丁兆雪，王佳潔，沈中浩，周曉龍，楊松柏，金航峰，趙阿勇，汪 涵

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

近年來(lái)，微小RNA(microRNA， miRNA)在豬肉性狀調(diào)控中的重要作用被大量報(bào)道。此前的研究表明，miR-22可以抑制豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(PMSCs)的增殖，促進(jìn)PMSCs的分化。此外，本研究前期發(fā)現(xiàn)，miR-22在紅肌肌肉中的表達(dá)量要顯著低于白肌肌肉。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-22前體上游序列存在與肉色值(紅度值)極顯著相關(guān)的NC_010454.4：g.47913559 G>A 突變位點(diǎn)，且在不同基因型個(gè)體背最長(zhǎng)肌中miR-22的表達(dá)水平存在顯著差異。因該突變位點(diǎn)臨近豬miR-22前體序列，我們推測(cè)該位點(diǎn)所在片段序列可能對(duì)miR-22的表達(dá)起到重要調(diào)控作用，可能是影響豬肉色性狀的一個(gè)重要遺傳標(biāo)記。

CRISPR/Cas9 技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，在豬肌肉相關(guān)基因功能及育種應(yīng)用相關(guān)研究中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)已成功對(duì)豬肌肉生長(zhǎng)抑制素MSTN基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，同時(shí)出現(xiàn)了經(jīng)典的雙肌臀表型。此外在中國(guó)藍(lán)塘豬胎兒成纖維細(xì)胞中應(yīng)用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)2基因進(jìn)行精確編輯，成功獲得了低背膘厚、高瘦肉率的豬只。本研究通過(guò)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)豬miR-22前體上游包含NC_010454.4：g.47913559 G>A 位點(diǎn)的一段序列進(jìn)行編輯，構(gòu)建了豬miR-22前體序列上游基因突變的豬腎細(xì)胞(PK15)模型，來(lái)探究豬miR-22前體上游序列對(duì)miR-22表達(dá)的影響，為后續(xù)進(jìn)一步探明該片段序列在豬肉色性狀調(diào)控中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用的pX459載體及豬PK15細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；氨芐青霉素(Ampr)、青鏈霉素混合液均購(gòu)自于Solarbio公司；嘌呤霉素(Puromycin dihydrochloride)購(gòu)自MCE公司；胰酶(0.25% Trypsin-EDTA 1X)、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自于Thermo Fisher公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自于HyClone公司；RNA提取TRIzon Reagent、pMD19-T載體、PrimescriptRT-PCR Kit(RR014a)均購(gòu)自于TaKaRa公司；T4 PNK酶、T4 DNA連接酶、Ⅰ酶均購(gòu)自于NEB公司；定量試劑盒EvaGreen 2×qPCR Master Mix購(gòu)自蘇州愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 sgRNA序列設(shè)計(jì)與合成

在E-CRISP Design網(wǎng)站(http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)設(shè)計(jì)靶向豬miR-22前體上游突變位點(diǎn)NC_010454.4：g.47913559 G>A所在一段序列的兩條sgRNA，在sgRNA的上下游5′端分別加上Ⅰ酶切位點(diǎn)的黏性末端(CACC/AAAC)，由杭州有康生物技術(shù)有限公司合成(表1)。取sgRNA上下游各1 μL(100 mmol·L)，10×T4 Ligation Buffer(NEB) 1 μL，T4 PNK酶(NEB) 0.5 μL，加去離子水將反應(yīng)體系配至10 μL，短暫離心后在PCR儀中37 ℃反應(yīng)1 h，95 ℃ 5 min，后以0.1 ℃·s降至25 ℃，使其形成雙鏈sgRNA，立刻使用或-20 ℃保存。

表1 sgRNA序列信息

1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建

將退火形成的雙鏈sgRNA稀釋成100 μmol·L工作液，取工作液1 μL與經(jīng)Ⅰ酶切的pX459質(zhì)粒16 ℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取200 μL菌液涂布于含1 μg·mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落接種于含1 μg·mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床過(guò)夜。菌液送至杭州擎科生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。選擇正確的單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒提取質(zhì)粒，立刻使用或-20 ℃保存。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和最適嘌呤霉素致死濃度測(cè)定

將PK15細(xì)胞從液氮中取出，在37 ℃恒溫水浴鍋中緩慢搖晃解凍，加入1 mL含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基并混勻，1 200 r·min離心5 min，去上清。再次加入9 mL含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PK15細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞匯和度長(zhǎng)至80%～90%，分別更換含0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5 μg·mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞死亡情況，取篩選4 d后細(xì)胞全部死亡的嘌呤霉素濃度，作為轉(zhuǎn)染后的加藥濃度。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性克隆篩選及驗(yàn)證

