大蒜己糖激酶基因AsHXK2的克隆及其參與根際促生菌緩解干旱脅迫的表達(dá)分析

郭春倩 ，田 潔，2，*

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院， 青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016； 2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016)

干旱作為限制糧食安全和植物生產(chǎn)力的主要因素之一，對農(nóng)作物的生長發(fā)育及產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。干旱脅迫會導(dǎo)致作物細(xì)胞脫水，阻礙細(xì)胞擴(kuò)張，導(dǎo)致水勢降低、膨壓損失、氣孔關(guān)閉、膜完整性破壞以及蛋白質(zhì)變性。根際促生菌(PGPR)作為一種生活在土壤或附生于根系的一類細(xì)菌，具有促進(jìn)植物生長及礦質(zhì)營養(yǎng)吸收，并提高植物抗逆能力的作用。已有研究證明，由根際微生物誘導(dǎo)的植物耐旱性可通過分泌親水性胞外多糖(EPS)途徑，賦予生物膜結(jié)構(gòu)和許多功能，且胞外多糖的分解能夠有效增強(qiáng)寄主植物適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境或地理分布的能力，使寄主植物具有更大的適應(yīng)性優(yōu)勢，以確保植物在干旱脅迫條件下的生存。

己糖激酶(HXK)是一種雙功能蛋白，在高等植物體內(nèi)以多基因家族形式存在，具有磷酸化己糖關(guān)鍵性作用，為植物的生長發(fā)育提供能量。另外，HXK在植物介導(dǎo)糖信號中具有重要作用。作為糖傳感蛋白，參與糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，感知脅迫、光照、激素和養(yǎng)分等條件，進(jìn)而調(diào)控植株的基因表達(dá)與生長發(fā)育。目前已從葡萄、枸杞、茶樹、蘋果等植物中成功克隆出基因，并發(fā)現(xiàn)不同植株中其家族成員數(shù)目各不相同，如在單子葉植物水稻有11個(gè)家族成員，模式植物擬南芥中有6個(gè)家族成員，番茄中有4個(gè)家族成員，不同植物的基因家族成員在不同生長發(fā)育時(shí)期及器官表達(dá)特性各異。其中2基因作為第一個(gè)被鑒定出的植物基因之一，經(jīng)驗(yàn)證在多數(shù)植物中均有存在。目前對植物己糖激酶的研究主要集中于基因在植物生長發(fā)育過程中的作用，關(guān)于其在抗逆脅迫方面的研究則相對較少。因此，研究己糖激酶相關(guān)基因，明確其功能，對揭示植物抗逆機(jī)制具有重要意義。

大蒜(L.)，百合科蔥屬一、二年生草本植物，是世界范圍廣泛栽培的藥食兼用蔬菜。因其原產(chǎn)地土壤中水分含量較高，因此形成根系小，入土淺，分布范圍窄，根毛極少，所以大蒜根對水分要求嚴(yán)格，反應(yīng)敏感。目前有關(guān)大蒜基因克隆及其參與根際促生菌緩解干旱脅迫的表達(dá)研究尚未見到報(bào)道。本研究以樂都紫皮大蒜為材料，基于大蒜轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，克隆出大蒜2的開放閱讀框全長，并分析了大蒜在干旱脅迫下根際促生菌處理下2的表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究大蒜2的功能及大蒜己糖代謝機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為青海省主栽品種樂都紫皮大蒜，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝所提供。供試促生菌菌株為惡臭假單胞菌()UW4，由加拿大滑鐵盧大學(xué)提供。

