏液細(xì)胞數(shù)量則顯著高于對照組(P<0.05)(表3)。

表2 不同DO濃度下香螺鰓絲和嗅檢器絲間隔Tab.2 Gill filament and osphradium filament spacing of whelk Neptunea cumingii under different DO concentrations

相同DO濃度下，不同組織間的黏液細(xì)胞數(shù)量相比，除0 mg/L DO組外，其他DO濃度下，鰓和嗅檢器黏液細(xì)胞數(shù)量均有顯著性差異(P<0.05)(表3)。

表3 不同DO濃度下香螺鰓和嗅檢器的黏液細(xì)胞數(shù)量Tab.3 Number of mucus cells in gill and osphradium of whelk Neptunea cumingii under different DO concentrations

2.3 鰓和肝胰腺組織的抗氧化酶活性變化

從表4可見：隨著DO濃度的下降，香螺鰓和肝胰腺組織的T-AOC、SOD活性總體上均呈先下降后升高再下降的變化趨勢，鰓和肝胰腺中T-AOC活性在4 mg/L DO組、對照組中較高，且二者顯著高于其他組(P<0.05)，SOD活性則在4 mg/L DO組最高且顯著高于其他組(P<0.05)(除2 mg/L DO組肝胰腺外)，T-AOC、SOD活性均在6 mg/L DO組較低；隨著DO濃度的下降，香螺鰓中CAT活性呈先上升后下降再上升的變化趨勢，而香螺肝胰腺中CAT活性則呈下降趨勢，鰓中CAT活性在4 mg/L DO組最高且顯著高于其他組(P<0.05)，肝胰腺中CAT活性則在對照組最高且顯著高于其他DO濃度組(P<0.05)。

相同DO濃度下，不同組織間抗氧化酶活性相比，鰓中SOD活性在各DO濃度下均顯著高于肝胰腺(P<0.05)，而鰓和肝胰腺中T-AOC、CAT活性在多數(shù)DO濃度下也達(dá)到了顯著性差異(P<0.05)(表4)。

表4 不同DO濃度下香螺鰓和肝胰腺的抗氧化酶指標(biāo)Tab.4 Changes in T-AOC in gills and hepatopancreas of whelk Neptunea cumingii under different DO concentrations U/mg prot

3 討論

3.1 低氧脅迫對香螺行為特征的影響

對水產(chǎn)動物而言，DO是一個重要的環(huán)境因子，它會影響水產(chǎn)動物的行為、存活等相關(guān)生理生態(tài)的變化，嚴(yán)重時造成水產(chǎn)動物生理損傷甚至死亡[15]。魏若飛等[16]發(fā)現(xiàn)，大瓶螺Ampullarisgigasspix在短期低氧脅迫階段，行為比較活躍，持續(xù)低氧后活動減弱，出現(xiàn)閉厴和死亡現(xiàn)象。除腹足類外，許多學(xué)者在其他軟體動物中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。Sen等[17]發(fā)現(xiàn)，DO濃度越低，太平洋鮑魚Pacificabalone的半致死時間越短。Li等[18]和Chen等[14]發(fā)現(xiàn),櫛孔扇貝Chlamysfarreri在低氧環(huán)境下比較活躍，且其存活率會隨DO濃度下降而出現(xiàn)顯著下降。本研究中結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，DO濃度對香螺的行為特征影響顯著，初始階段，香螺移動活躍，后隨低氧脅迫時間延長，香螺出現(xiàn)閉厴和死亡現(xiàn)象。分析原因可能是：當(dāng)短期低氧脅迫時，香螺移動較活躍，說明香螺試圖通過快速移動尋找高濃度DO區(qū)域；隨著脅迫時間的延長，香螺身體各組織機(jī)能下降，導(dǎo)致足部吸附能力減弱，以至于最后無法吸附住池壁；隨著低氧脅迫時間的進(jìn)一步延長，香螺相關(guān)組織結(jié)構(gòu)遭到不可逆式破壞，香螺開始出現(xiàn)閉厴和死亡現(xiàn)象。

3.2 低氧脅迫對香螺鰓和嗅檢器組織結(jié)構(gòu)的影響

在海洋軟體動物體內(nèi)，鰓不僅是氣體交換的呼吸器官，還是濾食浮游生物以攝取營養(yǎng)的過濾器官，且由于鰓直接暴露于水體中，它還是感知周圍環(huán)境變化的早期感知器官[19]。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境會嚴(yán)重破壞菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum鰓組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其鰓絲上皮不完整，層間結(jié)構(gòu)消失，鰓絲間連接不規(guī)則。除無脊椎動物外，脊椎動物中也存在類似現(xiàn)象，如團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala在低氧水體中鰓絲尖端膨大，凹陷形成褶皺[21]。線紋海馬Hippocampuserectus幼魚受到低氧脅迫時，鰓呼吸上皮細(xì)胞腫大脫落，鰓組織壞死[22]。本試驗中發(fā)現(xiàn)，低氧會破壞香螺鰓的組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其鰓絲尖端顯著膨大，間距變大，表面細(xì)胞凹陷形成褶皺。有研究表明，水產(chǎn)動物可通過改變鰓組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，緩解外界環(huán)境變化對其產(chǎn)生的不利影響[23-24]。由此推測，本研究中，缺氧初始階段，香螺通過改變鰓絲形態(tài)，擴(kuò)大鰓絲表面積，進(jìn)而增大鰓與水的接觸面積，加大對氧的吸收，滿足機(jī)體所需；當(dāng)持續(xù)低氧時，香螺的鰓組織結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，致使其相關(guān)功能丟失，最終導(dǎo)致其死亡。在腹足類的一些研究中，嗅檢器通常被作為一個特有的化學(xué)感受器,用于研究各種環(huán)境因子對腹足類的影響[25]。但在本研究中，水中DO濃度變化時，香螺嗅檢器的組織結(jié)構(gòu)并沒有顯著的改變。其原因可能是嗅檢器對DO這一指標(biāo)不敏感造成的。

