徐 莉，王 其，丁 婷，江 騰

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.植物保護(hù)學(xué)院；c.新農(nóng)村發(fā)展研究院，安徽 合肥 230061)

玉米是全球重要的糧食作物及工業(yè)原料，每年因各類病害對(duì)玉米植株的生長(zhǎng)造成一定的生物脅迫，導(dǎo)致了不同程度的減產(chǎn)。目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病害的防治主要還是采取藥劑防治，農(nóng)藥的長(zhǎng)期過(guò)多應(yīng)用導(dǎo)致了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等一系列的問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)玉米的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)，在當(dāng)前我國(guó)耕地面積有限的條件下，玉米的種植面積無(wú)法大幅度增加，因此抗病品種選育等方面的研究日益引起人們的關(guān)注，在此背景下結(jié)合玉米種質(zhì)資源進(jìn)行優(yōu)良抗病基因或抗病位點(diǎn)玉米抗病基因的深度挖掘、提高植物的抗病性意義重大。高花雨等的研究結(jié)果表明，小麥中10基因與小麥植株抗條銹病有關(guān)，可在全生育期表現(xiàn)出抗性，其通過(guò)激活植株體內(nèi)的R基因誘導(dǎo)SA信號(hào)通路、提高植株的抗病能力。1基因在植物中廣泛存在，目前，作為抗病基因在很多植物中被研究，在提高植物的抗病能力方面發(fā)揮了積極的作用。

在前期的研究中，本課題組從杜仲的葉片組織中篩選出一株內(nèi)生拮抗菌DZSY21，將其菌懸液噴灑接種到玉米植株體內(nèi)可穩(wěn)定定殖，形成和諧共生的關(guān)系，并使玉米植株的抗病能力增強(qiáng)；基于此，王其等利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)DZSY21噴灑接種到玉米植株體內(nèi)后誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生抗病性的分子機(jī)制進(jìn)行了分析，篩選得到2455909等可能具抗病效果的基因。本研究以2455909基因作為研究對(duì)象，通過(guò)用PCR擴(kuò)增、載體構(gòu)建、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化等技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥，對(duì)其抗病能力進(jìn)行初步研究，為作物的遺傳育種抗病性改良研究提供新的路徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料包括安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院試驗(yàn)室保存的丁香假單胞菌DC3000菌株、哥倫比亞野生型擬南芥菌株、植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301a，DH5α大腸埃希菌(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)、GV3101農(nóng)桿菌(上海唯地生物有限公司)等。

試驗(yàn)試劑：載體克隆試劑盒pEASY-Blunt Simple Cloning Kit，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶(I、I)，日本TaKaRa；DNA Marker(DL5000 DNA marker、DL2000 DNA marker)、DNA聚合酶，廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、植物基因組提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；利福平、卡那霉素，上海生工生物工程股份有限公司；潮霉素B，上海羅氏制藥有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptRT reagent Kit RT with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、熒光定量試劑盒SYBRPremix ExTaqⅡ[Tli RNaseH Plus，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI-blast數(shù)據(jù)庫(kù)在其他物種中開(kāi)展目的基因序列相似性的比對(duì)分析，查找出具有較高同源性的基因，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。選擇在線工具GSDS2.0軟件開(kāi)展基因序列內(nèi)含子、外顯子等分析；選擇在線工具SMART軟件分析該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 基因克隆

對(duì)目的基因2455909片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列為GGAGCTCATGACAGGTGCGAAGCTTAATGGC，下游引物序列為TCGGTCGACTTATCCCGCACGGTGAGG，產(chǎn)物長(zhǎng)度2 557 bp；25 μL反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5 μL，上游及下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddHO 9.5 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃，變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min?；厥占兓哪康钠闻c載體pEASY-Blunt Simple Cloning vector進(jìn)行連接(克隆載體1 μL，目的片段4 μL，25 ℃反應(yīng) 2 h)。

將pEASY-2455909載體轉(zhuǎn)入大腸埃希菌()DH5α感受態(tài)，加入無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布在含有卡那霉素(50 mg·mL)的LB平板上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取出單克隆，采用通用引物M13F/R進(jìn)行菌液PCR，PCR反應(yīng)體系25 μL，將陽(yáng)性克隆在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后提取質(zhì)粒，送安徽通用生物系統(tǒng)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

