廣靈大尾羊FITM2 基因擴增、序列及表達特性分析

秦朋云，喬利英，劉建華，潘洋洋，侯文欣，車雨彤，趙 祥，劉文忠

（山西農業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030801）

羊肉營養(yǎng)豐富，是高蛋白低固醇的肉類之一。中國傳統(tǒng)文化認為羊肉具有一定食療藥補功效，因此其深受消費者青睞。而脂肪堆積過多會降低綿羊胴體品質和肉質口感，影響肉用綿羊的經濟價值。脂肪組織作為動物體內維持能量代謝平衡的主要器官，是動物體內重要的儲能部位。脂肪的沉積不僅受到營養(yǎng)等環(huán)境因素影響，更受到諸多遺傳因素的調控。因此探究脂肪代謝相關的遺傳因素，對改善綿羊脂肪沉積方式具有重要作用。

脂肪儲存跨膜誘導蛋白（Fat Storage-Inducing Tra nsmembrane Protein，F(xiàn)IT/FITM）是一個獨特的蛋白質家族，其家族包含2 個基因和，二者氨基酸序列相似性為50%，都定位于細胞內質網。主要在骨骼肌和心臟中表達，而在全身各組織中普遍表達，尤其在白色和棕色脂肪組織中高表達。研究發(fā)現(xiàn)，這2 種蛋白都有6 個跨膜結構域，N端和C 端均位于細胞質。參與將甘油三酯打包成脂滴的過程，促進脂滴在細胞中的積累，但不參與甘油三酯的合成。在肝臟中被鑒定為過氧化物酶體增殖物激活受體-（PPAR）激動劑誘導的轉錄物，后證明對脂滴的形成至關重要。的缺失導致細胞脂滴數(shù)量減少，過表達導致脂滴中脂質儲存增加。研究表明小鼠脂肪組織中選擇性敲除會導致脂肪營養(yǎng)不良和代謝功能障礙。這些結果都表明FITM2 蛋白對動物脂肪沉積和生命維持具有關鍵作用。

前期對于的研究主要集中在人、小鼠和豬中，缺乏對該基因在反芻動物中的機制和功能的認識，且關于的報道主要集中在生化作用，對于基因轉錄調控方面少見研究?；诒菊n題組前期對廣靈大尾羊和小尾寒羊脂肪組織的轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，基因在不同品種綿羊的不同組織中差異表達。本實驗旨在通過克隆廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)，分析序列特征及蛋白特性，并通過生物信息學軟件分析基因啟動子和可能與之結合的轉錄因子，以及它們在前體脂肪細胞分化過程中的表達規(guī)律，為進一步研究廣靈大尾羊基因在脂肪沉積過程中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 本實驗采集4 月齡廣靈大尾羊尾部脂肪組織，浸泡于含1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的無菌PBS 溶液中，置于冰盒帶回實驗室用于分離前體脂肪細胞。隨機選取3 只8 月齡廣靈大尾羊安樂死后放血，采集尾部脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和背最長肌組織，用錫紙包裹置于液氮帶回實驗室，-80℃保存，用于后續(xù)基因擴增及組織表達分析。

1.2 主要試劑 Trizol 試劑、PrimeScriptRT reagent kit反轉錄試劑盒、PrimeSTARHS（Premix）高保真酶、TB Green Premix Ex TaqII qPCR 定量試劑盒、限制性內切酶、基因組DNA 提取試劑均購自TaKaRa 公司；瓊脂糖、DH5感受態(tài)細胞、II 型膠原酶、LB 固體/液體培養(yǎng)基均購自索萊寶公司；無內毒素質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自OMEGA 公司；無縫克隆試劑盒購自諾唯贊公司；雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，Penicillin-Streptomycin Solution）、胎牛血清和高糖DMEM 培養(yǎng)液購自Biological Industries 公司；過表達載體pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-puro 購自漢恒生物科技（上海）有限公司。

