林濤，李夢霞，郭瑾，陳靜，李茂萱，李彥剛，劉宏程

(1.云南省農業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所，昆明 650205；2.云南工商管理學院醫(yī)學院，昆明 650106；3.云南省農業(yè)科學院茶葉研究所，昆明 650205)

綠茶是中國的主產(chǎn)茶葉之一，具有抗氧化[1]、提高免疫力[2]、抗癌[3]、防輻射[4]、抗菌[5]等多種保健功效。近年來，健康保健食品日趨受到公眾青睞，綠茶消費量逐年上升。隨著綠茶需求量的增大，以往小規(guī)模的種植模式已遠遠不能滿足目前需求。隨著種植面積的擴大和產(chǎn)量的提高，化學農藥在綠茶種植中的使用量也逐漸增大，綠茶中的部分農藥殘留會對人體造成潛在的威脅[6-7]。

毒死蜱和唑蟲酰胺是兩種高效的殺蟲劑，在茶葉種植過程中使用較多，在綠茶產(chǎn)品中的檢出率也較高[8-9]。目前毒死蜱因其在蔬菜中超標率較高且有中等毒性，在我國被禁止使用，而毒死蜱和唑蟲酰胺在茶葉中均可使用，但基于毒死蜱的中等毒性[10]和唑蟲酰胺對水生生物的強毒性[11]，我國食品中農藥最大殘留限量標準(GB 2763—2021)[12]對茶葉中毒死蜱和唑蟲酰胺最大殘留限量進行了嚴格規(guī)定。

在GB 2763—2021 中，茶葉中毒死蜱的推薦測定方法為氣相色譜-質譜聯(lián)用法，唑蟲酰胺的推薦檢測方法為液相色譜-串聯(lián)質譜法。由于綠茶中的化學成分較多，基質復雜，在農藥測定過程中常出現(xiàn)較強的基質效應，導致綠茶中相關農藥的準確定量難度增大[13]。通常情況下，在樣品處理過程中，加入同位素內標可以減小基質效應[14]，但同位素內標通常價格較高且不常見；將提取液稀釋后測定也能在一定程度上降低基質效應，但是隨著稀釋倍數(shù)的增大，分析靈敏度隨之降低[15]。目前，較為有效的方法是在測定時，采用基體標準物質作為質量控制手段[16-17]，但是目前綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺的基體標準物質的研制在國內屬于空白?；诖?，筆者研制綠茶毒死蜱和唑蟲酰胺基體標準物質，為綠茶中農藥含量測定、測定值溯源等提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

三重四極桿串聯(lián)質譜儀：API4000 型，美國AB Sciex 公司。

超高效液相色譜儀：1290 型，美國安捷倫科技有限公司。

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 型，50 mm×1 mm，1.7 μm，美國Waters 公司。

氣相色譜-三重四極桿質譜儀：7000D 型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：XSR225DU/AC 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多科技(中國)有限公司。

乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇：色譜純，德國默克公司。

無水MgSO4、乙酸鈉、NaCl、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物：分析純，北京國藥集團化學試劑有限公司。

乙酸、甲酸、乙酸銨：色譜純，迪馬科技（天津）有限公司。

陶瓷均質子、ProElut C18、PSA、GCB 填料(Φ50 μm)：迪馬科技（天津）有限公司。

毒死蜱標準物質：100 μg/mL，標準物質編號為GBW(E)082239，江蘇壇墨質檢科技股份有限公司。

唑蟲酰胺標準物質：100 μg/mL，標準物質編號為A17591500ME-100，德 國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

毒死蜱原藥：有效成分質量分數(shù)為97%，批號為PD20121017，江蘇常隆農化有限公司。

唑蟲酰胺原藥：有效成分質量分數(shù)為98%，批號為PD20190042，山東海利爾化工有限公司。

實驗用水：純凈水，杭州娃哈哈公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠茶中毒死蜱、唑蟲酰胺基質樣品的制備

選取健康的茶樹20 棵，將毒死蜱和唑蟲酰胺原藥用水稀釋后，按照有效成分質量濃度為1 mg/L 進行噴灑，分別于采收前20 天和10 天各噴灑一次，采收鮮葉5 kg，按照綠茶的加工工藝，即經(jīng)過采青、萎凋、殺青、揉捻、干燥等步驟后制成成品茶，粉碎后過孔徑180 μm 篩(80 目)后，充分攪拌3 次以上使其混勻，即得。

1.2.2 基體標準物質樣品的分裝

采用50 mL 的HDPE 塑料小瓶進行分裝，每瓶分裝10 g，共分裝100 瓶，室溫下避光貯存。

1.2.3 基體標準物質樣品的均勻性檢驗

從分裝好的樣品中按照隨機取樣的原則抽取10 瓶，每瓶稱取3 份，每份2 g 進行測定，按照GB 23200.121—2021 中測定方法進行測定，測定結果用F檢驗進行均勻性檢驗。

