褪黑激素埋植劑對配種準備期水貂卵巢形態(tài)學和卵泡發(fā)育的影響

晏子越，彭 弟，吳占運，高 惠，胡良臣，馬澤芳*，崔 凱*

（1.青島農業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109；2.鄄城縣畜牧服務中心，山東菏澤 274600；3.膠州市九龍街道辦事處農業(yè)辦，山東青島 266300）

水貂（）屬哺乳綱（Mammalia）、食肉目（Carnivoraes）、鼬科（Mustelidae）、鼬屬（），生殖特性明顯受季節(jié)性變化影響，主要與光周期調節(jié)松果體合成和分泌褪黑激素（Melatonin，MLT）的節(jié)律有關。有研究表明，對長日照動物家貓、馬、狐等外源注入MLT，其生殖活動受到抑制，對短日照動物綿羊、山羊、鹿等外源注入MLT 后生殖活動顯著增強，表明外源MLT 可抑制長日照動物、促進短日照動物的生殖活動。然而外源MLT 對短日照動物—水貂生殖活動影響的報道較少，僅見宋興超等對公貂埋植120 d MLT 后發(fā)現(xiàn)，公貂睪丸重量顯著增加；邵麗曉等對間情期母貂埋植MLT 發(fā)現(xiàn)，處于第IV 階段的卵泡比I、II、III 階段出現(xiàn)較多的閉鎖卵泡。綜上研究表明，外源MLT 可提高公貂睪丸重量，影響間情期母貂閉鎖卵泡數量，但有關MLT 對配種準備期母貂生殖活動影響的研究尚未見報道。因此，本實驗對比埋植MLT 172 d 和未埋植MLT 配種準備期水貂的卵巢，探討MLT 對水貂卵巢形態(tài)學和卵泡發(fā)育的影響，為MLT 埋植劑應用于水貂生產實踐和指導埋植MLT 埋植劑的水貂應用于繁殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計及飼養(yǎng)管理 于山東省諸城市（119°E，35°N）某水貂養(yǎng)殖場隨機選取3 月齡健康、體重均勻（870±5）g 的白色水貂母貂200 只，隨機平均分為埋植組和對照組，每組100 個重復，每個重復1 只。試驗于2020 年7 月7 日—2020 年12 月26 日進行，共172 d。于試驗開始當天對埋植組水貂頸部皮下埋植1 粒MLT埋植劑（含MLT 18 mg/粒），對照組不作任何處理；于試驗結束當天隨機選取埋植組和對照組水貂各3 只，采集卵巢樣本，進行形態(tài)學和卵泡發(fā)育的觀察與測定。

水貂飼養(yǎng)于南北走向、東西通風的棚舍內，采用單籠飼養(yǎng)，棚舍與籠箱均保持清潔干凈，專人管理，定時飼喂，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平（按干物質計算）

1.2 卵巢的采集及處理 在實驗結束當天，選取2 組水貂各3 只，CO窒息法處死后立即剖腹取卵巢，置于含有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，共計12 枚，于10 min 內完成培養(yǎng)皿內卵巢形態(tài)學觀察和記錄可視卵泡數量。用游標卡尺（200 nm）測量卵巢長、寬、厚，并計算體積；用電子天平（1/10 000）稱量卵巢重量；將每只水貂右側卵巢置于含有10%甲醛溶液的15 mL 離心管內，做好標記，運回實驗室，室溫條件保存48 h 以上，待組織切片備用。

1.3 卵巢組織切片的制作及觀察 將固定48 h 后的卵巢用水稍加清洗后進行修塊，然后依次按酒精梯度（50%、70%、80%、95%、100%）進行脫水，利用二甲苯溶液進行透明，并放入已溶的石蠟內于恒溫箱（DH-250 型）浸蠟，做成保有卵巢組織的蠟塊，將其切成四周留約2 mm 的方形或長方形蠟塊，然后使用手搖式組織切片機（RM2235，Leica）將石蠟塊切為厚約5 μm 的蠟片，每連續(xù)7 張取1 張蠟片，每個卵巢組織取6 張，共計36 張，做好標記，蘇木素-伊紅染色后，用BK5000 光學顯微鏡分別在4×學顯倍、10 顯微鏡倍、20 顯微0 倍和40×10 倍下觀察成熟卵泡、三級卵泡、次級卵泡和初級卵泡及原始卵泡的形態(tài)，用目鏡測微尺測量各級卵泡的直徑、卵母細胞直徑和透明帶厚度，用計數器統(tǒng)計單位面積（1 000 μm）內各級卵泡數量。