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成 采用Trizol 法提取4種組織的總RNA，用核酸蛋白測定儀（NanoDrop）檢測總RNA 濃度和純度（1.8＜A260/280＜2.0），保存于-80℃冰箱中備用。根據PrimeScriptRT reagent kit反轉錄試劑盒獲得cDNA，保存于-20℃。

1.4 廣靈大尾羊基因的克隆 根據NCBI 中收錄的綿羊基因（XM_004014584.4）序列信息，利用Primer Primier 5.0 軟件設計基 因CDS 區(qū) 的特異性引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。以脂肪組織cDNA 為模板，通過PCR 擴增出基因CDS 區(qū)全長，經2% 瓊脂糖凝膠電泳后切割目的條帶，并純化回收。用I 和I 快切酶使載體線性化，按無縫克隆試劑盒說明書連接載體和目的片段。連接產物轉化感受態(tài)細胞，涂板后12 h 挑選單個陽性克隆菌落過夜搖菌，并將菌液送至北京六合華大基因有限公司進行測序。

表1 引物設計

1.5 廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)生物信息學分析 通過Jalview、MEGA X 軟件對廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)進行氨基酸多序列比對和遺傳進化樹構建；利用生物信息學軟件預測基因編碼蛋白的特性（表2）。

1.6 廣靈大尾羊基因啟動子核心區(qū)、CpG 島及轉錄因子預測分析 從NCBI 中獲取綿羊基因（NC_040264.1）轉錄起始位點上游2 000 bp 及下游100 bp 作為啟動子序列。利用BDGP 預測核心啟動子區(qū)；利用Methprimer 預測啟動子區(qū)CpG 島；利用JASPAR、Animal TFDB、ALGGEN 和ChEA3 軟件預測與基因啟動子潛在結合的轉錄因子（預測網站見表2）。

表2 生物信息學分析軟件

1.7 廣靈大尾羊前體脂肪細胞的分離和培養(yǎng) 采集廣靈大尾羊尾部脂肪組織在75% 酒精中浸泡15 s，轉移到裝有PBS 緩沖液的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷和眼科剪分離出肉眼可見的血管。將脂肪組織剪成小塊，轉移到15 mL離心管，加入等體積2 mg/mL II 型膠原酶，37℃ 200 rpm條件下消化30 min，隨后加入等體積完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基中加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液）終止消化。室溫下1 000 rpm 離心10 min。挑去上層漂浮的脂肪，緩慢倒掉上清，盡可能吸干凈殘余液體，加入完全培養(yǎng)基重懸沉淀，用200 目和400 目細胞篩過濾重懸液，將細胞接種到10 cm 培養(yǎng)皿中，添加完全培養(yǎng)基至每皿10 mL。輕搖培養(yǎng)皿使細胞均勻分布有利于細胞貼壁，后置于37℃的5% CO的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h 后觀察細胞是否貼壁，如果貼壁則更換新的完全培養(yǎng)基，此后每2 d 更換一次培養(yǎng)基，每次換液前用PBS 洗滌，至細胞匯合度達到約80%進行傳代、凍存或后續(xù)實驗。

1.8 實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）

1.8.1 廣靈大尾羊基因在4 種不同組織中的表達利用NCBI 中Primer-BLAST 設計基因的特異性定量引物（表1），以-為對照，qPCR 檢測mRNA 在廣靈大尾羊尾脂、皮下脂肪、腎周脂肪和背最長肌組織中的表達量。反應體系如下：cDNA（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，TB Green Premix Ex Taq II 5 μL，ddHO 補足至10 μL。反應程序為：95℃5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃20 s，設置39 個循環(huán)；95℃5 s，65℃1 min，升溫速率5℃/s，從65℃遞增到97℃，反應至40℃結束。

1.8.2 廣靈大尾羊基因和部分轉錄因子在前體脂肪細胞分化過程中的表達 待前體脂肪細胞匯合度達到80%時，更換分化誘導培養(yǎng)基，并記做分化第0 d，此后每2 d 更換一次培養(yǎng)基，分化3～4 d 后顯微鏡觀察有可見脂滴生成。分別收集分化第0、2、4、6、8、10 天的細胞，提取總RNA 并反轉錄成cDNA。利用Primer-BLAST 設計基因特異性定量引物（表1），以-作對照。以各時期的細胞cDNA 為模板進行qPCR 反應，反應體系及程序同1.8.1。

