氨氮降解菌株的篩選及降解性能研究

張國(guó)偉，靳靜晨，李晨晨，高宇軒，高雅娟，張聞天，靳永勝*

1.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院，北京102206；

2.北京環(huán)氧環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司，北京100101

目前，我國(guó)氨氮污染排放量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出受納水體的環(huán)境容量，氨氮指標(biāo)已超過化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）指標(biāo)成為影響地表水環(huán)境質(zhì)量的首要指標(biāo)［1］，且大量研究表明，氨氮指標(biāo)超標(biāo)會(huì)使江河湖泊水體逐漸富營(yíng)養(yǎng)化［2-5］。為防止水體環(huán)境不斷惡化，國(guó)家對(duì)主要污染物，如氮、磷的排放制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，目前生物除氮因具有低耗、高能、可持續(xù)性強(qiáng)等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于污水處理廠［6］。

科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)了大量具有氨氮降解能力的菌株，如假單胞菌（Pseudomonassp.）［7-10］、糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）［11］、芽 孢 桿 菌（Bacillussp.）［12］、酵母［13-14］等。目前越來越多的真菌被證實(shí)同樣具有去氮的能力，如李偉斯［15］從河流底泥中篩選出1株鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌，其能夠利用多種有機(jī)碳源進(jìn)行生長(zhǎng)和反硝化；楊曉華［16］從焦化廢水處理單元活性污泥中篩選出1株鐮刀菌屬（Fusariumspp.）絲狀真菌，具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，初始濃度為450 mg·L-1氨氮的去除率為94.75%。劉志云［17］從雞糞中篩選出1株擬宛氏青霉菌HL，在初始氨氮濃度為300 mg·L-1時(shí)，菌株HL的氨氮降解率為80.53%；戚文靜等［18］從活性污泥中篩選出1株Galactomyces屬的菌株AD-7，初始氨氮濃度291.16 mg·L-1，接種量2.21%時(shí)氨氮降解率預(yù)測(cè)值為100%，實(shí)測(cè)值仍可達(dá)到99%；曾忠強(qiáng)等［19］將白腐真菌絲狀生物膜固定在中空的脈管載體上，構(gòu)建的新型白腐真菌反應(yīng)器可以控制氣泡和廢水流完成18批次（共進(jìn)行401 d）的垃圾滲濾液連續(xù)處理，氨氮含量指標(biāo)（ammonia nitrogen content index，NH3-N）和COD去除率分別達(dá)83%～97%和56%～74%。本研究從垃圾滲濾液中分離篩選出1株具有降解高氨氮能力的真菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子鑒定，并分析了該菌的氨氮降解特性，旨在為污水中去除氨氮提供安全、有效、經(jīng)濟(jì)的功能菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 由北京南宮垃圾堆肥廠的垃圾滲濾液中篩選出1株具有氨氮降解能力的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基配比 富集培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO42.0 g·L-1，F(xiàn)eSO·47H2O 0.4 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，MgSO·47H2O 0.5 g·L-1，其余為去離子水，pH為7.2～7.4。

分 離 培 養(yǎng) 基：葡 萄 糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO42.0g·L-1，F(xiàn)eSO·47H2O 0.4 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，MgSO·47H2O 0.5 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，其余為去離子水。

篩 選 培 養(yǎng) 基：葡 萄 糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO40.6 g·L-1，NaCl 1.0 g·L-1，F(xiàn)eSO·47H2O 0.05 g·L-1，K2HPO40.5g·L-1，MgSO·47H2O 0.25g·L-1，其余為去離子水。

1.1.3 主要試劑與儀器 納氏試劑購(gòu)于河南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心；酒石酸鉀鈉、過硫酸鉀、葡萄糖、蔗糖、紅糖、可溶性淀粉、硫酸銨、七水合硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂以及其他主要試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上藥品均為分析純。DJS-2013R-2恒溫?fù)u床購(gòu)于上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YP30002電子天平購(gòu)于上海越平科學(xué)儀器蘇州制造有限公司；UV-5500紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)于上海元析儀器有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)于日本SANYO公司；22331離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；LBY純水儀購(gòu)于北京龍碧源水處理設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離純化和篩選 取滲濾液10 mL，接種于100 mL滅菌后的富集培養(yǎng)基中，充分搖勻，在溫度為30℃、轉(zhuǎn)速180 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)，富集7 d，每隔1 d補(bǔ)加0.5 g（NH4）2SO4。富集后經(jīng)梯度稀釋均勻涂布于分離培養(yǎng)基的平板上，在30℃培養(yǎng)箱倒置恒溫培養(yǎng)，挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行重復(fù)分離純化，直至得到單一菌株，命名為Z-5。