1.4 統(tǒng)計分析 運用Excel 處理數據，利用SPSS 20.0軟件中的獨立樣本檢驗進行比較，結果用平均值±標準誤表示，＞0.05 代表差異不顯著，＜0.05 代表差異顯著，＜0.01 代表差異極顯著。

2 結果

2.1 卵巢形態(tài)學和可視卵泡數量測定結果 由表2 可知，埋植組卵巢僅寬度與對照組沒有差異，長、厚、體積、重量均大于對照組（＜0.01），可視卵泡數量多于對照組（＜0.05）。說明MLT 埋植劑埋植172 d 可促進卵巢長、厚、體積和重量的增加及可視卵泡數量的增多，對寬度沒有影響。

表2 卵巢形態(tài)學和可視卵泡數量測定結果（n=3）

2.2 各級卵泡和卵母細胞數量、直徑及透明帶厚度測定結果 本試驗共計比較了30 個原始卵泡，30 個初級卵泡，15 個次級卵泡，3 個三級卵泡和3 個成熟卵泡，2組各級卵泡形態(tài)見圖1、圖2，對兩組各級卵泡相關指標進行測量分析得表3。由表3 可知，與對照組相比，埋植組原始卵泡和初級卵泡數量均增多（＜0.01），次級卵泡數量差異不顯著，埋植組有發(fā)育完好的三級卵泡和成熟卵泡，對照組無三級卵泡和成熟卵泡；從原始卵泡到初級卵泡，初級卵泡到次級卵泡的生長速度2 組分別為1.7～2.0、3.3～3.5 倍，埋植組從次級卵泡到三級卵泡，三級卵泡到成熟卵泡的生長速度分別為1.7、2.7倍；從原始卵母細胞到初級卵母細胞，初級卵母細胞到次級卵母細胞2 組生長速度分別為1.0～1.2、1.7～1.8 倍，埋植組從次級卵母細胞到三級卵母細胞，三級卵母細胞到成熟卵母細胞的生長速度分別為1.4、1.1 倍；2 組均在次級卵泡階段開始出現(xiàn)透明帶，埋植組透明帶厚度從次級卵泡到三級卵泡，三級卵泡到成熟卵泡的生長速度分別為1.6、1.3 倍。說明MLT 埋植劑埋植172 d 可促進原始卵泡和初級卵泡數量的增多及有腔卵泡的提前發(fā)育，而對次級卵泡數量及腔前卵泡的直徑、卵母細胞直徑和透明帶厚度沒有影響。

表3 各級卵泡和卵母細胞數量、直徑及透明帶厚度測定結果

圖1 對照組各級卵泡形態(tài)

圖2 埋植組各級卵泡形態(tài)

3 討 論

3.1 MLT 埋植劑對卵巢形態(tài)和可視卵泡數量的影響 水貂繁殖規(guī)律明顯受季節(jié)性變化影響。本實驗通過埋植MLT 埋植劑結果顯示，埋植組卵巢長、厚、體積和重量較對照組顯著增加，可視卵泡數量顯著增多，而卵巢寬度無顯著變化，與MLT 能促進短日照動物綿羊、鹿等動物生殖活動的結果一致，表明MLT 埋植劑亦可促進水貂卵巢發(fā)育。這與水貂的繁殖規(guī)律和外界光照長度變化調控自身MLT 分泌模式有關，外界光照信號作用于視網膜產生神經沖動，經過復雜的神經傳導到達頸上神經節(jié)（SCG），由SCG 將交感信息傳給松果體，松果體作為神經-內分泌轉換器將神經輸入信號轉化為內分泌信息輸出，根據外界光照信息的變化調節(jié)去甲腎上腺素（ME）的分泌量，進一步調節(jié)MLT 的合成與分泌，從而晝夜長短的變化引起MLT 分泌節(jié)律的變化。