1.2.4 基體標準物質樣品短期穩(wěn)定性考察

將樣品分別置于4、20、40 ℃恒溫箱中(模擬運輸條件)保存，分別在第0、3、5、7、14 天進行監(jiān)測，每份樣品測定5 次，用測量平均值作為測定結果。用t檢驗對測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 基體標準物質樣品長期穩(wěn)定性考察

選取第0、1、3、6、12 個月取樣檢測。每次取兩瓶樣品，每個樣品稱取3 份，每份樣品測定5 次，以平均值為測定結果。用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 基體標準物質的定值

(1)定值方法。毒死蜱液相色譜-串聯(lián)質譜法[19]定值；唑蟲酰胺分別采用文獻[19-20]樣品處理方法，利用氣相色譜-質譜法[21]進行測定。

(2)實驗室聯(lián)合定值。選取代表性的相關檢測機構8 家，采用標準方法[19]，分別對樣品中的毒死蜱和唑蟲酰胺的含量進行測定。隨機抽取24 瓶樣品，每個定值實驗室3 瓶，每瓶平行測定2 次。

2 結果與討論

2.1 均勻性檢驗結果

均勻性檢驗方法參照國家標準GB/T 15000.3—2008[18]。利用F檢驗確定綠茶樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺均勻性檢驗質量分數(shù)及方差分析結果分別見表1、表2。

表1 綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺均勻性檢驗質量分數(shù)測定結果 mg/kg

表2 綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺均勻性檢驗測定數(shù)據(jù)方差分析結果

由表2 可知，組間自由度υ1=9，組內自由度υ2=20，查F界值表得F0.05(9，20)=2.39。經(jīng)計算，毒死蜱F=1.49，唑蟲酰胺F=1.22，F(xiàn)＜F0.05(9，20)，表明所制備的標準物質樣品是均勻的。

2.2 短期穩(wěn)定性檢驗結果

根據(jù)標準要求[18]，按照1.2.4 方法進行標準物質樣品的短期穩(wěn)定性檢驗，并對檢驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，毒死蜱和唑蟲酰胺含量測定值及統(tǒng)計結果分別見表3 和表4。由表4 可知，該標準物質樣品短期穩(wěn)定性良好。

表3 短期穩(wěn)定性檢驗質量分數(shù)測定結果 mg/kg

表4 短期穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果

2.3 長期穩(wěn)定性檢驗結果

根據(jù)標準[18]要求，按照1.2.5 方法進行標準物質樣品的長期穩(wěn)定性檢驗并對檢驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，毒死蜱和唑蟲酰胺含量測定值及統(tǒng)計結果分別見表5、表6。由表6 可知，該標準物質樣品長期穩(wěn)定性良好。

表5 長期穩(wěn)定性檢驗質量分數(shù)測定結果 mg/kg

表6 毒死蜱和唑蟲酰胺長期穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果

2.4 定值結果

2.4.1 基體標準物質樣品的定值結果

8 家實驗室對標準物質樣品中毒死蜱和唑蟲酰胺的聯(lián)合定值結果見表7。

表7 毒死蜱和唑蟲酰胺聯(lián)合定值質量分數(shù)測定結果 mg/kg

采用格拉布斯檢驗法對表7 測定結果進行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值，測定結果呈正態(tài)分布，按照標準的相關規(guī)定進行結果計算[18]，毒死蜱和唑蟲酰胺聯(lián)合定值結果數(shù)據(jù)見表8。

表8 毒死蜱和唑蟲酰胺聯(lián)合定值結果

2.4.2 定值不確定度計算

使用的電子天平分辨率為0.000 01 g，最大允許誤差為0.000 10 g，按均勻分布，k= 3，儀器產(chǎn)生的不確定度：

依據(jù)測定結果，綠茶中毒死蜱的標準值為0.295 mg/kg，擴展不確定度為0.027 mg/kg(置信區(qū)間為95%，k=2)。

(2)唑蟲酰胺的定值不確定度。唑蟲酰胺均勻性檢驗的不確定度ubb=0.004 mg/kg，短期穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度：

依據(jù)上述測定結果，綠茶中唑蟲酰胺的標準值為0.373 mg/kg，擴展不確定度為0.023 mg/kg(置信區(qū)間為95%，k=2)。

3 結語

研制了綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺基體標準物質，其中毒死蜱的標準值為0.295 mg/kg，擴展不確定度為0.027，唑蟲酰胺的標準值為0.373 mg/kg，擴展不確定度為0.023(置信區(qū)間為95%，k=2)。該標準物質的均勻性較好，在4、20、40 ℃溫度下14 天內短期穩(wěn)定性較好，室溫下12 個月的長期穩(wěn)定性較好，符合基體標準物質的要求。