鄭錫良，梁森苗，俞浙萍，任海英，孫 鸝，林 瑞，張淑文，戚行江

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，浙江 杭州310021)

楊梅是我國南方的特色經(jīng)濟果樹，樹形優(yōu)美，四季常綠；果實顏色鮮艷，富含黃酮、多酚、氨基酸等活性物質(zhì)，具有抗氧化、降糖、降脂、抑制腫瘤等功能特性，深受消費者青睞。2004年以來，發(fā)現(xiàn)了危害楊梅產(chǎn)業(yè)的凋萎病，現(xiàn)已逐步向全國其他楊梅產(chǎn)區(qū)陸續(xù)擴散。楊梅凋萎病的病原菌為異色擬盤多毛孢()和小孢擬盤多毛孢()，主要定殖于楊梅枝干，也可以侵染楊梅葉片引起葉斑病，進而導致樹體枝條和樹干干枯，影響楊梅樹體對氮、鈣等營養(yǎng)元素的吸收和傳遞，降低根際菌根活力，最終導致樹體死亡。近年來，研究發(fā)現(xiàn)楊梅產(chǎn)區(qū)發(fā)生了一種新病害——衰弱病，該病害多發(fā)生于盛產(chǎn)期果園，發(fā)病果園未見明顯的發(fā)病中心。衰弱病發(fā)生后楊梅樹體須根減少，韌皮部和木質(zhì)部顏色加深，后期根系出現(xiàn)腐爛癥狀，病癥逐年加重，直至死亡。楊梅凋萎病和衰弱病均是危害楊梅產(chǎn)業(yè)的重要病害，造成了嚴重經(jīng)濟損失，影響了產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展。

目前，對楊梅凋萎病、衰弱病兩種病害的研究主要集中在發(fā)病規(guī)律及防治策略方面，對兩種病害的判斷和區(qū)別主要以樹體表現(xiàn)憑經(jīng)驗進行鑒別，受主觀因素影響較大，不利于采取準確防治措施。由此，本研究擬通過多年經(jīng)驗總結健康、衰弱病、凋萎病樹體的典型表現(xiàn)，測定不同狀態(tài)樹的根、枝條、葉片、花芽等組織的多種生理指標，以及葉片擬盤多毛孢()ITS序列()相對表達量等數(shù)據(jù)，篩選不同狀態(tài)樹的顯著差異指標，用于評價不同狀態(tài)樹的量化指標，旨在為準確鑒別楊梅樹健康狀態(tài)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年1月，分別在浙江文成、青田、仙居、蘭溪、上虞等楊梅產(chǎn)區(qū)代表性果園(果園管理水平中等)，開展健康、衰弱病、凋萎病楊梅樹調(diào)查與取樣，品種為東魁；采集樹冠滴水線附近根系、一年生枝條、成熟葉片、花芽等不同組織樣品(表1)，每個樣品含3個重復，每重復中花芽樣本5 g左右，其余組織樣本10 g以上；樣品采集后置于干冰中保存，帶回實驗室后置于-20 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)實驗。葉綠素相對含量(SPAD)采用美能達的SPAD-502葉綠素儀測定，每份樣品測定10片葉子。

表1 楊梅樣本采集信息

1.2 指標測定

采用分光光度法測定不同組織的CAT活性、HO含量、LPO含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、DHA含量，組織樣品經(jīng)不同測定指標對應的試劑盒(購自蘇州科銘生物技術有限公司)處理(參考試劑盒說明書)后進行測定，每樣本設置3次重復測定。

1.3 PvITS序列相對表達量分析

利用上述健康、衰弱病和凋萎病的樹體葉片，利用CTAB-KAc法提取葉片和擬盤多毛孢混合RNA。使用天根的TIANScript ll cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄，獲得混合cDNA；利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)原理，建立了序列相對表達量直接測定方法：以混合cDNA為模板，采用任海英等研究中定量引物Pvm1L和Pvm1R，以持家基因為內(nèi)參基因設計引物MyTUB2_qF和MyTUB2_qR(表2)，采用天根FastFire qPCR Premix(SYBR Green)試劑盒進行qRT-PCR反應，采用10 μL反應體系：cDNA模板1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，2×FastFire qPCR PreMix 5 μL，RNase-Free ddHO 3 μL；反應程序為：預變性95 ℃ 1 min；變性95 ℃ 5 s，退火55 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 15 s，38 個循環(huán)。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

