李春海，陳曉英，王紅梅，楊劉玥玲，趙旺生*

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009）

從1961 年Clausen 等在腦脊液中發(fā)現(xiàn)胱蛋白開(kāi)始，人們就對(duì)（Cystatin）基因家族開(kāi)始了深入研究。CST3 是一種相對(duì)低分子質(zhì)量的非糖基化堿性蛋白質(zhì)，是廣泛存在于動(dòng)植物中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在有核細(xì)胞中均有所表達(dá)，其參與細(xì)胞內(nèi)外蛋白水解的調(diào)控，保護(hù)細(xì)胞免受不適當(dāng)?shù)膬?nèi)源性或外源性蛋白酶水解。Frygelius 等發(fā)現(xiàn)編碼一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，基因的整體結(jié)構(gòu)與人類(lèi)和其他II 型的編碼基因非常相似，有2 個(gè)內(nèi)含子位于與人類(lèi)相同的位置，在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)六核苷酸TGTTCT，它是雄激素應(yīng)答元件（ARE）的核心序列，該區(qū)域還包含一個(gè)21 核苷酸序列。CST3 蛋白在功能上與免疫應(yīng)答和精子成熟有關(guān)。在免疫方面，CST3 蛋白的缺少可以導(dǎo)致乳膠脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥和NLRP3 炎性小體的激活。在精子發(fā)生和成熟方面，基因主要從精原干細(xì)胞向早期精母細(xì)胞表達(dá)，并通過(guò)調(diào)節(jié)自噬在小鼠精原干細(xì)胞體外維持和移植后減數(shù)分裂進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。精原干細(xì)胞中的抑制會(huì)損害精子細(xì)胞或精子的產(chǎn)生，CST3 也是晚期生殖細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子?；蜃饔脵C(jī)理是通過(guò)修飾精子表面蛋白和周?chē)后w中的可溶性蛋白來(lái)促進(jìn)精子成熟。研究表明，顯著表達(dá)于男性生殖道，精漿中CST3 蛋白水平較高，約為血清的37 倍。本研究通過(guò)對(duì)基因的克隆和對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用qPCR 技術(shù)對(duì)基因在牦牛附睪各區(qū)段的表達(dá)情況進(jìn)行研究，以期為牦牛提高繁殖力提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取3 頭24 月齡、體格相似、身體健康的公牦牛睪丸組織，牦牛來(lái)自于四川省阿壩州紅原縣屠宰場(chǎng)。使用Hanks 溶液將睪丸組織清洗3 次，并將附睪從睪丸中分離出來(lái)，去除結(jié)締和脂肪組織，將附睪分為附睪頭、附睪體和附睪尾3 個(gè)部分。

1.2 主要試劑 Hanks 溶液，購(gòu)自福州飛凈生物科技有限公司；Trizol 試劑，購(gòu)自廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技有限公司；Taq DNA 聚合酶，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；2X SG Fast qPCR Master Mix 試劑，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR-grade water 試劑，購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；雙蒸水、0.8%的瓊脂糖凝膠，購(gòu)自香港Gene Company Ltd。

1.3 主要儀器 電泳儀，購(gòu)自南京普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所；SpectraMax Quick Drop 超微量分光光度計(jì)，購(gòu)自濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；高速離心機(jī)，購(gòu)自阿法拉伐（上海）技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自寧波江南儀器廠；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自濟(jì)南童鑫生物科技有限公司；微量移液器，購(gòu)自濟(jì)南歐萊博生物科技有限公司。

1.4 牦牛附睪組織總RNA 的提取 根據(jù)Trizol 試劑說(shuō)明書(shū)，提取牦牛附睪頭、體、尾部的總RNA，利用0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳儀檢測(cè)RNA 的完整性，利用SpectraMax Quick Drop 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的質(zhì)量，并保存在超低溫冰箱（-80℃）里。