1.9 數(shù)據處理及分析 qPCR 結果以-為內參基因，用2來計算mRNA 相對表達量，對所得數(shù)據進行顯著性分析。＜0.05 表示差異顯著，＜0.01 表示差異極顯著。用GraphPad Prism 7.0 繪制柱狀圖。

2 結果

2.1 廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)的克隆 成功克隆出廣靈大尾羊基因的CDS 區(qū)，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，結果見圖1，可見一條約為900 bp的條帶（包含部分非編碼區(qū)），與理論擴增目的條帶長度一致。

圖1 廣靈大尾羊FITM2 基因CDS 區(qū)擴增

2.2 廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)生物信息學分析

2.2.1 廣靈大尾羊基因序列分析和蛋白理化性質分析 利用NCBI 中的ORF Finder 對廣靈大尾羊基因的開放閱讀框進行定位分析。結果顯示基因位于13 號染色體，包含一個長852 bp 的開放閱讀框。通過在線軟件Protparam 預測到廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)編碼蛋白質有283 個氨基酸，分子式為CHNOS，相對分子質量為32 162.64，理論等電點為9.59，該蛋白含有20 種氨基酸，含量最高的為亮氨酸（Leu），達到13.8%，含量最低的為天冬氨酸（Asp）僅為1.1%。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）：16，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）：31。預測到該蛋白的消光系數(shù)（Mcm，=280 nm）為78 880，不穩(wěn)定系數(shù)為49.51，說明這種蛋白不穩(wěn)定，容易降解或變性。脂溶指數(shù)為94.73，總平均親水性（GRAVY）為0.134，表明該蛋白為疏水性蛋白。該蛋白在哺乳動物生物體外的網織紅細胞中的半衰期為30 h。通過Protscale 對蛋白的疏水性進行分析（圖2），其中正值表示疏水性，負值表示親水性，值越大則性能越強，而該圖中大部分位點所對應的值都大于0，表明該蛋白為疏水性蛋白。

圖2 FITM2 蛋白疏水性分析

2.2.2 廣靈大尾羊FITM2 蛋白的亞細胞定位及跨膜結構分析 通過PSORT II 軟件進行FITM2 蛋白亞細胞定位分析時發(fā)現(xiàn)，該蛋白分別位于內質網、質膜、空泡、線粒體、高爾基體中，其比例分別為33.3%、33.3%、11.1%、11.1%、11.1%。通過在線軟件TMpred 預測FITM2 蛋白的跨膜結構，發(fā)現(xiàn)FITM2 編碼蛋白存在6個跨膜結構域（圖3）。

圖3 FITM2 蛋白跨膜結構域預測

2.2.3 廣靈大尾羊FITM2 蛋白的信號肽、磷酸化預測利用SignalP 5.0 在線軟件對廣靈大尾羊FITM2 蛋白序列進行預測分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白N 端不存在信號肽，是非分泌蛋白。磷酸化位點由NetPhos 2.0 在線軟件預測，對潛在磷酸化位點的3 種氨基酸即絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）進行預測，若分值大于0.5，則被視為潛在位點。預測結果發(fā)現(xiàn)有13 個絲氨酸位點、10 個蘇氨酸位點、3 個酪氨酸位點超過了閾值，表明這26 個位點可能成為蛋白激酶磷酸化的位點（圖4）。

圖4 FITM2 蛋白磷酸化位點預測

2.2.4 FITM2 蛋白二級結構和三級結構預測 通過SOPMA 在線軟件分析預測，結果表明FITM2 蛋白的二級結構主要由-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和-轉角組成。其中-螺旋占55.48%，無規(guī)則卷曲占30.04%，延伸鏈占11.66%，-轉角占2.83%（圖5）。通過I-TASSER 在線軟件預測FITM2 蛋白三級結構，結果見圖6。