對(duì)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pEASY-2455909在37 ℃條件下酶切3 h，酶切選擇20 μL反應(yīng)體系：重組質(zhì)粒12 μL，Cut Smart Buffer 2 μL，I 1 μL，I 1 μL，ddHO 4 μL。之后，進(jìn)行切膠回收并獲得目的片段。將目的片段與 pCAMBIA1301a過(guò)表達(dá)載體在4 ℃條件下過(guò)夜進(jìn)行連接，獲得pCAMBIA1301a-2455909重組質(zhì)粒。之后按照1.2.2節(jié)的方法轉(zhuǎn)化菌株DH5α、陽(yáng)性克隆篩選和質(zhì)粒提取、測(cè)序驗(yàn)證等。選擇電擊法用pCAMBIA1301a-2455909重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101，在含有卡那霉素和利福平的LB固體平板上篩選出單菌落，并用PCR法篩選農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌，選擇通用引物M13F/R，反應(yīng)體系25 μL。

1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因

利用篩選得到的農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌，采用蘸花法侵染野生型擬南芥。種子成熟后得到的種子為T0代，在MS平板(潮霉素50 mg·L)中進(jìn)行篩選、移栽得到T1代，重復(fù)一次在MS平板(潮霉素50 mg·L)中進(jìn)行篩選、移栽獲得純系轉(zhuǎn)基因植株T2代。

1.2.5 陽(yáng)性苗的篩選

結(jié)合pCAMBIA1301a 載體上的基因序列進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)、合成(上游引物序列為GCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTG，下游引物序列為GCCCTTCACTGCCACTGACC；Tm值為55 ℃)。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株L2、L9葉片基因組的提取選擇植物基因組提取試劑盒，以提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序見(jiàn)1.2.2節(jié)，對(duì)基因開(kāi)展分子檢測(cè)，目的片段大小659 bp。

選擇陽(yáng)性苗中的L2、L9植株開(kāi)展qRT-PCR檢測(cè)。選擇20 μL 反應(yīng)體系：SYBR green混合物12 μL，模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，ddHO 4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)采用軟件Primer Premier 6.0，引物序列見(jiàn)表1。試驗(yàn)包含3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。結(jié)果使用ABIPRISM7300系統(tǒng)相對(duì)定量分析軟件進(jìn)行分析，采用2法計(jì)算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 抗病性鑒定

按照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行丁香假單胞菌 DC3000菌懸液的制備，用0.2 mmol·L磷酸緩沖液(pH 7.2)將終濃度調(diào)節(jié)到1×10CFU·mL。在擬南芥植株抽薹前用丁香假單胞菌 DC3000菌懸液分別對(duì)準(zhǔn)野生型擬南芥植株(WT)、2455909轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(L2、L9)進(jìn)行噴霧，每株植株噴霧接種量為5 mL，接種后噴水保濕24～48 h。

病情指數(shù)的調(diào)查參照文獻(xiàn)[11]開(kāi)展，按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)菌病害的分級(jí)：植株長(zhǎng)勢(shì)正常、未見(jiàn)到病斑，即0級(jí)；植株病斑大小在葉片總面積中占比為0～25%，即1級(jí)；病斑大小在葉片總面積中占比為25%～50%，即2級(jí)；病斑大小在葉片總面積中占比為50%～75%，即3級(jí)；病斑大小在葉片總面積中占比為75%～100%，即4級(jí)。接種后第2、4、6 天分別調(diào)查病情指數(shù)1次，每次3個(gè)重復(fù)。

植物體內(nèi)菌體數(shù)量統(tǒng)計(jì)：丁香假單胞菌DC3000接種后對(duì)擬南芥植株體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行測(cè)定；測(cè)定方法：葉片稱重后在70%乙醇中浸泡30 s，撈出后無(wú)菌水沖洗30 s，將清洗干凈的葉片放到提前滅好菌的研缽內(nèi)，加入1 mL無(wú)菌水后充分研磨成勻漿，按照梯度法進(jìn)行稀釋、涂平板，置于28 ℃光照培養(yǎng)下，第2、4、6 天分別測(cè)定菌體數(shù)量1次，每次3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 抗病相關(guān)基因表達(dá)

為了對(duì)2455909轉(zhuǎn)基因擬南芥抗病相關(guān)分子作用機(jī)制進(jìn)行研究，選擇丁香假單胞菌DC3000病原菌對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥L2、L9株系開(kāi)展分析，選擇植物防御反應(yīng)中三大主要信號(hào)通路(SA、ET、JA)中抗病相關(guān)基因(1、、1、1)開(kāi)展24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量的分析研究。qRT-PCR檢測(cè)選擇20 μL 反應(yīng)體系：SYBR green混合物10 μL，模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，DEPC處理水6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。選擇了雙內(nèi)參基因，引物及內(nèi)參基因的序列見(jiàn)表2，其余方法參照1.2.5節(jié)。

