盛輝，郭益文，張林林，李新，丁向彬，郭宏

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

肌肉生長(zhǎng)抑制素Myoststin（MSTN），簡(jiǎn)稱肌抑素（Growth differentiation factor-8，GDF-8），屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor，TGF-β）超家族成員[1-2]。MSTN表達(dá)降低或部分、完全缺失會(huì)促進(jìn)骨骼肌發(fā)育，其過(guò)表達(dá)會(huì)阻礙機(jī)體骨骼肌生長(zhǎng)[3-4]。人們構(gòu)建的敲除MSTN基因小鼠[5]、大鼠[6]、狗[7]、兔[8]和豬[9]的動(dòng)物機(jī)體都出現(xiàn)雙肌現(xiàn)象（Double muscle phenomenon，DMP）。同時(shí)，研究表明，MSTN在脂肪形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用[10]。

脂肪作為生物三大營(yíng)養(yǎng)素之一，是用來(lái)儲(chǔ)存體內(nèi)多余能量、調(diào)節(jié)熱量代謝的。哺乳動(dòng)物體內(nèi)脂肪組織因脂肪細(xì)胞來(lái)源、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞組成和功能等不同，可分為白色脂肪和棕色脂肪[11]。白色脂肪是儲(chǔ)能組織，以合成和儲(chǔ)存三酰甘油的形式儲(chǔ)存能量，在食物缺乏的情況下將儲(chǔ)存的能量分解供能[12]。體內(nèi)白色脂肪堆積過(guò)多可引起肥胖等相關(guān)性疾病。而棕色脂肪是耗能組織，參與非寒戰(zhàn)性產(chǎn)熱和食物誘導(dǎo)性產(chǎn)熱以抵抗低溫和肥胖，二者共同維持機(jī)體能量代謝平衡。

本研究基于MSTN-/-魯西黃牛與野生型魯西黃牛、MSTN-/-蒙古牛與野生型蒙古牛和MSTN-/-蒙古黑牛與野生型蒙古黑牛腿臀肌肌肉組織高通量蛋白質(zhì)組學(xué)與磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，通過(guò)生物信息學(xué)分析和組織甘油三酯測(cè)定，探究MSTN對(duì)骨骼肌脂肪代謝的影響，為深入解析MSTN對(duì)骨骼肌脂肪代謝的調(diào)控機(jī)制研究補(bǔ)充新的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的試驗(yàn)動(dòng)物為3 頭MSTN-/-蒙古牛、3 頭野生蒙古牛、3 頭MSTN-/-魯西黃牛、3頭野生型魯西黃牛、3 頭MSTN-/-蒙古黑牛和3 頭野生型蒙古黑牛。這18 頭牛均飼喂于內(nèi)蒙古大學(xué)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中心農(nóng)場(chǎng)，飼喂條件一致。利用活體采樣的方法采集試驗(yàn)動(dòng)物的腿臀肌組織，PBS 清洗，放入凍存管中，做好標(biāo)記，放入液氮中保存。

1.1.2 主要試劑

PMSF（北京索萊寶生物科技有限公司）、磷酸酶抑制劑（北京索萊寶生物科技有限公司）、RIPA（北京索萊寶生物科技有限公司）、組織細(xì)胞甘油三酯酶法測(cè)定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）、PBS 溶液（北京索萊寶生物科技有限公司）、BCA 試劑盒（北京康為公司）、TMT-6 plex標(biāo)記試劑盒和緩沖液（Applied Biosystems）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

低溫冷凍干燥機(jī)（Thermo Fisher）、色譜分離系統(tǒng)（Agilent）、高效液相色譜（Applied Biosystems ）、串聯(lián)質(zhì)譜分析儀（Applied Biosystems）、強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱（Zorbax Bio-SCX）、脫鹽柱（Michrom Bioresources）、C18AQ 反相分離柱（Michrom Bioresources）、HPLC 系統(tǒng)（Agilent）、酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）、恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取

從液氮中取出凍存的樣品組織，用研缽磨成粉末狀，移入新的1.5 mL 無(wú)酶離心管中，加入配制好的蛋白裂解液（1 mL RIPA，10 μL PMSF，10 μL磷酸酶抑制劑），冰浴10 min，4 ℃ 12 000 g 離心10 min，取上清保存于-80 ℃ 24 h，隨后凍干成粉末狀保存。

1.2.2 TMT 標(biāo)記蛋白樣

凍干蛋白樣用磷酸鹽緩沖液重溶后，加入2%SDS 溶液變性，用三（2-羰基乙基）磷鹽酸鹽TCEP還原，用甲基硫代磺酸甲酯（MMTS）封閉半胱氨酸殘基，用胰蛋白酶37 ℃消化過(guò)夜。使用TMT-6 plex 試劑標(biāo)記消化了的肽段，并對(duì)其進(jìn)行脫鹽處理，樣品真空干燥。

1.2.3 強(qiáng)陽(yáng)離子柱分離肽段

將TMT 6-plex 標(biāo)記的胰蛋白酶肽樣品混勻上樣，在214 nm 波長(zhǎng)下以1 min 間隔收集混合成若干組分，從每個(gè)組分中取出10%用于后續(xù)LCMS/MS 分析。

1.2.4 LC-MS/MS 分析

使用PepMap C-18 反向納米柱完成肽段吸附、除鹽和分離過(guò)程，并使用Analyst 1.6 軟件（Sciex）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.2.5 生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)與分析

