系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎猅淋巴細胞PD-1和Tim-3表達和意義①

羅 清 黃自坤 李 雪 李俊明（南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，南昌 330006）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種多因素自身免疫病，嚴重危害人類健康，其特征為出現(xiàn)多種自身抗體（anti-dsDNA、anti-Sm、anti-nucleosome等），補體活化和免疫復(fù)合物沉積造成多個組織器官損傷，進而出現(xiàn)多樣化的臨床癥狀［1］。臨床研究證實，雖然目前出現(xiàn)新型的生物制劑和更有效的SLE治療策略，但其緩解率仍不高，造成這種狀況的原因之一是SLE病因及發(fā)病機制尚未完全被解析。研究表明，T淋巴細胞在多個方面參與SLE發(fā)病過程［2-4］。

近年來，共刺激分子在SLE免疫應(yīng)答中的作用受到研究者極大關(guān)注，尤其是PD-1（programmed death 1）和Tim-3（T cell Ig and mucin domaincontaining molecule 3）。一方面有證據(jù)顯示，SLE患者免疫細胞上異常表達的PD-1可參與疾病的發(fā)生發(fā)展［5-7］；另一方面研究表明，異常表達的Tim-3參與SLE致病［8-9］。近期，有研究者提出，腫瘤浸潤T淋巴細胞上共表達PD-1與Tim-3的百分比與腫瘤的侵襲表型和腫瘤大小有關(guān)［10］。此外，有研究顯示，PD-1和Tim-3中位數(shù)以上的共表達可增加復(fù)發(fā)風險，且36個月的總生存率較差［10］。目前，對于SLE患者T淋巴細胞表面上PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3-的表達情況，以及PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3-表達與臨床指標的相關(guān)性尚不清楚。本研究通過檢測SLE患者和健康對照者外周血T淋巴細胞表面PD-1和Tim-3的共表達（包括平均熒光強度和百分比），分析其與自身抗體、實驗室指標、臨床表現(xiàn)、治療的關(guān)系，探討PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3-T淋巴細胞在SLE中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料41例SLE患者來自于南昌大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科2017年6月至2017年12月就診的患者，其中男3例，女38例，平均年齡（40.0±15.6）歲，臨床診斷符合美國風濕病學會（ARA）1997年修訂的分類標準，并排除糖尿病、心腦血管疾病、血栓性疾病等其他嚴重疾病患者。健康對照組33例，均為健康志愿者，排除其他自身免疫性疾病和炎癥，男2例，女31例，平均年齡（41.0±9.8）歲。SLE疾病組與健康對照組（HC）年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。詳細收集SLE患者臨床資料及相關(guān)實驗室檢查數(shù)據(jù)，并計算其SLE疾病活動指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）。本實驗經(jīng)南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑和儀器流式細胞抗體異硫氰酸熒光素標記的PD-1抗體（fluorescein isothiocyanate-PD-1，F(xiàn)ITC-PD-1）和藻紅蛋白標記的Tim-3抗體（phycoerythrin-Tim-3，PE-Tim-3）購自美國eBioscience公司；藻紅蛋白-得克薩斯紅標記的CD3抗體（phycoerythrintexas red，ECD-CD3）及相應(yīng)的同型對照PEIgGl、FITC-IgGl和ECD-IgGl均購自美國Beckman-Coulter公司；Cytomics FC 500流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；分析軟件為儀器自帶的CXP分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 SLE治療41例SLE患者中6例治療前抽取空腹EDTA抗凝靜脈血用于流式細胞術(shù)檢測。SLE患者根據(jù)病情嚴重程度選取治療方案：①病情輕度活動（SLEDAI＜9分）者用潑尼松或糖皮質(zhì)激素+羥氯喹/甲氨蝶呤/來氟米特治療；②病情中度活動（SLEDAI 10～14分）者用糖皮質(zhì)激素+環(huán)磷酰胺/霉酚酸酯治療；③病情重度活動（SLEDAI≥15分）者先用糖皮質(zhì)激素沖擊加環(huán)磷酰胺，再按病情中度活動治療方案治療。入選的6例SLE患者至少治療1周后抽取患者空腹EDTA抗凝靜脈血用于流式細胞檢測。