1.5 克隆及設(shè)計(jì)引物 利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)牦?；虻腜CR 克隆引物，引物序列（5'→3'）為：CF1：GACCATGGTGGGCTCCCC；CR1：TGGC CTGCCTGTTAATCC。以牦牛附睪組織逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用20.0 μL 擴(kuò)增體系：DNA 聚合酶10.0 μL，雙蒸水7.0 μL，混勻的上下游特異性引物2.0 μL（10 μmol/L），附睪組織的cDNA 加1.0 μL（10 μmol/L）。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃4 min；94 ℃30 s；60 ℃30 s，72 ℃2 min，循 環(huán)32 次，72 ℃延伸2 min。將產(chǎn)物電泳檢測(cè)后進(jìn)行DNA 的純化并在超凈工作臺(tái)上與目的片段和載體連接、轉(zhuǎn)化及鑒定后，送成都擎科梓熙生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 CST3 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 利用在線軟件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）分析CST3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用線上軟件SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）對(duì)CST3 蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用線上軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html#opennewwindow）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件分析、檢測(cè)CST3 蛋白的跨膜區(qū)數(shù)量；利用Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）在線軟件分析CST3 蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.7 熒光定量PCR 利用Primer Premier 5.0 軟件對(duì)已克隆得到的基因序列及內(nèi)參基因UXT（NM_174 029.1）序列進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，引物序列（5'→3'）分別為：基因 CF2：CGCAAGCAGGTCGTGTCA；CR2：GGCTGGTTATGGAAGGGA；UXT 基 因UF：TGTGGCCCTTGGATATGGTT；UR：GGTTGTCGCTG AGCTCTGTG。熒光定量操作方法按照2X SG Fast qPCR Master Mix 試劑盒說(shuō)明操作。反應(yīng)體系共10.0 μL：2X SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），PCR-grade water 3.2 μL，模板DNA為1 μL（10 μmol/L），以每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)作為對(duì)照。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min；95℃2 s；60℃25 s；40 個(gè)循環(huán)。利用qPCR 技術(shù)，以內(nèi)參基因作為對(duì)照基因，以附睪頭作為對(duì)照組（CY1、CY2、CY3），附睪體（CY4、CY5、CY6）和附睪尾部（CY7、CY8、CY9）作為處理組，運(yùn)用2方法可計(jì)算出基因在附睪組織頭、體、尾的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 牦?；虻臏y(cè)序及分析 通過(guò)EXPASY 的分析能夠得出，牦?；虻拈_(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為447 bp，含起始密碼子ATG 和終止密碼子TAA（圖1）。NCBI 網(wǎng)站BLAST 同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，牦牛核苷酸序列與印度水牛（登錄號(hào)：KU936088.1）、山羊（登錄號(hào)：XP_013824066.2）和駱駝（登錄號(hào)XP_032317598.1）、犀 牛（XP_017703337.1）相 應(yīng)序列的同源性分別為97.97%、87.16%、68.03%、67.20%。

圖1 牦牛CST3 基因的堿基和氨基酸序列

2.2 牦牛CST3 翻譯蛋白的理化分析 通過(guò)EXPASY在線分析CST3 蛋白的氨基酸理化性質(zhì)，其中含量最高的為異亮氨酸Leu（12.2%），其次為纈氨酸Val（11.5%）、丙氨酸Ala（10.1%），含量最少的為色氨酸Trp（0.7%）。CST3 蛋白的分子量為16.26 ku，其等電點(diǎn)為9.23，為弱堿性蛋白。采用線上軟件對(duì)CST3 蛋白的信號(hào)肽作預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示牦牛CST3 蛋白存在信號(hào)肽序列，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)位于第19 號(hào)和第20 號(hào)氨基酸之間。利用protscale 對(duì)CST3 蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性分析，結(jié)果顯示最大值3.256，在第19 個(gè)位點(diǎn)上；最小值-2.644，在第120 個(gè)位點(diǎn)上，整體為親水性蛋白（圖2）。

圖2 牦牛CST3 基因翻譯蛋白親疏水性預(yù)測(cè)

2.3 牦牛CST3 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析與測(cè)定 對(duì)CST3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)CST3 蛋白的長(zhǎng)度為148 個(gè)氨基酸，CST3 蛋白在螺旋區(qū)有57 個(gè)氨基酸，占比為38.51%；在延伸鏈結(jié)構(gòu)處有21 個(gè)氨基酸，占比為14.19%；在轉(zhuǎn)角區(qū)有2 個(gè)氨基酸，占比為1.35%；在不規(guī)則卷曲狀態(tài)下有68 個(gè)氨基酸，占比為45.95%。