本實驗埋植MLT 埋植劑相當于代替光周期變化直接改變動物機體MLT 的分泌量，其可穿過所有細胞的細胞膜進入所有組織，通過直接和間接兩種作用方式影響生殖系統(tǒng)的變化，一方面直接作用于卵巢上MLT 的結合位點，另一方面間接作用于下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸，從而促進卵巢發(fā)育。而本實驗中埋植組與對照組的卵巢寬度差異不顯著，可能與卵巢自身結構發(fā)育規(guī)律有關，其機理有待進一步研究。

3.2 MLT 埋植劑對各級卵泡數量、直徑、卵母細胞直徑和透明帶厚度的影響 本實驗中2 組原始卵泡到初級卵泡再到次級卵泡，原始卵母細胞到初級卵母細胞再到次級卵母細胞的的生長速度均一致，說明MLT 埋植劑對卵泡和卵母細胞的發(fā)育速度沒有影響。卵泡發(fā)育速度在初級卵泡到次級卵泡階段發(fā)育較快，這是由于顆粒細胞的快速增殖引起的，卵母細胞從初級階段到次級階段發(fā)育較快，到三級和成熟階段逐漸緩慢，其中卵母細胞的發(fā)育速度慢于卵泡的發(fā)育速度，這是由于卵泡腔的快速增大引起卵泡發(fā)育較快，而卵母細胞到后期基本不再變化，這與李克美闡述的卵泡發(fā)育規(guī)律相一致。透明帶厚度在次級卵泡到三級卵泡的階段快于三級卵泡到成熟卵泡階段。

本試驗埋植組腔前卵泡中原始卵泡和初級卵泡數量顯著增多，腔前卵泡的直徑、卵母細胞直徑和透明帶厚度變化不顯著。與毛夢菌等對豬腔前卵泡培養(yǎng)基中添加不同濃度的MLT 引起各組間卵泡生長但直徑差異不顯著的結果相一致。又據Adriaens 等報道添加MLT 的鼠腔前卵泡培養(yǎng)基中雄激素和孕激素的生成量增多。同時Shanghnessy 等研究發(fā)現(xiàn)切除垂體的兔和羊卵泡數量顯著少于正常組。說明MLT 對卵泡發(fā)育的作用與卵母細胞和顆粒細胞的增殖分化無關，可能與MLT 調節(jié)性激素分泌間接作用于卵泡數量有關，但本實驗次級卵泡數量差異不顯著的機理尚不明確，其機理有待進一步研究，同時為探究MLT 對水貂體外培養(yǎng)條件下卵母細胞的發(fā)育奠定基礎。

本研究中，埋植MLT 組有腔卵泡提前發(fā)育，這與趙英等對休情期銀黑狐埋植7 個月MLT 可促進有腔卵泡發(fā)育的研究結果相一致。一方面可能與MLT 作用于HPG 軸間接調節(jié)性激素的分泌作用有關，卵泡的發(fā)育與促卵泡生成素（FSH）和促黃體生成素（LH）密切相關，MLT 進入到卵泡后會誘導一系列mRNA 的表達，在人的顆粒細胞中，MLT 可增加促黃體生成素受體（LH-R）mRNA、促性腺激素釋放激素（GnRH）mRNA、促性腺激素釋放激素受體（GnRH-R）mRNA的表達，從而促進卵泡發(fā)育；另一方面可能與MLT的抗凋亡作用有關，過多的活性氧（ROS）可導致卵泡閉鎖，而MLT 及其代謝產物是強大的自由基清除劑，能夠降低氧化酶基因的表達，清除ROS，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，從而保護卵泡的繼續(xù)成長，成為優(yōu)勢卵泡。因此，細胞外信號和卵泡內因子的共同協(xié)同調節(jié)促進有腔卵泡的提前發(fā)育，同時證實了本實驗中卵巢形態(tài)學的發(fā)育與內部卵泡發(fā)育有關。為跟蹤水貂繁殖性能的狀況，探究MLT 埋植劑是否可提高水貂繁殖性能提供前期基礎。

4 結 論

本實驗結果顯示，MLT 埋植劑（18 mg/ 只）埋植172 d 對配種準備期水貂卵巢發(fā)育、可視卵泡、原始卵泡和初級卵泡數量增多及有腔卵泡的提前發(fā)育均有促進作用，但對卵巢寬度、次級卵泡數量及腔前卵泡的直徑、卵母細胞直徑和透明帶厚度沒有影響。