利用在線網(wǎng)站及軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)和分析，以便了解MSTN的生物學(xué)意義。Perseus 1.5.3.2軟件用于對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出差異蛋白和磷酸化蛋白。DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）用于蛋白登錄號(hào)轉(zhuǎn)換和差異蛋白GO注釋和 KEGG 途徑分析。KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）用于差異蛋白富集信號(hào)通路分析。STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）可用于蛋白間互作分析。UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）用于檢索蛋白的功能以及蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)換。

1.2.6 肌肉組織中甘油三酯測(cè)定

利用試劑盒檢測(cè)樣品組織中甘油三酯含量。從液氮中取出保存的肌肉組織，對(duì)其精確稱重，用研缽將組織磨成粉末，按每1 mg 組織加入20 μL裂解液的比例加入裂解液，渦旋震蕩，室溫靜置10 min。取適量上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中，室溫2 000 r/min 離心5 min，上清液即可用于酶學(xué)測(cè)定，剩余組織裂解液用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定組織蛋白濃度。配制好工作液及稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，在酶標(biāo)板中加入待測(cè)樣品，37 ℃反應(yīng)15 min，將結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油三酯濃度，最后以每mg 蛋白濃度校正組織中甘油三酯含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果

通過(guò)Perseus 1.5.3.2 軟件分析以及UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索蛋白質(zhì)功能，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果中大量差異蛋白與脂肪代謝過(guò)程相關(guān)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1、表2 和表3。

表1 MSTN-/-蒙古牛與野生蒙古牛數(shù)據(jù)中與脂肪代謝相關(guān)差異蛋白

表2 MSTN-/-魯西黃牛與野生魯西黃牛數(shù)據(jù)中與脂肪代謝相關(guān)差異蛋白

表3 MSTN-/-蒙古黑牛與野生蒙古黑牛數(shù)據(jù)中與脂肪代謝相關(guān)差異蛋白

2.2 KEGG 通路和STRING 蛋白互作分析

將這些差異蛋白輸入DAVID 6.8、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要富集在脂肪酸代謝和PPAR 信號(hào)通路上，結(jié)果見(jiàn)圖1。并將三組數(shù)據(jù)中與脂肪代謝相關(guān)的蛋白輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析蛋白間互作，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 差異蛋白富集脂肪酸代謝通路圖

圖2 差異蛋白PPI 分析結(jié)果

2.3 組織甘油三酯測(cè)定結(jié)果

用試劑盒檢測(cè)組織中甘油三酯含量，并以每mg 蛋白濃度校正甘油三酯含量。結(jié)果見(jiàn)圖3，與各個(gè)品種野生牛相比，MSTN-/-蒙古牛肌肉組織中甘油三酯含量無(wú)明顯差異，MSTN-/-魯西黃牛肌肉組織中甘油三酯含量極顯著下降，MSTN-/-蒙古黑牛肌肉組織中甘油三酯含量顯著下降。

圖3 肌肉組織中甘油三酯含量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

脂肪組織不僅是機(jī)體的能量?jī)?chǔ)存庫(kù)，還可能作為最大的內(nèi)分泌器官，通過(guò)分泌多種因子調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)、食欲、免疫等多種生物過(guò)程[13]。多項(xiàng)研究表明，肌肉生長(zhǎng)抑制素MSTN在脂肪形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用[10]。敲除MSTN基因的動(dòng)物肌肉組織中脂肪膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平（FAT/CD36，F(xiàn)ABP3，F(xiàn)ATP1 和FATP4）降低，這與脂質(zhì)氧化途徑（檸檬酸合酶和β-HAD 活性）降低相關(guān)，同時(shí)脂肪形成受損（甘油三酯和游離脂肪酸含量降低）[14]。敲除MSTN的飼喂高脂飲食（HFD）的小鼠組織脂肪酸氧化增強(qiáng)，產(chǎn)熱增加，最終導(dǎo)致脂肪利用增加和脂肪組織減少，從而防止飲食誘發(fā)的肥胖[15]。小鼠敲除MSTN基因后顯著影響了肌肉組織細(xì)胞中線粒體的功能，增強(qiáng)了線粒體中脂肪酸的β氧化，抑制了三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化過(guò)程[16]。并且本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)與磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因敲除能夠促進(jìn)脂肪酸在線粒體中的β氧化過(guò)程，加強(qiáng)糖酵解過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)了糖原分解[17-18]。

本研究通過(guò)對(duì)MSTN-/-牛與野生牛腿臀肌肌肉組織蛋白質(zhì)組學(xué)與磷酸化組學(xué)分析以及對(duì)肌肉組織甘油三酯檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲除MSTN基因脂肪酸代謝增強(qiáng)，肌肉組織中甘油三酯含量降低。本研究結(jié)果與前述敲除MSTN基因小鼠脂肪酸β氧化增強(qiáng)、脂肪組織減少的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究利用敲除MSTN的蒙古牛、魯西黃牛和蒙古黑牛與野生的蒙古牛、魯西黃牛和蒙古黑牛腿臀肌肌肉組織作為試驗(yàn)樣品，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)與磷酸化組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)大量差異蛋白富集在脂肪酸代謝信號(hào)通路，同時(shí)對(duì)肌肉組織進(jìn)行甘油三酯含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲除MSTN基因牛骨骼肌中甘油三酯含量降低。研究結(jié)果為接下來(lái)進(jìn)一步探討MSTN對(duì)牛骨骼肌代謝機(jī)制的相關(guān)研究提供一定參考。