表2 抗病相關(guān)基因的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理分析，重復(fù)數(shù)據(jù)取平均值，分別比較其在0.05水平上的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)合2455909基因(NP 001131983.1)進(jìn)行其他物種中同源性較高基因的查找，并在MEGA 6.0軟件中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖1， 這些基因都與植物抗病基因1具有一定的同源性，推測(cè)這些基因都屬于抗病類基因。根據(jù)圖1可知，玉米中2455909基因與高粱()中的XP021316871.1基因之間有著更近的同源關(guān)系。利用在線工具GSDS2.0、SMART軟件等進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)圖2可知，2455909基因中含有1個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子(圖2-A)，其編碼的蛋白含有1個(gè)Low complexity region和NB-ARC domain(圖2-B)，屬于抗病基因表達(dá)產(chǎn)物NBS-LRR類蛋白家族。

圖1 GRMZM2G455909同源蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Alignment of homologues amino acid sequences for amino acid sequence coded by GRMZM2G455909 gene

圖2 GRMZM2G455909基因的結(jié)構(gòu)(A)及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)域(B)Fig.2 GRMZM2G455909 gene structure(A) and its coding protein domain(B)

2.2 重組載體的獲取與驗(yàn)證

目的基因經(jīng)過(guò)克隆擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3-A可知，擴(kuò)增出來(lái)的條帶位于2 000～3 000 bp，比較接近目的條帶(2 557 bp)。對(duì)擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、連接載體、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆篩選和質(zhì)粒提取后送到公司測(cè)序，以驗(yàn)證結(jié)果的正確性。由圖3-B可知，重組載體酶切后有與pEASY-Blunt Simple Cloning載體3 900 bp左右、目的片段序列全長(zhǎng)2 557 bp大致相符合的2個(gè)片段，結(jié)合測(cè)序公司的結(jié)果，驗(yàn)證pEASY-2455909重組載體的成功構(gòu)建，可繼續(xù)開(kāi)展后續(xù)過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建。

M1為DL5000 DNA marker；1, 2為基因，CK為pEASY-GRMZM2G455909重組載體；3為雙酶切結(jié)果。M1 was DL5000 DNA marker; 1, 2 were both genes；CK was pEASY-Blunt Simple Cloning vector; 3 was the digestion result of transgenic plants.圖3 GRMZM2G455909基因PCR擴(kuò)增(A)及基因-Blunt Simple雙酶切(B)Fig.3 Electrophoresis result of GRMZM2G455909 gene by PCR amplification(A) and gene-Blunt Simple by double enzyme digestion(B)

2.3 陽(yáng)性苗的驗(yàn)證

用植物基因組提取試劑盒法對(duì)2-455909轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中的基因組DNA進(jìn)行提取，結(jié)合過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301a上的基因序列設(shè)計(jì)出的特異性引物-F和-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)圖4可知，L2、L9的PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出與目的片段大小650 bp大致相符的條帶，結(jié)果驗(yàn)證2株擬南芥為過(guò)表達(dá)2455909的陽(yáng)性植株。

M2為DL2000 DNA marker；L2，L9，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。M2 was DL2000 DNA marker; L2，L9，Transgenic Arabidopsis plants.圖4 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Electrophoresis result of the detection for transgenic positive plants

對(duì)2455909轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗植株的L2、L9株系進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖5。根據(jù)圖5可知，目的基因在擬南芥植株中的表達(dá)量顯著高于WT，其中以L9表達(dá)量更高。

WT, 野生型擬南芥植株；L2，L9，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株；不同的小寫字母表示相對(duì)表達(dá)量在5%水平上差異顯著。WT, Wild Arabidopsis thaliana plant ; L2，L9，Transgenic Arabidopsis plants; Different lowercase letters indicated that the difference of relative expression at 5% level was obvious.圖5 GRMZM2G455909轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗植株的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.5 Verification of transgenic Arabidopsis thaliana positive plants with GRMZM2G455909 gene by qRT-PCR