1.2.2 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）提取采集SLE患者和健康對照者2 ml清晨空腹EDTA抗凝外周血，6 h內(nèi)送檢。采用密度梯度離心法分離獲取PBMC，把分離獲取的PBMC用生理鹽水洗滌后重懸備用。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測人外周血CD3+T淋巴細胞PD-1和Tim-3表達各取100μl重懸的PBMC加入2支試管，分別加入3種單克隆抗體FITC-PD-1、ECD-CD3、PE-Tim-3和相應(yīng)的同型對照各10μl，4℃避光孵育30 min，加入1 ml生理鹽水，室溫1 500 r/min離心5 min，棄上清，生理鹽水洗滌1次，用500μl生理鹽水重懸上機檢測；Cytomics FC 500流式細胞儀進行分析，CXP分析軟件檢測CD3+T淋巴細胞PD-1和Tim-3表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理分析運用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行描述和分析。首先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗，否則采用非參數(shù)檢驗。兩變量相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。SLE患者治療前后以配對t檢驗分析組間差異，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者組和健康對照組外周血T淋巴細胞PD-1和Tim-3表達水平比較采用流式細胞術(shù)分別檢測T淋巴細胞（CD3+）PD-1和Tim-3的表達水平，結(jié)果如圖1所示，SLE患者組PD-1+T淋巴細胞百分比顯著高于健康對照組，分別為（33.77±17.59）%和（22.76±12.87）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.0，P=0.004）；SLE患者組T淋巴細胞PD-1表達的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）顯著高于健康對照組，分別為3.19±2.02和1.71±0.34，差異有統(tǒng)計學意義（U=110.5，P＜0.001）；SLE患者組Tim-3+T淋巴細胞百分比顯著高于健康對照組，分別為（8.03±12.41）%和（2.21±3.22）%，差異有統(tǒng)計學意義（U=325.5，P＜0.001）；SLE患者組和健康對照組的T淋巴細胞Tim-3表達的MFI分別為3.22±2.43和2.86±1.69，差異無統(tǒng)計學意義（U=557.5，P=0.198）。

2.2 SLE患者組和健康對照組外周血PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及其PD-1、Tim-3表達MFI比較根據(jù)T淋巴細胞上PD-1和Tim-3表達可將其分為3群，分別為PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞。如圖2所示，SLE患者組PD-1+Tim-3-T淋巴細胞百分比顯著高于健康對照組，分別為（31.80±16.02）%和（21.97±12.26）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.9，P=0.005）；SLE患者組PD-1+Tim-3+T淋巴細胞百分比顯著高于健康對照組，分別為（4.00±6.26）%和（0.62±1.05）%，差異具有統(tǒng)計學意義（U=247.0，P＜0.001）；SLE患者組PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比顯著高于健康對照組，分別為（4.18±7.34）%和（1.55±2.49）%，差異具有統(tǒng)計學意義（U=403.5，P=0.003）。進一步分析這3群細胞PD-1和Tim-3表達的MFI，發(fā)現(xiàn)SLE患者組PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達的MFI顯著高于健康對照組，分別為3.06±1.93和1.68±0.31，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.9，P＜0.001）；而PD-1+Tim-3+T淋巴細胞PD-1、Tim-3表達的MFI和PD-1-Tim-3+T淋巴細胞PD-1表達的MFI差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 SLE患者組PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與自身抗體的關(guān)系SLE患者血清中可出現(xiàn)anti-dsDNA、anti-Sm、anti-nucleosome、anti-SSA、anti-Ro52、anti-RIB-P等自身抗體，分析SLE患者組PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及其PD-1、Tim-3表達MFI與SLE患者自身抗體的關(guān)系表明：如圖3所示，anti-nucleosome陽性的SLE患者PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI明顯高于陰性者，分別為4.41±3.01和2.51±0.67，差異有統(tǒng)計學意義（U=72.0，P=0.005）；anti-Ro52陽性的SLE患者PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比明顯高于陰性者，分別為（5.85±9.31）%和（1.99±1.98）%，差異有統(tǒng)計學意義（U=121.5，P=0.044）；而未見以上指標與其他自身抗體存在關(guān)系。