將PK15細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合到80%～90%，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，將每孔2 μg質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，更換含有1.5 μg·mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，用于篩選成功轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞。篩選4 d后換正常完全培養(yǎng)基，恢復(fù)生長(zhǎng)，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后收集細(xì)胞，一部分用于提取基因組DNA，另一部分液氮凍存并編號(hào)。通過(guò)Primer Premier.5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增包含豬miR-22前體上游突變位點(diǎn)NC_010454.4：g.47913559 G>A所在序列的引物，引物序列為F：5′-CCCCAGAGACCCCCAAAA-3′，R：5′-GGGCAGAGGGCAACAGTT-3′。隨后將PCR擴(kuò)增后的目的片段，按以下體系與T載體連接，目的片段 3 μL，pMD 19-T載體 0.5 μL，Solution I 5 μL，去離子水1.5 μL，短暫離心后在PCR儀中16 ℃反應(yīng)4 h。連接好的T載體經(jīng)過(guò)DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，涂板后隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 qRT-PCR檢驗(yàn)miR-22表達(dá)量

將測(cè)序后發(fā)現(xiàn)存在突變的PK15細(xì)胞和野生型PK15細(xì)胞復(fù)蘇，置于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度長(zhǎng)至80%～90%，使用Trizol法提取細(xì)胞RNA，用Agilent 2100生物分析儀系統(tǒng)(Agilent Technologies，USA)測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度。采用莖環(huán)法設(shè)計(jì)豬miR-22的定量引物，引物主要包括miR-22特異性反轉(zhuǎn)錄引物，上游引物和下游引物(表2)。根據(jù)TaKaRa RR014a反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。10 μL qRT-PCR反應(yīng)體系為：EvaGreen 2×qPCR Master Mix 5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.3 μL，Reverse Primer 0.3 μL，cDNA 3.5 μL，去離子水 0.9 μL；qRT-PCR程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。采用 2-△△C法計(jì)算miR-22的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶向豬miR-22前體上游序列的pX459-sgRNA重組載體的構(gòu)建

將轉(zhuǎn)化后的pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2選取單菌落進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)后，結(jié)果顯示，2條sgRNA均成功插入pX459載體(圖1)，表明靶向miR-22前體上游序列的pX459-sgRNA重組載體構(gòu)建成功。

a， pX459-sgRNA1靶點(diǎn)； b， pX459-sgRNA2靶點(diǎn)。a， Target of pX459-sgRNA1； b， Target of pX459-sgRNA2.圖1 重組載體pX459-sgRNA的鑒定Fig.1 Identification of recombinant vector pX459-sgRNA

2.2 PK15細(xì)胞嘌呤霉素最適致死濃度篩選

使用嘌呤霉素處理野生型PK15細(xì)胞，結(jié)果顯示，處理4 d后致死細(xì)胞的最低濃度為1.5 μg·mL(圖2)，可將該濃度作為后續(xù)細(xì)胞篩選濃度。

表2 miR-22莖環(huán)RT-PCR相關(guān)引物

圖2 不同濃度嘌呤霉素處理PK15細(xì)胞(96 h)Fig.2 PK15 cells treated with different concentrations of puromycin (96 h)

2.3 PK15編輯細(xì)胞模型的鑒定

培養(yǎng)pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2轉(zhuǎn)染后的PK15細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組DNA，PCR擴(kuò)增miR-22前體上游序列片段，使用DNAMAN8.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示，共挑取的81個(gè)陽(yáng)性克隆中，共檢測(cè)到6種突變類(lèi)型(圖3)，突變率達(dá)60.49%(表3)。

紅色為Cas9識(shí)別位點(diǎn)PAM，紫色為突變堿基。1～6代表突變類(lèi)型。Red was Cas9 recognition site PAM， purple was mutant base.1-6 were mutations.圖3 基因編輯后PK15細(xì)胞miR-22前體上游序列測(cè)序分析Fig.3 Sequencing of miR-22 precursor up-stream sequence of PK15 cells after gene editing