2.4 抗病性鑒定

通過(guò)對(duì)接種后不同時(shí)間下2個(gè)處理擬南芥生長(zhǎng)情況的調(diào)查，結(jié)果見(jiàn)圖6。根據(jù)圖6-A可知，在接種后第6天，245590轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(L2、L9)的葉片顏色大部分仍然為綠色，病斑數(shù)量、面積相對(duì)于野生型擬南芥少。由此可知，將245590基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中后可在一定程度上提高擬南芥對(duì)丁香假單胞菌DC3000的抗性。對(duì)2455909轉(zhuǎn)基因擬南芥(L2、L9)和野生型擬南芥植株(WT)接種丁香假單胞菌DC3000后第2、4、6天病情指數(shù)的調(diào)查，結(jié)果見(jiàn)圖6-B。根據(jù)圖6-B可知，擬南芥植株接種丁香假單胞菌DC3000 2 d后即開(kāi)始有病害癥狀出現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，245590轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(L2、L9)和野生型擬南芥植株(WT)的病情指數(shù)的變化趨勢(shì)均為緩慢上升，以245590轉(zhuǎn)基因擬南芥病情指數(shù)更低；接種后第2、4、6天，245590轉(zhuǎn)基因擬南芥的L2、L9與野生型擬南芥的病指均差異顯著。由此可知，245590抗性基因?qū)氲綌M南芥植株中后，可以提高植株對(duì)丁香假單胞菌DC3000的抗性、降低病情指數(shù)。

A，為第6 天時(shí)的表型；B，為不同時(shí)間的病情指數(shù)。WT,野生型擬南芥植株；L2，L9，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。B圖中同天不同處理不同的小寫字母表示病指在5%水平上差異顯著。A was the phenotype at the 6 d; B was the disease index at different times. WT, Wild Arabidopsis thaliana plant ; L2，L9，Transgenic Arabidopsis plants.In B, different lowercase letters indicated that the difference of disease index at 5% level was obvious in different treatments on the same day.圖6 接種Pst DC3000后轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)病情況Fig.6 Incidence of transgenic Arabidopsis thaliana plants after inoculated with Pst DC3000

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)2455909基因擬南芥L2、L9和WT接種丁香假單胞菌DC3000后葉片內(nèi)菌體數(shù)量的調(diào)查，結(jié)果見(jiàn)表3。接種丁香假單胞菌DC3000不同時(shí)間后，2455909轉(zhuǎn)基因擬南芥處理葉片內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量均顯著低于野生擬南芥的處理；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，2個(gè)處理葉片內(nèi)細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)表現(xiàn)一致，均為先增加，且在接種后第4天達(dá)到最大值，之后葉片內(nèi)細(xì)菌數(shù)量均開(kāi)始降低。結(jié)果顯示，將2455909基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中后對(duì)病原菌丁香假單胞菌DC3000在擬南芥葉片中的生長(zhǎng)有所影響，進(jìn)而降低葉片內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。

表3 轉(zhuǎn)基因擬南芥接種丁香假單胞菌DC3000后葉片體內(nèi)菌體含量

2.5 抗性相關(guān)基因表達(dá)

由上述結(jié)果可知，2455909基因可以增強(qiáng)擬南芥植株抵抗病原菌DC3000的效果。因此，繼續(xù)開(kāi)展了2455909基因的分子作用機(jī)制方面的研究，以對(duì)其參與的抗病信號(hào)通路予以進(jìn)一步的明確。選擇了擬南芥與SA、ET、JA三大信號(hào)途徑相關(guān)標(biāo)志基因1、、1、1在24 h時(shí)的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。根據(jù)圖7可知，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L9、L2在接種了病原菌丁香假單胞菌DC3000后24 h時(shí)，體內(nèi)的1基因相對(duì)表達(dá)量分別是WT的7.244、5.552倍，差異達(dá)到了極顯著，基因的相對(duì)表達(dá)量分別是WT的1.409、1.680倍，增加趨勢(shì)明顯，1基因的相對(duì)表達(dá)量分別是WT的4.854、2.681倍，而1基因的相對(duì)表達(dá)量與WT相比有明顯的降低。表明了2455909基因?qū)氲綌M南芥植株中可以提高植株的抗病性，可能是與誘導(dǎo)了機(jī)體內(nèi)水楊酸的抗病信號(hào)通路有關(guān)。

