李 闖，陳 寧，張振斌，陳逸飛，于 翔，王夢(mèng)芝*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000）

伴隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率不斷提高，同時(shí)產(chǎn)生了大量秸稈、尾菜等廢棄物。2020年我國(guó)的蔬菜產(chǎn)量達(dá)到74 912.90 萬t，按照20%～67%計(jì)算廢棄物的產(chǎn)量，大約產(chǎn)生14 982.58 萬～50191.64萬t 的蔬菜尾菜。蔬菜尾菜富含維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，若不合理利用，會(huì)造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。研究表明，秸稈與尾菜混合青貯可以得到品質(zhì)較優(yōu)的青貯飼料，能夠有效降低干物質(zhì)損失率和pH，并且可以調(diào)控微生物菌群結(jié)構(gòu)。Partovi 等研究表明，西蘭花副產(chǎn)物和麥秸（69:31）混貯飼喂對(duì)法山德羔羊生產(chǎn)性能、血液生化指標(biāo)、瘤胃發(fā)酵參數(shù)沒有影響，說明該混貯飼料可以飼喂法山德羔羊。

本課題組前期研究結(jié)果已表明，稻草秸稈與白菜尾菜的混貯比例為4:6 時(shí)有較好的發(fā)酵品質(zhì)和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究認(rèn)為，飼料間組合效應(yīng)是調(diào)控瘤胃發(fā)酵的重要措施。在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，稻草尾菜混貯飼料（下稱“混貯飼料”）搭配精料共同使用有一定組合效應(yīng)。但混貯飼料與精料的組合使用效應(yīng)還未進(jìn)行估測(cè)。因此，本試驗(yàn)旨在研究不同比例的精料與混貯飼料對(duì)體外產(chǎn)氣及體外瘤胃發(fā)酵的影響，為混貯飼料在育肥湖羊上的飼養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 精料（玉米、豆粕、麥麩）購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)飼料廠。混貯飼料按照本課題組前期試驗(yàn)方法制作完成：稻草秸稈和白菜尾菜質(zhì)量比為4:6，以植物乳桿菌（0.035 g/kg）與纖維素酶（0.250 g/kg）作為添加劑，混貯時(shí)間為45 d?；熨A完成后在65℃下烘干成風(fēng)干樣，粉碎后過40 目篩用于測(cè)定營(yíng)養(yǎng)成分。參照《飼料檢測(cè)與分析實(shí)驗(yàn)技術(shù)》測(cè)定精料與混貯飼料中干物質(zhì)（DM）、粗灰分（Ash）、粗蛋白質(zhì)（CP）、鈣（Ca）、磷（P）、酸性洗滌纖維（ADF）以及中性洗滌纖維（NDF）含量。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 選取5 只健康狀況良好、體況相近、裝有永久性瘺管的育肥湖羊，在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物房單圈飼養(yǎng)。燕麥草、苜蓿為粗飼料，補(bǔ)飼玉米（80%）和豆粕（20%），精粗比為4:6。每日7:00 和19:00 各飼喂等量飼料并且自由飲水。

1.3 瘤胃液采集 在晨飼前，采集瘤胃液，每只湖羊所采瘤胃液不超過500 mL。瘤胃液迅速經(jīng)過4 層紗布過濾至保溫瓶（經(jīng)過39℃熱水預(yù)熱后充滿CO氣體）。隨后將保溫瓶迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，并持續(xù)通入CO。

