陳治徽，陳 林，張力莉，刁其玉，李勝利，畢研亮*，徐曉鋒*

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021；2.中國農業(yè)科學院飼料研究所，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室反芻動物及其幼畜營養(yǎng)代謝中美聯合研究中心，北京 100081；3.中國農業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193）

隨著畜牧業(yè)規(guī)?；⒓s化的發(fā)展，早期斷奶技術得到廣泛應用。早期斷奶可減少代乳粉和牛奶的使用，降低犢牛飼養(yǎng)成本，并且可以有效刺激犢牛提前適應固體飼料，加快犢牛瘤胃的發(fā)育，從而為后期取得良好的生產性能奠定基礎。但早期斷奶產生的應激不僅會對犢牛健康、生長發(fā)育和免疫機能產生影響，也會對犢牛后期的生產性能產生較大影響。犢牛斷奶應激往往伴隨著生理指標和組織器官結構改變，而血液成分的相對穩(wěn)定和腸道黏膜屏障的完整與健康是保證其犢牛生長和后期高生產的基礎。目前大多數研究主要集中于犢牛斷奶應激發(fā)生原因和如何緩解犢牛斷奶應急，但關于由斷奶應激引起的犢牛斷奶前后血液生化及腸道通透性變化規(guī)律的研究甚少。本試驗旨在研究犢牛斷奶前后其血液生化和腸道通透性的變化規(guī)律，進一步解釋斷奶應激的形成，為生產實踐提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 試驗于2019 年5—10 月在寧夏某牧場開展。選擇健康、體重相近的50 日齡荷斯坦母犢牛12 頭，采用大圈飼養(yǎng)。試驗期31 d，（斷奶前7 d，斷奶后21 d）。試驗開始后每日早晚各飼喂代乳粉1 次，采用自由飲水和自由采食開食料，犢牛60 日齡斷奶。開食料組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 開食料組成及營養(yǎng)成分（干物質基礎）

1.2 樣品采集 分別在斷奶前2 d 及斷奶后1、2、3 周通過頸靜脈采血10 mL 采集12 頭斷奶犢牛血液，置于肝素鈉采血管中，3 000 r/min 離心15 min，吸取上清液，-20℃冰箱內保存。

1.3 血液中應激和免疫及生化指標測定 血清葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、堿性磷酸酶（ALP）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）均采用邁瑞B(yǎng)S-180 全自動生化分析儀測定，試劑盒均為深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產品。血液白細胞介素-1（IL-1）、Toll 樣受體4（TLR4）、結合珠蛋白（HP）采用江蘇晶美生物科技有限公司的ELISA試劑盒，利用酶標儀（TECAN INFINITE F50）測定。

1.4 腸道通透性指標測定 閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）、乳酸（D-LA）、二胺氧化酶（DAO），采用江蘇晶美生物科技有限公司的ELISA 試劑盒，利用酶標儀（TECAN INFINITE F50）測定。

1.5 統(tǒng)計分析 利用 Excel 對數據進行初步整理，用SAS 8.2 軟件進行統(tǒng)計分析，若差異顯著則利用Duncan's 法進行多重分析。數據用平均值±標準誤表示，＜0.05 表示差異顯著，＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 犢牛斷奶后血液生化指標和免疫指標的變化規(guī)律 由表2 可知，斷奶后3 周GLU 高于斷奶后1、2 周（＜0.01），但低于斷奶前2 d（＜0.01）；斷奶前2 d 犢牛BUN、TC、TG 含量高于斷奶后1、2、3 周（＜0.01），ALP 含量高于斷奶后1 周（＜0.01），而斷奶前2 d 犢牛血液TP、GLB、AST 含量低于斷奶后1、2、3 周（＜0.01），斷奶后3 周ALP 含量高于斷奶前2 天（＜0.01）。斷奶前2 d 犢牛血液IL-1含量低于斷奶后1、2、3 周（＜0.01），HP 含量低于斷奶后1、2、3 周（＜0.05），而TLR4含量則低于斷奶后3 周（＜0.05）。

表2 犢牛斷奶后血液生化指標和免疫指標的變化規(guī)律

2.2 犢牛斷奶后腸道通透性指標變化規(guī)律 由表3 可知，犢牛斷奶后1 周血液ZO-1 略有升高（＞0.05），斷奶后1、2 周D-LA 相較于斷奶前2 d 有上升趨勢（＞0.05），而斷奶后3 周犢牛血液DAO 含量高于斷奶前2 d（＜0.01）