圖5 FITM2 蛋白二級結構預測

圖6 FITM2 蛋白三級結構預測

2.2.5 廣靈大尾羊基因序列的多序列比對及遺傳進化樹分析 利用Jalview、MEGA X 軟件對綿羊（XP_004014633.2）、山羊（XP_005688629.2）、人（NP_001073941.1）、小鼠（NP_775573.1）、大鼠（NP_001 101269.1）、豬（NP_001121932.1）、牛（NP_001096565.1）等7 個物種的基因序列進行氨基酸多序列比對（圖7）和遺傳進化樹分析（圖8）。從多序列比對看，很多氨基酸位點保守不變，說明基因編碼區(qū)在各物種中保守性較好。從遺傳進化樹看，綿羊與山羊親緣關系最近，與牛、豬和人親緣關系次之，與小鼠和大鼠的親緣關系最遠。

圖7 氨基酸多序列比對結果

圖8 不同物種FITM2 蛋白序列進化樹分析

2.3 廣靈大尾羊基因啟動子生物信息學分析 選取基因轉錄起始位點ATG 上游2 000 bp 及下游100 bp作為基因的啟動子。通過BDGP 在線軟件預測到基因有3 個核心啟動子區(qū)，分別位于基因上游-1 624 bp～-1 575 bp，-1 597 bp～-1 548 bp，-167 bp～-118 bp（圖9A）。通 過Methprimer 軟件預測出在基因上-206 bp～+39 bp 的位置上有1 個245 bp 的CpG 島（圖9B）。通過啟動子在線分析軟件預測發(fā)現(xiàn)該啟動子序列包含有真核生物啟動子典型的TATA-box 和CAAT-box，并預測到大量可能存在的轉錄因子。

圖9 啟動子核心區(qū)和CpG 島預測

2.4基因啟動子轉錄因子的預測 通過在線軟件JASPAR、Animal TFDB、ALGGEN 和ChEA3 對啟動子上轉錄因子進行預測，分別預測到633、584、312、65 個轉錄因子，使用Venn 在線軟件取4 個軟件預測結果的共同部分，得到9 個轉錄因子（圖10A），。結合在本課題組之前脂肪組織二代測序數(shù)據庫研究結果發(fā)現(xiàn)，表達量較高的有，并在脂肪細胞生長過程中發(fā)揮轉錄調節(jié)作用。部分轉錄因子在部分啟動子上結合位點的相對位置如圖10B 所示。

圖10 預測出與FITM2 基因具有靶標關系的轉錄因子及部分結合位點

2.5 廣靈大尾羊基因在4 種不同組織中的表達量 定量結果顯示，基因在4 種組織中都有表達，在脂肪細胞中表達量顯著高于背最長肌組織，在淺層脂肪中的表達量顯著高于深層脂肪中的表達量（圖11A）。如圖11B 所示，基因的mRNA 表達量在分化過程中呈上升趨勢，表明可能促進前體脂肪細胞分化，并促進脂滴的積累。轉錄因子的表達趨勢與一致，可能正調控基因并促進前體脂肪細胞分化。而在第4天之后呈下降趨勢，但與表達趨勢不完全相反。

圖11 實時熒光定量結果

3 討 論

是進化上高度保守的基因，在細胞中將甘油三酯打包成脂滴的過程中發(fā)揮重要作用。本實驗經過基因克隆獲得廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)全長852 bp，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其編碼283 個氨基酸，沒有信號肽，與NCBI 上收錄的綿羊基因（XM_004014584.4）的編碼蛋白一致，但與豬、牛、人和小鼠的序列相比在5' 端多出21 個氨基酸。有研究表明，豬基因編碼262 個氨基酸，其中N 端的30 個氨基酸為信號肽，其作用是靶向運輸分泌的FITM2 蛋白到胞外。但是廣靈大尾羊的FITM2 蛋白沒有預測到信號肽，可能與它在N 端多出的21 個氨基酸有關。生物信息學分析廣靈大尾羊FITM2 蛋白有6個跨膜結構域，二級結構多為-螺旋和無規(guī)則卷曲結構，前人研究發(fā)現(xiàn)FITM2 蛋白大部分結構域是由跨膜結構域組成的，而跨膜結構域在本質上是螺旋結構，與本預測結果一致。本研究預測到廣靈大尾羊FITM2蛋白結構含有多個潛在的磷酸化位點，這些位點可能成為蛋白激酶磷酸化的位點。研究發(fā)現(xiàn)FITM2 蛋白和參與磷脂生物合成的基因之間有強相互作用，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)FITM2 作為酰基輔酶A 雙磷酸酶在維持內質網結構和脂質在脂滴中的正常儲存發(fā)揮作用。