以內(nèi)參基因?qū)腃值，對所有qRT-PCR反應進行標準化計算，并通過公式2-ΔΔC獲得不同樣本的相對表達量。利用箱式分析法計算酶活、相對表達量的上四分位數(shù)()、中位數(shù)()、下四分位數(shù)()，四分位區(qū)間(inter-quartile range，)=-，下異常值=-1.5，上異常值=+1.5，公式計算、圖形繪制使用Excel 2016軟件進行。

2 結果與分析

2.1 健康、衰弱病和凋萎病的樹體典型表現(xiàn)

通過在浙江楊梅主產(chǎn)區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)：健康樹根系發(fā)達、新根生長明顯，葉片濃綠，葉綠素相對含量(SPAD)在35.0～50.8，新梢分春、夏、秋季等不同時期正常抽生、樹體健壯，常規(guī)管理、正常年份條件下，年度結果數(shù)量無明顯增減幅度，果實顏色鮮艷，酸甜適口，樹體壽命可長達百年(圖1-a)。

衰弱病樹大部分老、熟葉片脫落，只存留頂端外圍少量暗綠、發(fā)黃、無光澤的葉片，SPAD在25.2～37.5，新梢抽生困難，結果量增多，果實小而酸，品質(zhì)差，發(fā)病2～4 a后樹體死亡，無明顯集中暴發(fā)期，為非侵染性病害，無法通過觀測氣候因素建立測報模型進行預測(圖1-b)。

凋萎病樹，發(fā)病初期樹體上冠部枝梢出現(xiàn)零星葉片急性青枯，SPAD在20.1～44.3，始現(xiàn)病癥多數(shù)在幼嫩枝梢中上部位，頂部、外圍枝條及內(nèi)膛枝均有不同程度的發(fā)生，癥狀初現(xiàn)時葉片青枯、凋而不落；樹干以及根的木質(zhì)部變褐色；翌年春季發(fā)病癥狀減輕，甚至可正常抽梢生長與結果。主要在夏末秋初開始出現(xiàn)病癥，于9月至翌年3—4月集中暴發(fā)；由此反復2～3 a后，伴隨枝干韌皮部開裂，根系枯死，樹體死亡(圖1-c)。

a，健康樹體；b，衰弱病樹體；c，凋萎病樹體。a， Healthy tree； b， Decline tree； c， Twig blight tree.圖1 不同楊梅樹體狀態(tài)表現(xiàn)Fig.1 Different status performance of Chinese bayberry trees

2.2 健康、衰弱病、凋萎病樹體不同組織的活性指標分析

健康、衰弱病、凋萎病狀態(tài)間枝條CAT活性分別在27.12～79.10 nmol·min·g、31.64～79.10 nmol·min·g、33.90～89.27 nmol·min·g；根CAT活性分別在117.52～386.46 nmol·min·g、46.71～225.43 nmol·min·g、47.46～220.91 nmol·min·g；在箱式圖和異常值分析中發(fā)現(xiàn)(圖2-a)，枝條和根CAT活性在健康與其他兩種樹體間均存在極顯著性差異(0.001≤<0.01)，但是枝條CAT活性在健康與其他樹體狀態(tài)間，指標有數(shù)值范圍重疊，不適于作為明顯區(qū)別指標；而根CAT活性在去除異常值后健康樹體分布范圍為：117.52～280.67 nmol·min·g，其余兩種樹體為46.71～225.43 nmol·min·g，數(shù)據(jù)重疊范圍相對較小，可作為輔助判斷樹體健康與否的指標。

健康、衰弱病、凋萎病3種狀態(tài)的葉片HO含量分別在335.04～665.58 μmol·g、482.89～978.91 μmol·g、502.54～794.89 μmol·g；枝條HO含量分別在77.54～174.35 μmol·g、119.89～276.82 μmol·g、115.25～268.88 μmol·g；健康葉片和枝條HO含量極顯著性低于其他兩種樹體指標(圖2-b)，而根和花芽HO指標在3種狀態(tài)間無顯著性差異。