表3 犢牛斷奶后腸道通透性指標變化規(guī)律

3 討 論

3.1 犢牛斷奶后血液生化指標和免疫指標的變化規(guī)律GLU 是動物體內各組織細胞活動的能量來源，GLU 濃度主要受胰島素及胰高血糖素調節(jié)，當GLU 濃度過低時刺激胰高血糖素等激素分泌并會啟動糖異生途徑來維持GLU 恒定。本試驗結果顯示，60 日齡斷奶會降低犢牛GLU 濃度，且斷奶后1、2、3 周GLU 濃度極顯著低于斷奶前2 d。周玉香、趙會利研究結果也顯示，早期斷奶應激會引起GLU 含量和胰島素水平降低，BUN 含量和胰高血糖素水平顯著升高，犢牛斷奶之前其營養(yǎng)來源主要是通過攝入牛奶中易于消化吸收的蛋白質、游離氨基酸、脂肪和乳糖等，而斷奶后犢牛攝入的開食料、全價料和飼草等只能提供碳源和氮源的化合物，需要經過瘤胃的發(fā)酵、降解等來合成犢牛自身所需的營養(yǎng)物質，這也使得犢牛在斷奶后腸道結構發(fā)生變化，進而導致腸道對營養(yǎng)物質的吸收能力下降。斷奶后從小腸中吸收的營養(yǎng)物質含量迅速減少，蛋白攝入量不能滿足糖異生，從而降低了葡萄糖含量，使GLU 無法保持相對穩(wěn)定。有研究表明，GLU 濃度隨著犢牛年齡增長和瘤胃功能的發(fā)展而降低。GLU 濃度過低還會導致大腦中葡萄糖供應不足而出現功能失調，影響犢牛健康和日增重等。

BUN 是評價動物機體氨基酸和蛋白質代謝平衡狀態(tài)的一項重要指標。正常情況下BUN 濃度較低，表明動物機體氨基酸代謝正常，機體蛋白質合成率較高。本試驗中，60 日齡斷奶增加了BUN 濃度，斷奶后1、2、3 周BUN 濃度均極顯著高于斷奶前2 d，表明斷奶應激導致犢牛體蛋白大量分解，犢牛肝臟還未完全適應能量供應由乳糖轉變?yōu)榱鑫笓]發(fā)性脂肪酸的方式。血液TP 濃度可體現機體免疫力以及代謝水平，提高其濃度有利于提高機體免疫力和代謝水平。本試驗中，犢牛斷奶后血液TP、GLB 濃度極顯著高于斷奶前2 d，并隨日齡的增加逐漸增加，表明斷奶后犢牛隨著日齡的增加代謝水平和免疫力逐漸提高。

斷奶應激會通過內部和外部感受器同時刺激動物下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）引起交感神經興奮，引發(fā)下丘腦釋放促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）與血管增壓素（VP）協(xié)同調控腎上腺皮質分泌糖皮質激素。本試驗中血液TC 極顯著降低表明犢牛應激時TC利用提高，機體對斷奶應激的反應強烈。全炳昭等在研究早期斷奶應激對仔豬的影響時發(fā)現，TC 與早期斷奶應激呈負相關。TG 水平可直接反映脂肪消化吸收的狀態(tài)。本試驗中，犢牛斷奶后血液TG 濃度極顯著低于斷奶前2 d，其原因可能是斷奶應激引起機體能量需求增加，而應激影響了脂類物質在胃腸組織中的消化吸收，因此機體通過增加脂肪動員來增加能量來源，此外肝外組織對類脂的需要量增加，導致斷奶后血液TG 濃度極顯著低于斷奶前2 d。隨著斷奶后犢牛日齡增加，TG 的濃度也隨之增加，但斷奶后3 周TG 濃度仍低于斷奶前2 d，表明本試驗中犢牛的斷奶應激還在持續(xù)，研究時間應該延長。

ALP 主要在動物肝臟、腎臟、骨骼和腸道等組織分布，是通過肝臟向膽外排出，因此ALP 的活性也能反映動物的生長狀況，可作為骨骼生長的標記物。有研究顯示，ALP 有降低腸道炎癥反應和病原菌易感性等作用，腸道中ALP 的活性與腸道內養(yǎng)分有效性和供應量有關聯。本試驗中，犢牛斷奶后1 周血液ALP含量極顯著低于斷奶前2 d，但斷奶后2 周恢復到正常水平，表明斷奶后1 周犢牛生長健康受到的影響較大。