圖1 SLE患者和健康對照組外周血T淋巴細胞PD-1和Tim-3表達Fig.1 Expressions of PD-1 and Tim-3 on peripheral T lymphocyte from SLE patients and HC

2.4 SLE患者組PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI相關(guān)性分析將能反映SLE疾病嚴重程度和活動性的相關(guān)指標（SLEDAI、ESR、CRP、IgG、C3、C4、WBC、RBC、RDW、HGB、HCT、PLT、MPV、PCT、PDW、L、L%、M、M%、N、N%、NLR、PLR、LMR等）與SLE患者PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI進行相關(guān)性分析，如圖4所示，PD-1+Tim-3+T淋巴細胞百分比與L呈負相關(guān)（rs=-0.404，P=0.009）；PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與WBC（rs=-0.399，P=0.010）、RBC（rs=-0.615，P＜0.001）、HGB（rs=-0.571，P＜0.001）、HCT（rs=-0.602，P＜0.001）、L（rs=-0.403，P=0.009）、N（rs=-0.348，P=0.026）、C3（rs=-0.400，P=0.011）、C4（rs=-0.324，P=0.041）呈負相關(guān)，與PLR（rs=0.369，P=0.018）、RDW（rs=0.318，P=0.043）呈正相關(guān)。而未發(fā)現(xiàn)PD-1+Tim-3-、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比與以上指標相關(guān)。

圖2 SLE患者和健康對照組外周血PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及其PD-1、Tim-3表達MFI水平Fig.2 Percentage of PD-1+Tim-3-，PD-1+Tim-3+，PD-1-Tim-3+T lymphocyte and MFI of PD-1，Tim-3 on these cells from SLE patients and HC

圖3 PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與自身抗體的關(guān)系Fig.3 Correlation of MFI of PD-1 on PD-1+Tim-3-T lymphocyte in SLE patients with autoantibody

圖4 PD-1+Tim-3+T淋巴細胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與SLE患者實驗室指標的關(guān)系Fig.4 Correlation of percentage of PD-1+Tim-3+T lymphocyte，MFI of PD-1 on PD-1+Tim-3-T lymphocyte in SLE patients with laboratory index

圖5 PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與SLE患者臨床表現(xiàn)的關(guān)系Fig.5 Correlation of MFI of PD-1 on PD-1+Tim-3-T lymphocyte in SLE patients with clinical features

2.5 SLE患者組PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與臨床表現(xiàn)的關(guān)系分析SLE患者組PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與臨床表現(xiàn)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，如圖5所示，低紅細胞血癥組SLE患者PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI明顯高于陰性者（U=61.0，P＜0.001）；貧血組SLE患者PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI明顯高于陰性者（U=68.0，P=0.002）。并未發(fā)現(xiàn)PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比與臨床表現(xiàn)相關(guān)。

2.6 SLE患者組PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與治療的關(guān)系6例SLE患者根據(jù)正規(guī)治療至少1周后，比較治療前后SLE患者組PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比及其PD-1、Tim-3表達MFI水平，如圖6所示，治療后SLE患者PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI明顯低于治療前，差異具有統(tǒng)計學差異（U=68.0，P=0.031），而未見其他指標與治療存在關(guān)系。