表3 楊梅不同樹體狀態(tài)和組織的CAT活性和H2O2含量

健康、衰弱病、凋萎病3種狀態(tài)葉片LPO含量、枝條LPO含量、花芽LPO含量在不同樹體狀態(tài)間均無顯著差異。根LPO含量分別在252.63～587.64、255.67～592.91、153.75～727.04 nmol·g，健康樹體中指標顯著性低于其他兩種樹體狀態(tài)(圖3-a和表4)(0.01≤<0.05)。根SOD活性、花芽SOD活性在不同樹體狀態(tài)間無顯著性差異。葉片SOD活性分別在450.71～910.21、625.45～1 012.98、608.97～996.68 U·g，枝條SOD活性分別在484.20～804.99、745.79～1 621.98、831.63～1 297.36 U·g，葉片和枝條SOD活性在健康與其他兩種狀態(tài)間均存在極顯著性差異(<0.001)，尤其枝條SOD活性可作為輔助判斷樹體健康與否的指標(圖3-b)。

*、**、***分別代表健康與其他兩種狀態(tài)間均存在顯著性、極顯著性差異(0.01≤P<0.05、0.001≤P<0.01、P<0.001)。下同。*， **， *** represent that there are significant and extremely significant differences between healthy and the other two status (0.01≤P<0.05， 0.001≤P<0.01， P<0.001) ， respectively. The same as below.圖2 楊梅不同樹體狀態(tài)和組織的CAT活性和H2O2含量的差異顯著性分析Fig.2 Analysis of significant difference of CAT activity and H2O2 content of different tissues in different status of Chinese bayberry

健康、衰弱病、凋萎病3種狀態(tài)的葉片MDA含量、枝條MDA含量、花芽MDA含量在不同樹體間無顯著性差異。根MDA含量分別在23.56～59.10 nmol·g、35.43～78.00 nmol·g、30.01～75.34 nmol·g，健康樹體指標極顯著性高于其他兩種樹體 (0.01≤<0.05)(圖4-a和表5)。三種狀態(tài)的根DHA含量分別在1.02～1.59 μg·min·g(去除異常值后范圍為1.02～1.58 μg·min·g)、0.42～0.78 μg·min·g、0.37～0.73 μg·min·g(圖4-b和表5)，且健康樹體指標極顯著高于其他兩種樹體(<0.001)，可作為輔助判斷樹體健康與否的指標。

表4 楊梅不同樹體狀態(tài)和組織的LPO含量和SOD活性

圖3 楊梅不同樹體狀態(tài)和組織的LPO含量和SOD活性的差異顯著性分析Fig.3 Analysis of significant difference of LPO content SOD activity of different tissues in different status of Chinese bayberry

表5 楊梅不同樹體狀態(tài)和組織的MDA和DHA含量

2.3 楊梅葉片PvITS相對表達量分析

根CAT活性、葉片HO含量、葉片和枝條SOD活性、根DHA含量等指標在衰弱病與凋萎病樹體中無顯著性差異，表明上述指標不適于區(qū)別衰弱病和凋萎病的樹體狀態(tài)，還需借助qRT-PCR等手段進行判斷或區(qū)分。因此，本研究對3種樹體葉片的相對表達量進行了qRT-PCR分析，結果如表6所示：健康相對表達量在0.78～1.15，中位數(shù)()為1.00。衰弱病相對表達量在1.01～9.23，異常值為<1.76和>3.91的數(shù)值，去掉異常值后，相對表達量應為1.76～3.91，為2.73。凋萎病相對表達量在3.39～99.04，異常值為<9.54和>29.62的數(shù)值，去掉異常值后，相對表達量應為9.54～29.62，為16.56。3種樹體相對表達量間均存在極顯著性差異，因此，葉片相對表達量可作為判斷健康、衰弱病、凋萎病樹體狀態(tài)的量化指標。

圖4 楊梅不同樹體狀態(tài)和組織的MDA和DHA含量的差異顯著性分析Fig.4 Analysis of significant difference of MDA and DHA content of different tissues in different status of Chinese bayberry