1.2.2 菌株的分子鑒定 利用TIAGEN真菌試劑盒提取菌株Z-5的DNA，然后以其DNA為模版、以27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）與1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）為引物，采用PCR儀擴(kuò)增其內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）序列，擴(kuò)增后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，利用測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，并用MEGA 5.0做系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 單一因素最優(yōu)條件試驗(yàn) 將菌株Z-5接種于100 mL篩選培養(yǎng)基中，置于30℃下、180 r·min-1搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h取樣測(cè)定其氨氮濃度，其中不同的培養(yǎng)條件設(shè)置如下。①不同接種量：接種量分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，氨氮初始濃度為100 mg·L-1，碳源為葡萄糖，pH為6.0，培養(yǎng)時(shí)間為5 d；②不同初始氨氮濃度：氨氮濃度分別為100、250、500、750、1 000 mg·L-1，接種量為1%，碳源為葡萄糖，pH為6.0，培養(yǎng)時(shí)間為7 d；③不同碳源：碳源分別為葡萄糖、蔗糖、紅糖、可溶性淀粉，接種量為1%，氨氮濃度為100 mg·L-1，pH為6.0，培養(yǎng)時(shí)間為3 d；④不同pH：pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接種量為1%，氨氮初始濃度為100 mg·L-1，碳源為紅糖，培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

1.2.4 正交試驗(yàn) 以100 mg·L-1氨氮為初始氮源，設(shè)計(jì)L（933）正交試驗(yàn)，3個(gè)因素分別為A：氨氮初始濃度；B：碳源；C：pH（表1）。

表1 因素水平表Table 1 The factors and levels scale

1.2.5 氨氮檢測(cè)方法將待測(cè)樣品用去離子水稀釋到合適的倍數(shù)，然后用納氏試劑分光光度法進(jìn)行氨氮的測(cè)定。氨氮具體測(cè)定方法參考Fei等［12］納氏試劑分光光度法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

觀察菌株Z-5在固體分離培養(yǎng)基的菌落形態(tài)，該菌株為乳白色圓形，表面不光滑，著生菌絲。增殖后菌株由乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t褐色且有菌絲分布于培養(yǎng)基中。該菌屬于真菌界，菌株Z-5在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)如圖1所示，帚狀枝雙輪生，?；枯?～5個(gè)；瓶梗每輪4～6個(gè)；分生孢子橢圓形，經(jīng)常呈長(zhǎng)鏈狀。

圖1 菌株Z-5在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)Fig.1 Morphology of strain Z-5 under optical microscope

2.2 菌株的分子鑒定

PCR擴(kuò)增菌株Z-5的ITS序列在NCBI（http：//archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA 5.0做分子發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株Z-5與褐紅籃狀真菌（Talaromyces pinophilusKF572452.1）的同源性最高，相似性達(dá)到99%，因此初步判斷Z-5屬于褐紅籃狀菌（圖2）。

圖2 菌株Z-5的ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of ITS gene sequence of Z-5 species

2.3 菌株Z-5降解氨氮能力

2.3.1 接種量對(duì)菌株Z-5氨氮降解的影響 由圖3可知，當(dāng)氨氮初始濃度為100 mg·L-1時(shí)，在不同的接種量條件下，氨氮降解率均隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)先快速增加后逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì)，同時(shí)隨著接種量的增加氨氮降解率大體呈先增加后減少的趨勢(shì)，第1、2 d時(shí)，隨著接種量的增加氨氮降解率呈逐漸增加趨勢(shì)，第3 d開始接種量1.0%時(shí)氨氮降解率升高，并在第5 d時(shí)達(dá)到峰值，為95.1%。其中接種量為0.1%、0.5%、1.5%、2.0%時(shí)均在培養(yǎng)第5 d氨氮降解率達(dá)到峰值，分別為79.2%、86.5%、87.8%、81.1%。以上結(jié)果表明，菌株Z-5最適的接種量為1%。

圖3 接種量對(duì)菌株Z-5氨氮降解率的影響Fig.3 Effects of inoculation amount on ammonia degradation rate of Z-5