1.4 人工唾液制備 根據(jù)Menke 等的方法配制人工唾液（A、B、C）、還原劑（NaOH 和NaS·9HO）和刃天青。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 體外發(fā)酵批次培養(yǎng)試驗(yàn) 將精料與混貯飼料按0:100（C0 組）、30:70（C30 組）、50:50（C50 組）、70:30（C70 組）、100:0（C100 組）的比例混合均勻后作為發(fā)酵底物，原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。5 組分別稱取0.5 g 精料與混貯飼料的混合底物于不同100 mL發(fā)酵瓶?jī)?nèi)，每組設(shè)置5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（4、8、12、24、48 h），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3 個(gè)重復(fù)。將50 mL 人工唾液和25 mL 瘤胃液迅速注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，立即通入CO3～5 s，立刻置于SHA-A 型恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)進(jìn)行48 h 體外發(fā)酵培養(yǎng)。各組日糧在培養(yǎng)開始后在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，用4 層紗布初步過濾出殘?jiān)⑹占^濾出的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液分裝至1 個(gè)15 mL 離心管（留存?zhèn)溆茫┖? 個(gè)2 mL 離心管，-80℃冰箱保存，用于測(cè)定氨態(tài)氮（NH-N）、微生物蛋白（MCP）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量。

表1 不同比例的精料與混貯飼料發(fā)酵底物的營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

1.5.2 體外發(fā)酵產(chǎn)氣試驗(yàn) 在進(jìn)行體外發(fā)酵批次培養(yǎng)試驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行體外發(fā)酵產(chǎn)氣試驗(yàn)。按照體外發(fā)酵批次培養(yǎng)試驗(yàn)比例，稱取0.5 g 精料與混貯飼料的混合底物于不同100 mL 發(fā)酵瓶?jī)?nèi)，每組3 個(gè)重復(fù)。將50 mL 人工唾液和25 mL 瘤胃液迅速注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，立即通入CO3～5 s，隨后用橡膠塞和螺蓋蓋緊，將發(fā)酵瓶通過輸液器與64 路AGRS-III 型體外發(fā)酵產(chǎn)氣自動(dòng)記錄裝置的氣路連接，39℃恒溫條件下連續(xù)培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后，用4 層紗布過濾并收集全部殘?jiān)?/p>

1.6 體外發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

1.6.1 產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的計(jì)算 利用?rskov 等提出的公式對(duì)各組產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性曲線回歸擬合：

式中，P表示發(fā)酵液在t 時(shí)間點(diǎn)累積產(chǎn)氣量（mL/g DM）；參數(shù)a 表示發(fā)酵菌發(fā)酵初始時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)氣量，即快速產(chǎn)氣部分（mL/g DM）；參數(shù)b 表示理論最大產(chǎn)氣量，即緩慢產(chǎn)氣部分（mL/g DM）；參數(shù)c 表示產(chǎn)氣速率常數(shù)（mL/h），參數(shù)a 與參數(shù)b 的和（a+b）表示潛在產(chǎn)氣量。

1.6.2 培養(yǎng)液發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定 使用Mettler toledo pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH；酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定培養(yǎng)液中NH-N 含量；三氯乙酸法測(cè)定培養(yǎng)液中MCP 含量；利用日本島津GC-14B 氣象色譜儀內(nèi)標(biāo)法測(cè)定培養(yǎng)液VFAs 含量，并計(jì)算TVFA 以及乙丙比。

1.6.3 48 h 干物質(zhì)降解率（DMD） 發(fā)酵液發(fā)酵48 h 后，置于冰水中進(jìn)行終止發(fā)酵，并用4 層400 目尼龍布過濾發(fā)酵液。殘?jiān)?5℃下烘干24 h，記錄殘?jiān)亓?，用于?jì)算DMD。

1.6.4 組合效應(yīng)的評(píng)估公式

加權(quán)估算值=C0 組測(cè)定值× 混貯飼料的比例+C100 組測(cè)定值×精料的比例

單項(xiàng)組合效應(yīng)指數(shù)（SFAEI）=100% ×（實(shí)際測(cè)定值-加權(quán)估計(jì)值）/加權(quán)估算值