1.2 促生菌懸浮液的制備

惡臭假單胞UW4接種于LB液體培養(yǎng)液中，在30 ℃搖床上以160 r·min振蕩培養(yǎng)至=0.6(菌落數(shù)達(dá)10CFU·mL)，菌懸液于3 000 r·min離心5 min收集菌體，棄上清。菌體用無菌ddHO清洗2次后，將沉淀于管底的菌體重新懸浮，并保持原有菌液濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將解除休眠的樂都紫皮大蒜播種于含有基質(zhì)(草炭∶珍珠巖體積比1∶1)的盆缽中，并置于植物光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件25 ℃/15 ℃(14 h/10 h，白天/黑夜)，空氣相對濕度為70%。培養(yǎng)至大蒜幼苗長至10～12 cm，選取長勢一致、健壯的大蒜幼苗進(jìn)行不同處理。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：CK，以300 mL蒸餾水澆透盆缽，培養(yǎng)條件不變，每5 d澆一次水；PGPR，將制備好的300 mL菌懸液以灌根的方式澆入盆缽，培養(yǎng)條件不變，每5 d澆一次水；DT，300 mL蒸餾水澆透盆缽后進(jìn)行干旱脅迫處理，參照課題組前期研究通過停止?jié)菜M(jìn)行人工控水，保持空氣相對濕度30%，處理結(jié)束時(shí)土壤達(dá)中度干旱(土壤相對濕度為50%左右)；DTP，300 mL菌懸液澆透盆缽后進(jìn)行干旱脅迫處理，通過停止?jié)菜?、保持空氣相對濕?0%，使土壤達(dá)中度干旱(土壤相對濕度為50%左右)。處理15 d進(jìn)行采樣，取3次重復(fù)，分別采取大蒜葉片、假莖、鱗芽以及根系，液氮速凍后立即置于-80 ℃冰箱進(jìn)行保存，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 總RNA提取與cDNA合成

將上述4個(gè)不同處理的大蒜葉片、假莖、鱗芽和根系材料利用天根總RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，通過諾禾HonorⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒對所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以備后續(xù)2基因克隆。

1.4.2 大蒜2基因的克隆

根據(jù)大蒜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未公布)，查找得到大蒜己糖激酶基因2基因序列。并設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物，引物序列為AsHXK2-F(5′-ATGATGTCCAAGAAAGCGGCT-3′)和AsHXK2-R(5′-TCAGGGCTCTTCGACTCCAAT-3′)。并以處理0 d樂都紫皮大蒜根系單鏈cDNA作為模板，使用2X-酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、目的條帶回收純化、連接至PMD19-T載體、轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞后，送至北京六合華大基因科技有限公司測序，取適量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板于LB+氨芐青霉素(Amp)的固體培養(yǎng)基，隨機(jī)挑選陽性單克隆測序，獲得目的序列。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收，與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α中，陽性克隆。

1.4.3 序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得水稻等其他植物的HXK2序列。利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對和蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析；采用ExPaSy(https：//web.expasy.org/protparam/)軟件對氨基酸基本成分、蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析；跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位預(yù)測分別采用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Softberry(http：//linux1.softber-ry.com/berry.phtml？topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)在線軟件進(jìn)行網(wǎng)上運(yùn)行分析；利用SOPMA軟件分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)；通過Phyre 2軟件預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index)；使用NCBI中的BlastP(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線比對，在蛋白質(zhì)保守區(qū)數(shù)據(jù)庫中對AsHXK2進(jìn)行預(yù)測蛋白質(zhì)保守區(qū)；使用MEGA 6.0軟件對系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行測試和編輯，生成報(bào)告圖形。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)按照試劑盒操作說明在Roche LightCycler480 Ⅱ上進(jìn)行。以大蒜基因?yàn)閮?nèi)參基因，其引物為CYP-F：5′-AAGGACGAGAACTTCATC-3′，CYP-R：5′-TCAATATCTCTCACCACTTC-3′。根據(jù)克隆得到的己糖激酶基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)檢測引物AsHXK2-F：5′-CACCAACACCTCCCTAAAG-3′和AsHXK2-R：5′-CATACAAGCCACCATCCAT′，目的基因與內(nèi)參基因一起擴(kuò)增。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以大蒜基因作為定量表達(dá)分析的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔC法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜己糖激酶基因AsHXK2的克隆與序列分析

以大蒜品種樂都紫皮大蒜的葉片cDNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后得到1條長度約為1 500 bp的片段(圖1)。經(jīng)測序表明，2基因ORF全長序列為1 500 bp，編碼499個(gè)氨基酸(圖2)。用NCBI中的CD-Search對2基因編碼蛋白中可能存在的結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2 000 bp)。M， DNA marker (2 000 bp).圖1 大蒜AsHXK2基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 AsHXK2 gene amplified by RT-PCR from garlic