脂肪細胞中含有大量脂滴，脂滴是細胞內中性脂質的主要儲存場所，由極性單磷脂層包裹疏水核心組成，參與細胞內物質的代謝和轉運、細胞信號傳導及脂類合成代謝等過程，是一個活動旺盛的多功能細胞器。研究表明，基因在哺乳動物組織中普遍表達，尤其在白色和棕色脂肪組織中表達最高。王靜對豬基因進行組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)mRNA在各種組織中表達量都較高。研究發(fā)現(xiàn)基因沒有參與甘油三酯合成，只是在甘油三酯積累中發(fā)揮作用，基因主要表達于脂肪組織，其特點是產生大脂滴。本文對基因在廣靈大尾羊尾部、皮下、腎周脂肪和背最長肌組織中的表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)mRNA 表達量在尾脂和皮下脂肪中不存在顯著差異，但和腎周相比差異顯著，且在3 種脂肪組織中的含量均顯著高于背最長肌組織，表明基因主要在脂肪組織中高表達，并且在綿羊前體脂肪細胞開始分化后，基因含量開始升高，表明基因可能促進綿羊前體脂肪細胞分化，與前人研究一致。

真核生物基因表達量受多個水平的調控，尤其在轉錄水平，其中研究最多的是關于啟動子的研究，啟動子是啟動靶基因開始轉錄的DNA 序列，位于基因5'端上游序列中，可特異性識別和結合RNA 聚合酶并使之活化，從而起始轉錄。因此，研究啟動子有助于了解基因在轉錄水平的調控機制。本研究預測到3 個核心啟動子區(qū)，分別位于基因上游-1 624 bp～-1 575 bp、-1 597 bp～-1 548 bp、-167 bp～-118 bp，發(fā)揮主要作用的核心區(qū)域需要進一步通過構建雙熒光素酶報告載體進行雙熒光素酶活性分析驗證。在啟動子的-206 bp～+39 bp的位置上預測到1 個長245 bp 的CpG 島，表明在此區(qū)間內可能會發(fā)生甲基化修飾進而影響基因的表達。在該啟動子序列中發(fā)現(xiàn)真核生物啟動子典型的TATA-box 和CAAT-box，并預測到大量可能存在的轉錄因子，做韋恩圖取交集并參照本課題組之前的脂肪組織轉錄組二代測序數(shù)據庫，篩選出和4 個在脂肪組織中含量較高的轉錄因子。因此本文初步研究了這4 種轉錄因子在前體脂肪細胞分化過程中的表達趨勢，結果表明轉錄因子和可能正調控基因表達并促進前體脂肪細胞分化，在第4 天之后表達量下降，與表達趨勢不一致且未完全相反，推測其可能不參與基因的表達調控。然而這些轉錄因子在成脂過程中能否通過調節(jié)基因的表達進而影響前體脂肪細胞分化仍然未知，需進一步研究。

4 結 論

廣靈大尾羊基因CDS 區(qū)全長852 bp，編碼283 個氨基酸。生物信息學分析表明FITM2 定位于內質網，有6 個跨膜域和26 個潛在磷酸化位點，在哺乳動物間高度保守?；蛟谥窘M織中表達量高。初步篩選出STAT5A、YY1、USF2 和MAZ 4 個對基因活性可能有影響的轉錄因子。本實驗結果為進一步探究廣靈大尾羊基因在脂肪沉積過程中的作用提供理論依據。