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 記錄并進(jìn)行基礎(chǔ)整理，采用SPSS 20 軟件中的ANOVA 模塊進(jìn)行單因素方差分析，運(yùn)用Duncan's 法進(jìn)行多重比較。＜0.05表示差異顯著，＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)及DMD 的影響 由表2 可知，5 組的快速產(chǎn)氣量之間存在顯著性差異，其中以C0 組最高，C50 組最低。此外，C50 組和C100 組的快速產(chǎn)氣量出現(xiàn)負(fù)值。C70組和C100 組的理論最大產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量、累積產(chǎn)氣量高于C0 組、C30 組、C50 組（＜0.05）。C0 組、C50 組和C70 組的理論最大產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量、累積產(chǎn)氣量隨精料比例的提高而升高（＜0.05）。此外，DMD 隨著精粗比的增加而升高，C100 組DMD 高于其他組（＜0.05）。

表2 精料與混貯飼料不同比例對(duì)48 h 體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)及DMD 的影響

2.2 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外瘤胃發(fā)酵液pH 的影響 由表3 可知，各組培養(yǎng)液pH 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，并且隨著混貯比例降低而越小。在8、24、48 h 時(shí)，培養(yǎng)液pH 隨著精粗比的增加降低（＜0.05）；培養(yǎng)12 h 時(shí)，除C50 和C70 組差異不顯著，其他各組差異顯著。

表3 精料與混貯飼料不同比例對(duì)48 h 體外瘤胃發(fā)酵液pH 的影響

2.3 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外發(fā)酵液NH-N 的影響 由表4 可知，不同比例的精料與混貯在體外發(fā)酵期間NH-N 濃度在7.65～55.82 mg/dL。在8、12 h 時(shí)，C0 組和C30 組高于C70 組和C100 組（＜0.05）；24 h 時(shí)，C0～C70 組高于C100 組（＜0.05）；48 h 時(shí)，C30 組、C50 組、C70 組差異不顯著，但高于C0 組和C100 組（＜0.05）。

表4 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外發(fā)酵液NH3-N 的影響 mg/dL

2.4 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外發(fā)酵液MCP 的影響 由表5 可知，各組MCP 含量隨著體外發(fā)酵時(shí)間增加而升高。12 h 和24 h 時(shí)，C50 組、C70組高于C0 和C30 組（＜0.05）；48 h 時(shí)，C0 組高于C30 組（＜0.05）。

表5 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外發(fā)酵液MCP 的影響 mg/dL

2.5 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)體外發(fā)酵液VFA 的影響 由表6 可知，在8、24、48 h 時(shí)，隨著精粗比增加，TVFA 濃度和丁酸比例呈升高趨勢(shì)。培養(yǎng)12、24、48 h 時(shí)，C50 組、C70 組 和C100 組TVFA 濃 度差異不顯著，但均高于其他組（＜0.05）。培養(yǎng)8 h 時(shí)，C50組和C70 組乙酸比例高于C100 組（＜0.05）；從12 h到48 h，隨著精料增加，乙酸比例減少（＜0.05）。培養(yǎng)4 h 時(shí)，C50 組和C70 組丙酸比例差異不顯著，但二組高于C100 組（＜0.05）；培養(yǎng)8 h 時(shí)，C70 組高于C50 組（＜0.05）。培養(yǎng)4、8 h 時(shí)，C100 組丁酸比例高于C0 組（＜0.05）；培養(yǎng)12、24、48 h 時(shí)，C100 組丁酸比例高于其余各組（＜0.05）。培養(yǎng)4 h 時(shí)，C100組乙酸/丙酸高于C50 組（＜0.05）；培養(yǎng)24、48 h 時(shí)，C50 組高于C70 組（＜0.05）。

表6 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外發(fā)酵液VFA 的影響

2.6 精料與混貯飼料不同比例的組合效應(yīng) 由表7 可知，對(duì)于SFAEI 而言，3 組MCP 都存在負(fù)組合效應(yīng)；C30組累積產(chǎn)氣量、C70 組pH 和NH-N 存在負(fù)組合效應(yīng)；C50 組和C70 組的累積產(chǎn)氣量存在正組合效應(yīng)，C30 組和C50 組的pH 和NH-N 存在正組合效應(yīng)。此外，3 組的TVFA 和DMD 都存在正組合效應(yīng)。3 組MFAEI 均為正組合效應(yīng)，但以C50 組MFAEI 最高。