WT,野生型擬南芥植株；L2和L9，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。同一基因各處理間沒(méi)有相同小寫字母表示相對(duì)表達(dá)量在5%水平上差異顯著。WT, Wild Arabidopsis thaliana plant ; L2 and L9，Transgenic Arabidopsis plants. Different lowercase letters indicated that the difference of relative expression at 5% level was obvious on the same gene from different treatments.圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of disease resistance related genes for transgenic Arabidopsis thaliana plants

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)基因2455909進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)2455909基因所編碼的蛋白屬于NBS-LRR類蛋白家族。NBS-LRR類蛋白在植物抗病基因中屬于分布最為廣泛、數(shù)量最為龐大的基因家族，分布于植物的各組織中。目前，已經(jīng)克隆的抗病基因中，NBS-LRR類占比超過(guò)80%，調(diào)節(jié)植物面對(duì)各種包括非生物、生物因素在內(nèi)的脅迫反應(yīng)時(shí)作出響應(yīng)。張穎等的研究表明，當(dāng)植物處于誘導(dǎo)狀態(tài)下時(shí)，其體內(nèi)NBS-LRR類基因的表達(dá)量變化明顯；丁玉梅的研究表明，植株內(nèi)NBS-LRR類相關(guān)基因被沉默后，黑籽南瓜植株發(fā)生枯萎病的程度加重；目前已經(jīng)證明編碼NBS-LRR類蛋白家族的基因在擬南芥抗霜霉病、擬南芥抗假單孢菌、水稻抗白葉枯病、番茄抗葉霉病等中發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)2455909轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性開(kāi)展了分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株接種丁香假單胞菌DC3000后，其抗病性顯著增強(qiáng)，此試驗(yàn)結(jié)果與已有報(bào)道一致。此外，該研究?jī)H對(duì)轉(zhuǎn)2455909基因植株對(duì)丁香假單胞菌DC3000這一種病原細(xì)菌的抗病功能方面開(kāi)展了初步研究，而對(duì)其他類型的病原真菌如油菜菌核病病菌、小麥赤霉病病菌等是否有抗病效果，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，在對(duì)該基因開(kāi)展相關(guān)分子特征分析的時(shí)候，該課題組利用生物信息學(xué)方法對(duì)2455909基因編碼蛋白開(kāi)展了亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，以明確該基因編碼蛋白在細(xì)胞中的某個(gè)具體的位置上(包括細(xì)胞核、質(zhì)膜以及細(xì)胞器等)，為開(kāi)展基因作用機(jī)制的研究提供方向。目前有關(guān)NBS-LRR類蛋白的亞細(xì)胞定位相關(guān)研究較多，如王惠梅在研究中發(fā)現(xiàn)，菰植物中1基因編碼的CC-NBS-LRR類抗病蛋白定位在細(xì)胞膜上；馬世偉研究發(fā)現(xiàn)，水稻抗稻瘟病新基因1 編碼的NBS-LRR蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)上。而本試驗(yàn)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，2455909基因編碼的蛋白定位在細(xì)胞外，與相關(guān)研究報(bào)道有所差異。因此，后續(xù)研究將進(jìn)一步通過(guò)膜定位以及核定位研究，對(duì)2455909基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果開(kāi)展驗(yàn)證。

植物內(nèi)基因的數(shù)目眾多，表現(xiàn)出來(lái)的調(diào)控方式多樣。SA(水楊酸)長(zhǎng)期以來(lái)被廣大學(xué)者們認(rèn)為是植物的內(nèi)源信號(hào)分子，植物體內(nèi)的多種抗性能力與SA途徑相關(guān)聯(lián)。Kruse等的研究表明，用煙草花椰病毒對(duì)煙草植株進(jìn)行誘導(dǎo)，抗病品種內(nèi)SA大量積累，而感病品種體內(nèi)SA積累尚未發(fā)現(xiàn)。目前，SA途徑的作用已經(jīng)在煙草、薺菜、向日葵等植物得到了驗(yàn)證。本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因擬南芥受到外源病原菌的誘導(dǎo)，其體內(nèi)SA途徑標(biāo)志基因1 、1的相對(duì)表達(dá)量較野生型顯著增加，因此，推測(cè)245590基因可能是通過(guò)SA途徑參與植物機(jī)體的防御進(jìn)程。后期研究中，針對(duì)性地進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)的 SA含量的測(cè)定，以及外界噴施 SA抑制劑的試驗(yàn)，進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)2455909基因的擬南芥植株發(fā)病情況以及體內(nèi)相關(guān)抗病信號(hào)通路標(biāo)志基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步驗(yàn)證和證明這個(gè)結(jié)論。