2.4 牦牛基因的跨膜結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測(cè) 對(duì)基因的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)（圖3）分析，結(jié)果顯示CST3 蛋白在7～29 位氨基酸處存在跨膜結(jié)構(gòu)。牦牛CST3 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示CST3 蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞外（圖4）。

圖3 牦牛CST3 蛋白的跨膜分析

圖4 牦牛CST3 蛋白的亞細(xì)胞定位

2.5 牦?；蛟诟讲G不同區(qū)域的表達(dá) 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測(cè)基因在牦牛附睪不同區(qū)段的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)基因在附睪組織的頭部、體部、尾部3 個(gè)區(qū)段中均有表達(dá)，存在顯著差異，其中在附睪頭部表達(dá)量最高，附睪體部和尾部表達(dá)量相對(duì)較低（圖5）。

圖5 牦牛CST3 基因在附睪不同區(qū)域的表達(dá)

3 討 論

基因是編碼胱抑制素相關(guān)的附睪生精蛋白基因，它的缺乏會(huì)導(dǎo)致雄性小鼠在體外顯示出生育缺陷。本研究分析結(jié)果顯示，CST3 蛋白序列長(zhǎng)度為148，CST3 蛋白在螺旋區(qū)有57 個(gè)氨基酸，占比為38.51%；在延伸鏈結(jié)構(gòu)處也有21 個(gè)氨基酸，占比為14.19%；在轉(zhuǎn)角區(qū)有2 個(gè)氨基酸，占比為1.35%。CST3 蛋白的氨基末端是對(duì)含半胱氨酸的蛋白質(zhì)起抑制作用的位點(diǎn)之一，CST3 蛋白氨基末端通過(guò)結(jié)合-淀粉樣前體蛋白，競(jìng)爭(zhēng)性抑制-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生。此外，CST3 的氨基端殘基以及Q88 和C97 可以通過(guò)與硫酸乙酰肝素結(jié)合來(lái)抑制木瓜蛋白酶的活性，在酸性pH條件硫酸乙酰肝素能夠降低CST3 蛋白的抑制能力。基因在附睪中主要控制功能性淀粉樣結(jié)構(gòu)的形成，且在附睪頭部中的表達(dá)量高于附睪尾部，這與本研究結(jié)果相一致。在人和小鼠上的研究表明，CST3 蛋白68 號(hào)氨基酸突變，會(huì)產(chǎn)生L68Q 突變體，使得CST3 蛋白在睪丸中異常積累，對(duì)生育產(chǎn)生不良影響，含有L68Q 型雜合體的小鼠不育。通過(guò)對(duì)L68Q 雜合體小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，L68Q 雜合體小鼠的精子沒(méi)有明顯的結(jié)構(gòu)缺陷，但這種小鼠的精子周?chē)讲G腔液中的成分可能會(huì)與精子表面結(jié)合，導(dǎo)致精子凝集和細(xì)胞膜破壞，最終影響精子的活力和生育能力。在人體中L68Q 胱抑制素C 淀粉樣蛋白的存在會(huì)改變附睪腔內(nèi)環(huán)境，從而導(dǎo)致精子不能具有受精功能。