圖2 大蒜AsHXK2基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequences and predicted amino acid sequences of AsHXK2 gene from garlic

2.2 大蒜AsHXK2蛋白的理化性質(zhì)分析

ExPaSy-ProtParam預(yù)測結(jié)果表明，AsHXK2蛋白分子式為CHNOS，分子量為57.77 ku，理論等電點(diǎn)為6.37，親水性平均系數(shù)為-0.048，是一個(gè)穩(wěn)定性蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)為36.64)。SignaIP 3.0 Server預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白無信號肽，不屬于分泌型蛋白；TMHMM預(yù)測該蛋白有一個(gè)跨膜螺旋區(qū)(圖3)。AsHXK2蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明：該蛋白定位于葉綠體的可能性較大。

圖3 大蒜AsHXK2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.3 Prediction of the transmembrane domain of AsHXK2 protein

2.3 大蒜AsHXK2的氨基酸親水性和疏水性預(yù)測

通過DNAMAN7.0對大蒜AsHXK2基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行親水性/疏水性分析。結(jié)果表明(圖4)，該蛋白的第432位賴氨酸(Lys)親水性最強(qiáng)；疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第250位的亮氨酸(Leu)，其次為第24位的亮氨酸(Leu)。

圖4 大蒜AsHXK2氨基酸序列的疏水性和親水性分析Fig.4 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of amino acid sequences of AsHXK2 from garlic

2.4 大蒜AsHXK2的蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA對AsHXK2蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖5-A所示，AsHXK2的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(47.09%)、延伸結(jié)構(gòu)(13.63%)、β-轉(zhuǎn)角(5.41%)和無規(guī)則卷曲(33.87%)構(gòu)成。利用Phyre 2軟件進(jìn)行同源建模，并通過PyMOL軟件分析蛋白三級結(jié)構(gòu)(圖5-B)，其結(jié)果顯示AsHXK2蛋白模型構(gòu)建基于模板c4qs9A，可信度100%，覆蓋率為90%，且大蒜AsHXK2蛋白的三維結(jié)構(gòu)由19個(gè)α-螺旋和14個(gè)β-折疊所構(gòu)成。

圖5 AsHXK2蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary and tertiary structure prediction of AsHXK2 protein

2.5 大蒜AsHXK2的保守域分析

在NCBI保守域數(shù)據(jù)庫中將大蒜AsHXK2的氨基酸序列進(jìn)行Blast比對(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，其包含一個(gè)氮端核苷酸結(jié)合域-糖激酶-熱休克蛋白-激動蛋白(N-teraminal nucleotide binding domain-sugar kinase-heat shock protein-actin ， NBD-sugar-kinase-HSP70-actin)以及一個(gè)己糖激酶特異位點(diǎn)，這些結(jié)果表明，AsHXK2屬于己糖激酶2家族。

圖6 大蒜AsHXK2氨基酸序列保守域預(yù)測Fig.6 Prediction of conserved domain of amino acid sequences of AsHXK2 from garlic

2.6 大蒜AsHXK2的進(jìn)化樹分析

利用MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法

將大蒜與其他12種不同植物的己糖激酶2(HXK2)構(gòu)建同源進(jìn)化樹(圖7)。結(jié)果顯示，大蒜AsHXK2與天門冬科蘆筍、禾本科的大麥HXK2在進(jìn)化上屬于同一個(gè)分支，且與蘆筍在進(jìn)化關(guān)系上最為接近。

圖7 AsHXK2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of AsHXK2 amino acid sequence

2.7 大蒜AsHXK2基因在不同組織表達(dá)分析及干旱脅迫下根際促生菌處理的響應(yīng)分析

通過qRT-PCR對2基因在樂都紫皮大蒜不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果(圖8)表明，在正常條件下2基因在大蒜葉、假莖、根和鱗芽中均有表達(dá)，其中，在鱗芽中表達(dá)水平最高，其次是假莖和葉，在根中表達(dá)水平最低，各組織間表達(dá)量存在顯著差異。鱗芽2基因表達(dá)量較葉、根和假莖分別提高了4.08倍、9.20倍和4.15倍。