表3 基因編輯后PK15細(xì)胞miR-22前體上游序列突變比率

2.4 豬miR-22前體上游序列突變對(duì)miR-22表達(dá)量的影響

定量檢測(cè)野生型PK15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pX459-sgRNA1和pX49-sgRNA2后的PK15細(xì)胞中miR-22的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，miR-22和U6定量熔解曲線均只有單峰存在，引物特異性強(qiáng)，產(chǎn)物單一(圖4)。與野生型相比，基因編輯后的PK15細(xì)胞中，miR-22的表達(dá)量極顯著下調(diào)(圖4)。這表明，豬miR-22前體上游序列片段發(fā)生突變可有效地抑制miR-22的表達(dá)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，豬miR-22基因位于其宿主基因2的第2外顯子內(nèi)， 而本研究編輯的序列片段臨近miR-22 前體序列，位于2內(nèi)含子區(qū)，屬于非編碼序列(圖5)。

A， miR-22相對(duì)表達(dá)量； B， miR-22熔解曲線； C， U6熔解曲線。** 表示差異極顯著(P<0.01)。A， Relative expression of miR-22； B， Dissociation curve of miR-22； C， Dissociation curve of U6. ** indicated the difference was significant (P<0.01).圖4 qRT-PCR檢測(cè)基因編輯后PK15細(xì)胞中miR-22的表達(dá)量Fig.4 Expression of miR-22 was detected by qRT-PCR after gene editing in PK15 cells

圖5 編輯的靶向序列與豬miR-22前體序列位置關(guān)系Fig.5 Position relationship between edited target sequence and porcine miR-22 precursor sequence

3 結(jié)論與討論

Cas9能將融合蛋白及RNA結(jié)合在任何雙鏈DNA序列處，這一特殊功能給生物體功能研究和改造帶來(lái)巨大貢獻(xiàn)。本研究在豬miR-22前體上游序列片段的上下游各構(gòu)建了一個(gè)pX459-sgRNA質(zhì)粒。研究表明，采用雙重sgRNA-CRISPR/Cas9敲除策略能有效地提高編輯效率，結(jié)合非同源末端連接(NHEJ)使得編輯過(guò)的細(xì)胞能夠穩(wěn)定遺傳。Bonafont等采用雙重sgRNA-CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了敲除率達(dá)到66.5%的71基因突變小鼠。在本研究中，在編輯的17組細(xì)胞中，有15組的編輯效率≥50%。同時(shí)，在本研究選取的81個(gè)陽(yáng)性克隆中，miR-22前體上游序列的敲除率為60.49%。這表明，本研究針對(duì)miR-22前體上游序列片段設(shè)計(jì)的2條sgRNA能有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的編輯。

已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA基因序列遺傳變異的出現(xiàn)可能會(huì)影響miRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，繼而影響其靶向mRNA的功能變化，最后導(dǎo)致個(gè)體表型性狀發(fā)生變異。因此，越來(lái)越多的研究也開(kāi)始通過(guò)檢測(cè)miRNAs基因上存在的突變，來(lái)分析其與豬主要經(jīng)濟(jì)性狀間的關(guān)聯(lián)性。例如，Lei等發(fā)現(xiàn)miR-27a基因中的T>C突變與大白豬產(chǎn)仔數(shù)性狀存在相關(guān)，并可能用作育種程序中產(chǎn)仔數(shù)性狀的選育標(biāo)記。在豬 miR-206上發(fā)現(xiàn)存在SNP 與滴水損失、背膘以及瘦肉率等肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-133b上同樣存在SNP與肌纖維總數(shù)，眼肌面積及肌肉pH值顯著關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，編輯后的細(xì)胞中miR-22的表達(dá)量相對(duì)于野生型細(xì)胞下調(diào)了約50%，豬miR-22前體上游序列片段發(fā)生突變會(huì)影響miR-22的表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，本研究編輯的序列片段位于miR-22宿主基因2基因內(nèi)含子區(qū)，屬于非編碼序列(圖5)。此前的研究表明，內(nèi)含子可作為增強(qiáng)子或啟動(dòng)子元件發(fā)揮作用，位于內(nèi)含子區(qū)的 SNP 也可以影響內(nèi)含子的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子活性進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。此外，內(nèi)含子還能影響mRNA剪接、RNA 折疊/加工，進(jìn)而影響RNA轉(zhuǎn)錄水平。因此，我們推測(cè)本研究所靶向編輯的序列片段可能存在調(diào)控下游miR-22表達(dá)的調(diào)控元件，但其作用機(jī)制仍有待深入研究。

綜上，本研究證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能在豬PK15細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-22所在基因的高效編輯，該模型也為下一步對(duì)該序列片段在豬肉色性狀調(diào)控中發(fā)揮的作用機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)。