在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠精原干細(xì)胞中CST3 蛋白的抑制會(huì)損害精子細(xì)胞或精子的物質(zhì)產(chǎn)生，基因在精原干細(xì)胞到早期精母細(xì)胞的分化整個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，并通過(guò)調(diào)節(jié)自噬在小鼠精原干細(xì)胞體外維持和小鼠精原干細(xì)胞移植后減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。核心多能性因子（Oct4、Id1）和關(guān)鍵RNA 結(jié)合蛋白（Nanos3）可以傳遞來(lái)自CST3 蛋白介導(dǎo)的自噬的信號(hào)。在基因表達(dá)敲低的小鼠精原干細(xì)胞中觀察到細(xì)胞增殖抑制和G1 期細(xì)胞周期停滯現(xiàn)象，因此，CST3蛋白也是晚期生殖細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。在正常男性體內(nèi)，CST3 蛋白在睪丸、附睪、輸精管、精囊和前列腺等組織中廣泛分布，基因在精囊和前列腺中高度表達(dá)，說(shuō)明男性生殖器官和精漿中CST3 蛋白的主要含量是由這2 種組織的細(xì)胞產(chǎn)生的，CST3 蛋白也是男性生殖系統(tǒng)正常和病理性蛋白水解的重要調(diào)節(jié)因子。在糖尿病患者精液中，CST3 蛋白的豐富度降低，導(dǎo)致精子的活力降低。CST3 蛋白作為一種孕酮依賴蛋白可以與精子結(jié)合，增強(qiáng)精子活性，但也抑制膽固醇的流出和精子酪氨酸磷酸化，降低精子獲能。在人上的研究發(fā)現(xiàn)，男性生殖器官和精漿中存在的CST3 蛋白主要是由精囊和前列腺小體細(xì)胞產(chǎn)生的。

基因除了在精子的發(fā)生和成熟過(guò)程中起重要作用外，還與一些癌癥發(fā)生、血管和腦部疾病有重要關(guān)系。在癌癥中的研究發(fā)現(xiàn)，CST3 蛋白作為組織蛋白酶B 的抑制劑，被證明是一種促進(jìn)凋亡和生長(zhǎng)抑制因子，并已應(yīng)用于某些癌癥的診斷和預(yù)后。此外，CST3 蛋白可以拮抗多種參與促進(jìn)細(xì)胞侵襲/遷移的關(guān)鍵因素，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-（TGF-）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）。因此，CST3 蛋白在一些癌癥侵襲和遷移中起負(fù)面作用。研究發(fā)現(xiàn)，CST3 蛋白促進(jìn)食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并抑制了細(xì)胞凋亡。在腦動(dòng)脈和外周動(dòng)脈中，CST3 蛋白缺乏可誘發(fā)動(dòng)脈瘤變化。這種變化主要是由于蛋白酶（如組織蛋白酶）的活性不受控制。因此，可以看到結(jié)締組織和血管細(xì)胞的廣泛變化。此外，CST3 蛋白和組織蛋白酶B 的平衡對(duì)于血管重塑至關(guān)重要，并且發(fā)現(xiàn)改變CST3 水平的基因多態(tài)性與腦小血管病等病理學(xué)相關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化中，巨噬細(xì)胞中CST3 蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞出現(xiàn)自噬功能障礙，并隨后導(dǎo)致它們的凋亡，CST3 蛋白在抗原呈遞細(xì)胞的功能上具有性別依賴性，這種性別依賴性調(diào)節(jié)在CD11b+細(xì)胞中比在CD11c+細(xì)胞中更為突出。CST3蛋白在C57BL/6J 小鼠的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)育中也具有性別依賴性作用。相關(guān)研究表明，在女性中，CST3 驅(qū)動(dòng)抗原呈遞細(xì)胞的激活和抗原呈遞能力，從而促進(jìn)CD4+IFN-的產(chǎn)生和中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫。

綜上所述，基因的表達(dá)情況與精子的獲能和成熟有關(guān)，附睪頭部主要通過(guò)分泌各種物質(zhì)對(duì)精子成熟起重要作用，而基因在附睪頭部的高表達(dá)證實(shí)了本研究結(jié)果，但其對(duì)精子成熟和獲能的作用機(jī)制還需要繼續(xù)深入研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆得到了牦牛基因的CDS 區(qū)序列，并對(duì)基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)對(duì)CST3 蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)CST3 蛋白為親水性蛋白，存在跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。經(jīng)過(guò)qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因在牦牛附睪組織不同區(qū)段中分布不均，在附睪頭部的表達(dá)量最高。本研究通過(guò)對(duì)基因在牦牛附睪組織不同區(qū)域的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為牦牛附睪精子成熟的機(jī)制提供基礎(chǔ)材料，同時(shí)為牦牛的育種和繁殖提供研究方向。