表6 楊梅葉片擬盤多毛孢菌ITS序列的相對表達量

3 討論

CAT廣泛存在于植物體中，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用，可顯著抑制根霉菌()活性。SOD能夠特異性地清除超氧陰離子，保護機體免受氧化損傷，是廣泛存在于各生物體中的重要金屬酶，能夠防治桃褐腐病等真菌性病害，是參與植物抗病的一種重要的酶，并與木質(zhì)素及抗病毒素的合成有關，還可以增強植株對各種病原菌的抵抗力，可以被用作鑒定植物抗病性的生化標記。DHA通過脫氫抗壞血酸還原酶還原為抗壞血酸(AsA)，進而參與植物自身的氧化應激反應，在植物抵抗氧化脅迫中具有重要作用，是根系活力的重要表現(xiàn)。前人研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌()、鐮刀菌()等真菌侵染植物，可引起CAT、SOD、POD等酶的活性變化，防御病原菌的侵染，提高植株抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，健康與衰弱病、凋萎病樹體根CAT活性、枝條SOD活性、根DHA含量間均存在極顯著性差異，數(shù)據(jù)重疊范圍較小，通過去除異常值后，健康樹體與衰弱病、凋萎病樹體根CAT活性分別為117.52～280.67 nmol·min·g與46.71～225.43 nmol·min·g、枝條SOD活性分別為484.20～804.99 U·g與745.79～1 621.98 U·g、根DHA含量分布分別為1.02～1.58 μg·min·g與0.37～0.78 μg·min·g，是適合用于評價楊梅樹健康與否的量化指標。結合前期研究發(fā)現(xiàn)，凋萎病與衰弱病兩種樹體的微生物菌落結構發(fā)生了變化，導致了樹體自身的防御酶系統(tǒng)發(fā)生了變化，導致了枝條SOD活性增加，與前人研究結果一致，可成為鑒定楊梅病害的重要標志物；根系CAT與DHA活性降低，表明兩種樹體狀態(tài)的根系活力明顯降低，建議重點針對根部采取復壯措施，進而達到恢復樹勢效果。

利用qRT-PCR方法測定葉片的相對表達量，發(fā)現(xiàn)健康、衰弱病、凋萎病分布范圍分別是0.78～1.15、1.76～3.91、9.54～29.62，且兩兩間均存在極顯著性差異(0.01≤<0.001)，數(shù)值間差異無重疊，是一種快速、受主觀因素影響較小的，可用于區(qū)別3種樹體狀態(tài)的量化指標。任海英等研究表明，楊梅凋萎病樹體中擬盤多毛孢和小擬盤多毛孢等內(nèi)生真菌的豐度遠高于健康樹體，擬盤多毛孢和小擬盤多毛孢豐度增加是引發(fā)凋萎病發(fā)生的病因，是凋萎病的病原菌；本研究中凋萎病樹葉片的相對表達量遠高于衰弱病和健康樹體，與前人研究結論一致，也表明凋萎病病原菌豐度增加不是引發(fā)衰弱病的直接病因，兩種病害有本質(zhì)區(qū)別，需針對具體病因研發(fā)不同的防治措施。同時，結合健康樹具有新根生長明顯、葉片濃綠、新梢正常抽生、果實顏色鮮艷等外觀表現(xiàn)；衰弱病樹具有葉片異常脫落，存留葉片暗綠、發(fā)黃、無光澤，新梢抽生困難，結果量增多，果實小而酸，無明顯集中暴發(fā)期等典型外觀表現(xiàn)；凋萎病樹具有幼嫩枝梢中上部葉片急性青枯、凋而不落，翌年春季發(fā)病癥狀減輕，甚至可正常抽梢生長與結果，于9月至翌年3—4月集中暴發(fā)等典型表現(xiàn)，可更為準確判斷楊梅樹體3種健康狀態(tài)。本文僅用“衰弱病”和“凋萎病”兩種病害的生化與指標，不能代表其他病害樹體狀態(tài)，因此，其他病害樹體狀態(tài)的量化評價需進一步研究驗證。

4 結論

根CAT活性、根DHA含量、枝條SOD活性及葉片相對表達量可作為區(qū)分楊梅樹體狀態(tài)的量化指標，輔助評價樹體健康與否的參考閾值分別為117.52～280.67 nmol·min·g、1.02～1.58 μg·min·g、484.20～804.99 U·g和0.78～1.15。相對表達量輔助評價衰弱病與凋萎病的參考閾值分別為1.76～3.91、9.54～29.62，與樹體表現(xiàn)相結合，理論上可更準確評價楊梅健康狀態(tài)。