貝類無特異性免疫系統(tǒng)，黏液細(xì)胞是其重要的腺細(xì)胞，貝類黏液可以在貝類體表形成一個致密的保護(hù)層，是貝類抗感染的第一道屏障。因此，黏液免疫作用顯得尤為重要，黏液細(xì)胞的數(shù)目是反映貝類黏液免疫對環(huán)境變化適應(yīng)的一個重要指標(biāo)[26]。本研究中，香螺鰓和嗅檢器在DO為8 mg/L(對照)、6 mg/L時黏液細(xì)胞數(shù)最高，且顯著高于其他處理組。作者推測認(rèn)為：DO為8、6 mg/L時，香螺處于最適DO環(huán)境，身體各組織機(jī)能較佳，黏液免疫屏障較強(qiáng)，故黏液細(xì)胞數(shù)量較高；而在低氧環(huán)境下，香螺機(jī)體出現(xiàn)損傷，黏液細(xì)胞分泌不暢，導(dǎo)致黏液細(xì)胞數(shù)量降低。

3.3 低氧脅迫對香螺抗氧化酶活性的影響

活性氧自由基(ROS)是由氧轉(zhuǎn)變而成，化學(xué)性質(zhì)十分活潑，易與機(jī)體的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成新的自由基或氧化物[27]。生物進(jìn)行新陳代謝活動時會產(chǎn)生ROS，當(dāng)機(jī)體受到不良環(huán)境脅迫時，會導(dǎo)致機(jī)體聚集更多ROS，ROS水平升高起著重要的信號作用，但過量的ROS產(chǎn)生會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并對生物體的健康、性能和生存產(chǎn)生負(fù)面影響[28]。經(jīng)過漫長的進(jìn)化，生物具備了一套有效清除ROS的免疫體系，可使體內(nèi)ROS生成與清除形成動態(tài)平衡，而CAT和SOD等抗氧化酶可保護(hù)生物體免受自由基的侵害，它們可以將ROS分解成對機(jī)體無害的H2O和O2，因此，SOD和CAT活性的高低可作為評估香螺抵抗環(huán)境變化能力的重要指標(biāo)[29-30]。而T-AOC則可以反映生物的抗氧化能力，是評定生物健康狀況的重要指標(biāo)[31]。

目前，國內(nèi)外很多學(xué)者開展了不同DO濃度下水產(chǎn)動物抗氧化酶活性的研究。Chen等[31]研究發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝Pinctadafucatamartensii在低氧環(huán)境中其肝胰腺的T-AOC和CAT活性較對照組顯著降低。Marcus等[32]研究發(fā)現(xiàn)，扁卷螺Biomphalariatenagophila在低氧條件下，其體內(nèi)CAT活性較對照組下降了31%。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著DO濃度下降，香螺鰓和肝胰腺組織的T-AOC和SOD活性總體呈先下降后升高再下降的趨勢，CAT活性總體呈先升高后下降的趨勢。這與Chen等[31]和Marcus等[32]的結(jié)果存在差異，作者分析認(rèn)為，出現(xiàn)差異的原因可能與試驗物種不同及脅迫時間長短有關(guān)。另外，通過本試驗結(jié)果，筆者推測，輕微的低氧脅迫可能會使機(jī)體內(nèi)的ROS濃度升高，為了維持ROS生成和清除之間的平衡，機(jī)體抗氧化防御體系被激發(fā)，表現(xiàn)為抗氧化酶活力上升，隨著低氧脅迫的加深，機(jī)體調(diào)節(jié)和免疫保護(hù)壓力過大，體內(nèi)生理功能紊亂，表現(xiàn)為抗氧化酶活力顯著下降，隨著低氧環(huán)境的進(jìn)一步加深，機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而出現(xiàn)閉厴和死亡現(xiàn)象。

4 結(jié)論

1)香螺最適DO為6～8 mg/L,當(dāng)養(yǎng)殖水體DO≤4 mg/L、脅迫時間≥96 h時，香螺存活率為0。

2)低DO對香螺的行為特征、相關(guān)組織病理損傷和抗氧化酶活性影響顯著，在短期低氧環(huán)境下，香螺會通過改變自身行為和相關(guān)組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，以及通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等方式來適應(yīng)低氧環(huán)境。