2.3.2 初始氨氮濃度對(duì)菌株Z-5降解氨氮的影響由圖4可知，在初始氨氮濃度為100 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)2 d氨氮去除率即可達(dá)到90%以上，初始氨氮濃度為250、500、750 mg·L-1時(shí)，氨氮去除率分別在第3、4、7 d達(dá)到90%以上，而當(dāng)氨氮初始濃度為1 000 mg·L-1時(shí)，在培養(yǎng)到第7 d時(shí)，氨氮去除率達(dá)到69.3%。結(jié)果表明，氨氮初始濃度越小，氨氮去除率達(dá)到最大所需的時(shí)間越短，當(dāng)氨氮初始濃度為100 mg·L-1時(shí)，氨氮去除率于第4 d時(shí)達(dá)到最高，為96.1%。如圖5所示，氨氮初始濃度分別為100、250、500、750、1 000 mg·L-1時(shí)，其對(duì)應(yīng)氨氮絕對(duì)降解量分別在第2、3、5、7 d時(shí)達(dá)到最高，分別為96.1、238.2、472.6、702.0、693.1 mg。以上結(jié)果說明，氨氮初始濃度越低，氨氮絕對(duì)降解量達(dá)到最大所需時(shí)間越短；初始氨氮濃度在100～750 mg·L-1的范圍內(nèi)時(shí)，氨氮初始濃度越高，氨氮絕對(duì)降解量的峰值越高，但當(dāng)氨氮初始濃度提高到1 000 mg·L-1時(shí)，其最大氨氮絕對(duì)降解量開始下降，因此，菌株Z-5在初始氨氮濃度1 000 mg·L-1以下時(shí)，提高氨氮濃度可以提高菌株Z-5的氨氮降解效率。

圖4 氨氮初始濃度對(duì)菌株Z-5氨氮降解率的影響Fig.4 Effect of initial concentration of ammonia nitrogen on ammonia degradation rate of Z-5

圖5 氨氮初始濃度對(duì)菌株Z-5氨氮絕對(duì)降解量的影響Fig.5 Effect of initial ammonia nitrogen concentration on absolute degradation of ammonia nitrogen by strain Z-5

2.3.3 碳源對(duì)菌株Z-5氨氮降解的影響 由圖6可知，菌株Z-5最適碳源為紅糖，在培養(yǎng)2 d內(nèi)就可以將氨氮基本完全降解；其次為蔗糖和葡萄糖，在培養(yǎng)3 d后氨氮幾乎被完全降解；淀粉作為碳源氨氮降解效果最差，在培養(yǎng)第3 d時(shí)氨氮僅去除28.5%。以上結(jié)果表明，碳源是微生物生長(zhǎng)的能源物質(zhì)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，合適的碳源不僅能提高氨氮的降解效果，而且能大大降低成本。

圖6 碳源對(duì)Z-5菌株氨氮濃度的影響Fig.6 Effect of carbon source on ammonia concentration of Z-5

2.3.4 pH對(duì)菌株Z-5氨氮降解的影響由圖7可知，在不同pH條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，氨氮去除率呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。菌株在pH 6.0～8.0時(shí)均能很好地發(fā)揮脫氮作用，在第4天時(shí)其去除率分別為94.97%、94.91%、94.75%，其中當(dāng)初始pH為8.0時(shí)其氨氮去除率在第3天時(shí)已達(dá)到90.66%，以上結(jié)果表明，該菌株更適合中性偏堿的環(huán)境，但是在弱酸環(huán)境時(shí)仍然具有較好的降解效果。

圖7 pH對(duì)Z-5菌株氨氮降解率的影響Fig.7 Effect of pH on ammonia degradation rate of Z-5

2.4 單因素交叉響應(yīng)