不同處理間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。The bars with different letters showed the significant difference (P<0.05). The same as below.圖8 不同大蒜組織AsHXK2基因表達(dá)量Fig.8 AsHXK2 gene expression in different tissues of garlic

由圖9可知，不同處理均可以顯著誘導(dǎo)或抑制2基因的表達(dá)，且不同組織變化趨勢各不相同。圖9-A顯示，與對照相比，干旱脅迫及促生菌處理(PGPR、DT、DTP)均能顯著增加葉中2的表達(dá)量，PGPR、DT、DTP下基因表達(dá)量分別比對照升高了1.71倍、1.92倍和2.21倍。同時(shí)，施加促生菌能夠顯著提高干旱脅迫下2表達(dá)水平，與DT相比，DTP使2表達(dá)量增幅10%；與大蒜葉片不同，根中2表達(dá)量僅在干旱脅迫處理(DT)顯著高于對照，PGPR、DTP與對照無顯著差異，同時(shí)DTP顯著低于DT(圖9-B)；與大蒜葉片類似，假莖2表達(dá)量在PGPR、DT、DTP處理中分別比對照升高了1.48倍、1.88倍、1.28倍，且三者無顯著差異(圖9-C)；而在大蒜鱗芽中，不同處理下2的表達(dá)趨勢與其他組織存在明顯差別，DT、DTP處理的2表達(dá)量顯著低于對照，二者分別比對照降低了43%和45%，DT和DTP差異不顯著(圖9-D)。綜上，干旱脅迫顯著上調(diào)了大蒜葉片、根以及假莖中2的表達(dá)水平，顯著下調(diào)了鱗芽中2的表達(dá)量。而促生菌僅能顯著誘導(dǎo)干旱脅迫下葉片的2表達(dá)，即大蒜葉片2對干旱脅迫及促生菌處理的響應(yīng)較為明顯。

A，葉；B，根；C，假莖；D，鱗芽。A， Leaf； B， Root； C， Pseudostem； D， Scale bud.圖9 不同處理下各大蒜組織AsHXK2基因表達(dá)量Fig.9 AsHXK2 gene expression in various tissues of garlic under different treatments

3 討論與結(jié)論

生長在青海東部的作物經(jīng)常遭受到干旱脅迫的影響，尤其大蒜作為東部農(nóng)業(yè)區(qū)的主產(chǎn)作物之一，其產(chǎn)量及品質(zhì)極易受到影響，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致植株死亡。植物體中正常的代謝是植株正常生長發(fā)育的基礎(chǔ)，在逆境下其生長發(fā)育會受到嚴(yán)重影響。有研究表明，根際促生菌在增加植物吸收營養(yǎng)及增強(qiáng)植物的適應(yīng)性等方面發(fā)揮重要作用，主要通過植物激素含量的改變、抗氧化防御、生產(chǎn)滲透劑和產(chǎn)生胞外多糖等方式改善、減輕干旱脅迫對植株造成的影響，維持植株正常生長。其中植物己糖激酶是具有磷酸化己糖和介導(dǎo)糖信號的關(guān)鍵性作用，源庫組織內(nèi)，由淀粉和蔗糖產(chǎn)生的葡萄糖和果糖，經(jīng)HXK磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸，進(jìn)而參與糖酵解、呼吸作用、分解與合成等代謝過程，為植物的生理活動提供能量和中間代謝產(chǎn)物，進(jìn)而調(diào)控植株的基因表達(dá)與生長發(fā)育。因此，研究HXK不僅有利于闡明植糖己糖激酶相關(guān)基因表達(dá)水平及其抵御逆境脅迫的分子機(jī)制，也對改善干旱脅迫下大蒜植株的生存能力具有實(shí)際生產(chǎn)意義。本研究利用團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建的大蒜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，克隆得到大蒜2基因，并利用生物信息學(xué)方法對其性質(zhì)和功能進(jìn)行了分析。其ORF全長為1 500 bp，編碼499個(gè)氨基酸，分子量為57.77 ku，理論等電點(diǎn)為6.37；亞細(xì)胞定位預(yù)測AsHXK2蛋白定位于葉綠體的可能性比較大，但其在細(xì)胞中具體位置需進(jìn)一步試驗(yàn)證明；保守域分析顯示，2基因所推導(dǎo)的氨基酸屬于己糖激酶家族。因此，克隆大蒜2基因?yàn)槠涔δ苎芯考按笏饪鼓嫫贩N育種改良提供新的基因資源。