TLR4 是一類天然免疫受體，也是參與適應性免疫的重要蛋白，可以在T 細胞、B 細胞、單核細胞和自然殺傷（NK）細胞表達，也是連接固有免疫和適應性免疫的重要橋梁。長期慢性應激可激活TLR4 基因表達量顯著升高，進而可能導致嚴重的炎癥反應和慢性疾病。本試驗中，斷奶后3 周犢牛血液TLR4 受體顯著高于斷奶前2 d，而斷奶后1、2 周比斷奶前2 d 也有升高趨勢，表明TLR4 引發(fā)的炎癥反應可能長期存在于動物體內并損傷動物機體的健康。張千等研究斷奶應激對幼齡反芻動物免疫系統(tǒng)的影響及機理時指出，斷奶后炎癥可能會長期存在于動物體內并對動物的健康造成損害。

IL-1是激活TLR4 的主要促炎因子，IL-1與機體免疫系統(tǒng)密切相關，且具有改變神經內分泌等多方面的功能。也有研究表明，IL-1是一個潛在的應激誘導炎癥反應的調節(jié)因子，可以刺激肝臟急性蛋白合成，增強機體炎癥反應，造成組織損傷。本試驗中，斷奶后1、2、3 周犢牛血液IL-1基因表達量均極顯著高于斷奶前2 d，表明斷奶犢牛機體可能產生了強烈的炎癥反應和免疫應答。當機體長時間存在炎癥因子或炎癥反應時，機體會消耗大量能量物質以促進免疫系統(tǒng)消除炎癥（因子）反應，這也使得動物的生產性能受到影響。

HP 是與游離血紅蛋白（Hb）結合形成Hp-Hb 復合物的載體蛋白，其作用是將Hb 轉用至肝臟中進行代謝。本試驗中，斷奶后1、2、3 周犢牛血液基因表達量顯著高于斷奶前2 d，可能是因為斷奶應激使得犢牛血液蛋白發(fā)生改變，激活了單核巨噬細胞中的核因子B（NF-B），使其進入核內與許多細胞因子以及炎癥介質基因5'端調控區(qū)的B 序列發(fā)生結合并啟動該基因進行轉錄，導致血液HP 含量升高。

3.2 犢牛斷奶后腸道通透性指標的變化規(guī)律 ZO-1 主要存在于腸道、血管內皮等組織器官中，是上皮細胞緊密連接重要結構蛋白的組成成分，ZO-1 與眾多組織上皮細胞的緊密連接相關蛋白相互作用。本試驗中，犢牛在斷奶后1 周血液中ZO-1 略有升高，這表明斷奶應激會對犢牛腸道、血管內皮等組織產生影響，但不明顯。D-LA 是腸道內眾多固有細菌可以產生的代謝物，但D-LA 在其他組織中均不產生和代謝，然而當腸道屏障受損時，腸道細菌產生大量的D-LA 就會透過受損腸道屏障進入血循環(huán)，增加血液中D-LA 含量，因此D-LA 含量的高低可作為腸道健康狀況和腸道屏障功能是否受損的一項重要指標。本試驗中，犢牛在斷奶前2 d 和斷奶1、2、3 周血液中D-LA 含量存在上升趨勢，但未發(fā)生顯著性變化，這表明由牛奶轉變?yōu)殚_食料這一過程中犢牛腸道屏障會受到損傷。DAO 是一種含有脫胺的腐胺和組胺的細胞內酶，腸道黏膜是其存在的主要部位，正常機體血液中的含量極少。DAO 活性也是反映小腸功能的一項重要指標，正常情況下血液中DAO趨于穩(wěn)定，但當小腸黏膜絨毛上皮細胞損傷時，血清中DAO 水平會急劇增高，因此測定血中DAO 活性可反映腸屏障黏膜損傷和修復的情況。本試驗結果表明，犢牛斷奶前2 d 及斷奶后1、2 周血清中DAO 含量有增加趨勢，并在斷奶3 周后顯著增加，這也印證了斷奶應激會引發(fā)腸道黏膜受損，改變腸道通透性。斷奶應激引起的犢牛腸道黏膜損傷可能會隨著時間的延長持續(xù)存在，仍需進一步研究。

4 結 論

本試驗結果表明，犢牛斷奶后1、2、3 周血液中GLU、TC、TC 的濃度低于斷奶前2 d，BUN 含量升高，這表明斷奶應激使得犢牛營養(yǎng)和能量攝入不足，增加自身脂肪動員和體蛋白分解，從而影響其自身對營養(yǎng)物質的代謝；斷奶后1 周血液中ALP 濃度顯著低于斷奶前2 d，斷奶后TRL、IL-1B 和HP 濃度均顯著高于斷奶前2 d，表明犢牛會因斷奶應激而引發(fā)機體炎癥反應，影響犢牛內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)；斷奶應激也會造成D-LA、DAO 水平上升，表明犢牛斷奶應激會造成腸道屏障受損，進而對其腸道通透性產生影響。