上述每個(gè)單因素指標(biāo)的計(jì)算結(jié)果具有片面性，無法表現(xiàn)多種因素的相互影響。為探索多因素的相互影響，用磷酸鹽緩沖液和HCl或NaOH調(diào)節(jié)不同酸堿度和氨氮初始濃度之間的相互影響為例，分析雙因素對(duì)氨氮降解率的影響，其交互作用的響應(yīng)面如圖8所示，菌株Z-5的初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和初始氨氮濃度（100、250、500、750、1000 mg·L-1）的二元分布共包含5×5＝25組結(jié)構(gòu)組合，從圖中可以看出，隨著pH的增加，不同初始氨氮濃度對(duì)應(yīng)的氨氮降解率均先增加，到達(dá)最大值后再依次減??；隨著初始氨氮濃度的增加，不同pH對(duì)應(yīng)的氨氮降解率均依次減小，并且當(dāng)初始氨氮濃度為100 mg·L-1和pH為7.0時(shí)，其氨氮降解率最高，達(dá)到了96.3%，與探究單因素菌株Z-5降解氨氮效果的結(jié)果一致。綜合單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，影響氨氮降解的幾個(gè)因素主要是氨氮初始濃度、碳源以及pH，故以氨氮降解率為指標(biāo)，做初始濃度、碳源和pH 3因素3水平正交試驗(yàn)L9（33），正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，各因素對(duì)氨氮降解率的影響主次順序分別為：氨氮初始濃度、碳源、pH，最優(yōu)水平為A1B3C3，即氨氮初始濃度為100 mg·L-1，碳源為紅糖，pH為7.0，氨氮降解率達(dá)到了94.75%。

圖8 pH和氨氮初始濃度之間的二元分布Fig.8 Bivariate distribution of pH and initial concentration of ammonia nitrogen

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiments

3 討論

研究表明，含有高濃度氨氮的廢水如果不經(jīng)處理直接排放到水庫或江河湖海中，會(huì)影響人類健康，并且過量的氨氮會(huì)破壞水體自凈能力，打亂水體環(huán)境生態(tài)平衡［20］。本研究結(jié)果表明，菌株Z-5最適接種量為1.0%，分析原因?yàn)?，接種量的大小決定了菌種的繁殖速度，接種量過大或過小，都會(huì)影響氨氮降解效果。接種量過大會(huì)造成溶氧不足，影響產(chǎn)物的合成，隨之產(chǎn)生更多的代謝中間產(chǎn)物，不利于菌株生長(zhǎng)；過小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，影響氨氮降解速率。吳建江等［21］篩選出一株假單胞菌（Pseudomonassp.）XS76，其最適接種量為4%；王田野等［22］篩選出的一株異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）SQ2，研究發(fā)現(xiàn)其最適接種量為5%。適宜的氨氮濃度可以促進(jìn)氨氧化菌的生長(zhǎng)，提高氨氮去除效率，但過高的氨氮，會(huì)抑制氨氧化菌的生長(zhǎng)與活性，從而影響其氨氮降解能力［16］。，隨著氨氮濃度的增加，菌株Z-5對(duì)污水氨氮去除率逐漸下降，在初始氨氮濃度100～750 mg·L-1的范圍內(nèi)，菌株Z-5對(duì)氨氮的絕對(duì)去除量逐漸增加。分析原因?yàn)椋钡獫舛鹊奶岣呖赡軙?huì)導(dǎo)致C/N比下降造成的；菌株Z-5的最適碳源為紅糖，不同的碳源對(duì)菌株的氨氮降解能力不同，本研究的碳源分別是葡萄糖、蔗糖、紅糖和淀粉，其中葡萄糖、蔗糖和淀粉均屬于化合物，而紅糖為混合物，總糖分≥85%，含有較多微量元素，如鐵、鋅、錳、鉻等，這些微量元素為菌株降解氨氮的過程中提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；菌株Z-5最適pH為7.0，即在中性條件下氨氮降解能力最強(qiáng)。有研究表明，香茅醇假單胞菌（Pseudomonas）WXP-4［9］和寡養(yǎng)不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）SYF26［23］pH為7.0時(shí)脫氮能力最佳，而喻其林等［24］、朱偉等［25］在雞糞和生活污水中分離的微生物最適pH分別為7.5、8.0，表明微生物生存環(huán)境不同，篩選出的菌種最適pH也存在明顯的差異。

本研究對(duì)篩選菌株Z-5氨氮降解特性作了初步單因素分析、二元分布以及3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)接種量為1%、氨氮初始濃度為100 mg·L-1、碳源為紅糖以及pH為7.0時(shí)，氨氮降解率最高，達(dá)到了94.75%。綜上所述，菌株Z-5對(duì)低濃度的氨氮具有較高的去除能力，在培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)足夠的條件下對(duì)高氨氮廢水也具有較強(qiáng)的去除能力，本研究結(jié)果為菌株Z-5在實(shí)際廢水處理中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，但其他環(huán)境影響因素以及多因素交叉影響情況有待進(jìn)一步分析。