目前，已有多種植物的己糖激酶基因被克隆，并發(fā)現(xiàn)該基因在植物抵御逆境過程中具有重要的功能。己糖激酶基因在植物代謝及生長發(fā)育中起著不可替代的作用，其在植物生長不同階段和不同組織中表達(dá)量具有差異。如木薯2在不同組織中均有表達(dá)，其中木薯葉、莖和花的表達(dá)量最高，且各發(fā)育時(shí)期的木薯2表達(dá)水平明顯不同，塊莖初期和膨大階段的基因表達(dá)量顯著高于成熟塊莖。在本研究中，2基因在大蒜葉、假莖、根、鱗芽不同組織中均有表達(dá)，且鱗芽2表達(dá)量最高，分別比葉、根和假莖提高了4.08倍、9.20倍和4.15倍。這與木薯2的組織表達(dá)特異性并不相同，說明不同作物間己糖激酶基因的組織表達(dá)存在差異。另外，研究表明，不利環(huán)境下通過差異表達(dá)來響應(yīng)逆境脅迫，如擬南芥2會受到干旱、鹽和低溫的顯著誘導(dǎo)；高粱1-5在干旱處理后，表達(dá)水平明顯上調(diào)，而鹽脅迫下1、7出現(xiàn)階段性降低趨勢。本研究為解析大蒜不同組織的2在促生菌及干旱脅迫下的響應(yīng)情況，對4種處理后該基因的表達(dá)量進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果表明，干旱處理下葉片、假莖及根系的2表達(dá)量較對照顯著提高了1.92倍、1.88倍、0.90倍，這可能是因?yàn)楦珊得{迫介導(dǎo)了碳水化合物對氣孔的調(diào)節(jié)作用，通過增加2表達(dá)量來提高植物水分利用效率；而鱗芽2表達(dá)水平在干旱脅迫顯著降低，這可能是是由于干旱脅迫阻礙了光合作用，使得大蒜葉片糖類物質(zhì)合成減少，而干旱脅迫程度的加重，鱗芽中貯藏的糖類營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，致使己糖激酶底物含量減少，故其表達(dá)量顯著降低。與干旱處理相比，促生菌能顯著提高干旱脅迫下大蒜葉片2的表達(dá)水平，這在一定程度上提高了大蒜葉片組織對干旱的抗性。與葉片不同，DTP處理的根系2表達(dá)量較DT顯著降低，這可能是因?yàn)榇偕置诘陌舛嗵?，促使根系己糖激酶通過磷酸化作用，將外源多糖轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的糖，胞外多糖的轉(zhuǎn)化過程需要大量的HXK2，使己糖激酶活性下降。即促生菌產(chǎn)生的胞外多糖與己糖激酶存在反饋抑制調(diào)節(jié)關(guān)系，通過下調(diào)2表達(dá)來參與干旱響應(yīng)，為保證大蒜根系在干旱脅迫下正常的水分運(yùn)輸，故促生菌處理后通過降低根系2表達(dá)量參與干旱響應(yīng)。說明2在干旱脅迫和促生菌處理下具有明顯的組織特異性，且葉片2對促生菌緩解干旱脅迫的響應(yīng)較為明顯。綜上可知，2基因在大蒜抵御干旱脅迫過程中發(fā)揮重要作用，且根際促生菌能夠通過調(diào)節(jié)2基因表達(dá)量在一定程度上增強(qiáng)大蒜植株的抗旱性，這為進(jìn)一步探討己糖激酶基因參與根際促生菌緩解干旱脅迫的調(diào)控作用機(jī)制提供參考。