3 討論

SLE是一種病因與發(fā)病機制不明的自身免疫性疾病。PD-1和Tim-3是近年來受廣大研究者關(guān)注的兩種新型負性共刺激分子，已有研究表明PD-1、Tim-3均在SLE發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但對于PD-1和Tim-3共表達在SLE中的作用卻鮮有報道。本研究同時對SLE患者和健康對照者外周血T淋巴細胞表面PD-1和Tim-3表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納入分析的兩組研究對象外周血T淋巴細胞表面總PD-1和Tim-3的表達水平均不相同，SLE組患者T淋巴細胞PD-1（百分比和MFI）和Tim-3（百分比）表達水平顯著高于健康對照組；SLE組患者PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴細胞百分比以及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達的MFI顯著高于健康對照組，且SLE組患者PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達的MFI水平與抗體含量呈正相關(guān)，提示PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達的MFI水平越高，患者體內(nèi)的自身抗體越多，SLE病情越活躍。進一步研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達的MFI水平與WBC、RBC、HGB、HCT、L、N、C3、C4呈負相關(guān)，與PLR、RDW呈正相關(guān)，且與SLE患者的臨床表現(xiàn)和治療相關(guān)。

圖6 PD-1+Tim-3-T淋巴 細胞PD-1表達MFI與SLE患者治療的關(guān)系Fig.6 Correlation of MFI of PD-1 on PD-1+Tim-3-T lymphocyte in SLE patients with treatment

Tim-3是細胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細胞因子，表達于多種免疫細胞表面。已有研究表明SLE患者外周血淋巴細胞Tim-3表達明顯升高，且與疾病嚴重程度及INF-γ表達相關(guān)［11-12］。亦有研究表明SLE患者血清和單個核細胞Tim-3表達明顯降低，且與疾病嚴重程度呈負相關(guān)［13-14］。以上研究表明，雖然Tim-3參與SLE致病，但其功能涉及的機制并不一致。而本研究表明SLE患者外周血淋巴細胞總Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3+T淋巴細胞百分比明顯升高，但Tim-3表達的MFI在疾病組與健康對照組間并未存在差異。已有研究證實Tim-3陽性的CD4/CD8/CD14等免疫細胞百分比在SLE中存在差異，但并未顯示Tim-3表達的MFI情況，有可能是Tim-3表達的MFI差異無統(tǒng)計學意義，與本文研究結(jié)論一致［8-9，11］；但也有可能是研究者并未分析CD4/CD8/CD14等免疫細胞MFI是否存在差異，而本文僅研究總CD3+T細胞上的Tim-3表達情況，因此有必要進一步探討各T細胞亞群中Tim-3表達MFI。此外，本研究并未發(fā)現(xiàn)總Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3+T淋巴細胞百分比與SLE患者的疾病嚴重程度存在明顯相關(guān)性。因此，Tim-3在SLE中的具體機制還需進一步研究。

PD-1作為一種負性共刺激分子，可向免疫細胞傳導(dǎo)負性信號，抑制T細胞增殖和細胞因子分泌參與SLE致?。?5］；也可作為輔助性T細胞上的功能分子促進B細胞、漿細胞活化增殖以及致病性自身抗體的產(chǎn)生，從而參與SLE致病［16］。本研究綜合分析SLE患者外周血T淋巴細胞PD-1和Tim-3共表達情況發(fā)現(xiàn)總PD-1+、PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+T淋巴細胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達的MFI明顯升高，且升高的PD-1+Tim-3-T淋巴細胞PD-1表達MFI與自身抗體、疾病嚴重程度、臨床表現(xiàn)以及治療呈正相關(guān)，表明T細胞上高表達的PD-1并非以負性共刺激分子發(fā)揮抑制作用，而是以其他方式參與SLE發(fā)病。

近期，有研究表明共表達共刺激分子PD-1和Tim-3的腫瘤浸潤T淋巴細胞與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)［10，17-18］。本研究首次探討SLE患者外周血T淋巴細胞PD-1和Tim-3的共表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-1+Tim-3+T淋巴細胞百分比明顯高于健康對照組，且升高PD-1+Tim-3+T淋巴細胞百分比與L呈負相關(guān)，表明PD-1和Tim-3的共表達可能與淋巴細胞的耗竭有關(guān)，但具體作用機制還需進一步探索。