表7 精料與混貯飼料不同比例的組合效應(yīng)

3 討 論

3.1 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響 體外發(fā)酵產(chǎn)氣量能夠反映飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度及消化程度，體外產(chǎn)氣量越高，說明該日糧的可利用程度越高。瘤胃對(duì)飼料降解所產(chǎn)生的氣體主要源于瘤胃微生物對(duì)飼料內(nèi)蛋白質(zhì)含碳部分以及碳水化合物的降解，快速降解產(chǎn)氣量表示在飼料發(fā)酵前期可降解部分，其大小與該階段可發(fā)酵成分的含量呈正相關(guān)，亦與CP 含量正相關(guān)。在本試驗(yàn)中，快速降解部分并未與CP 含量呈明顯的正相關(guān)關(guān)系并且出現(xiàn)了負(fù)值，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液發(fā)酵前期出現(xiàn)產(chǎn)氣延遲，信號(hào)接收點(diǎn)不穩(wěn)定，隨后逐漸穩(wěn)定，在擬合過程中出現(xiàn)負(fù)值。此外，本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著精料增加，體外產(chǎn)氣量也隨之增加。這可能是由于隨著精料的增加，瘤胃內(nèi)產(chǎn)氣微生物菌群的數(shù)量隨之增加。此外，隨著精料比例的增加，CP 含量逐漸增加，為微生物的發(fā)酵提供了充足的氮源，也可能是產(chǎn)氣量增加的另一個(gè)原因。前人研究表明，產(chǎn)氣速率與日糧中精料的比例呈正比。但在本試驗(yàn)中，并未呈明顯的關(guān)系，這可能是由于在精料與混貯飼料混合同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵的情況下，發(fā)酵先后順序不同導(dǎo)致。本試驗(yàn)中，DMD 隨著精料比例的增加而提高，可能是因?yàn)榫细佑幸嬗诹鑫肝⑸锏脑鲋?，從而提高了DMD。

3.2 不同比例的精料與混貯飼料對(duì)48 h 體外瘤胃培養(yǎng)液發(fā)酵參數(shù)的影響 瘤胃液pH 在一定程度上可以反映瘤胃發(fā)酵情況，與日糧組成、瘤胃內(nèi)有機(jī)酸的濃度、唾液分泌量等因素相關(guān)。瘤胃液pH 正常變化范圍在5.5～7.5，過高或過低均會(huì)影響瘤胃內(nèi)微生物生長(zhǎng)、繁殖以及瘤胃發(fā)酵。本試驗(yàn)中，不同精粗比對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的pH 均產(chǎn)生了顯著影響，并且pH 隨著精粗比的提高而降低。這是由于隨著精料的增加，CP 含量增加，NDF 和ADF 含量降低，積累了大量VFA，降低了瘤胃內(nèi)環(huán)境pH。

瘤胃內(nèi)NH-N 源于內(nèi)源性含氮物質(zhì)或外源性含氮物質(zhì)的降解，也是合成MCP 的主要物質(zhì)，可以在一定程度上反映瘤胃微生物對(duì)含氮物質(zhì)利用情況。如果NH-N 濃度較高，微生物無法及時(shí)合成MCP，就會(huì)造成能量損失；若濃度較低則所合成MCP 無法滿足機(jī)體需求，會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率。有研究表明，瘤胃內(nèi)NH-N 濃度的正常變化范圍在0.35～29 mg/dL。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵48 h 時(shí)，NH-N 濃度已經(jīng)超出瘤胃正常范圍，這可能是在培養(yǎng)過程中沒有將代謝物外移，從而使NH-N 不斷積累。此外，發(fā)酵12 h 之后，除C0 組，隨著精料比例的增加，NH-N 濃度呈降低趨勢(shì)。原因可能是飼料中非碳水化合物含量升高，促進(jìn)瘤胃微生物生長(zhǎng)繁殖，提高NH-N 利用效率。在發(fā)酵12 h 內(nèi)，規(guī)律尚不明顯，這可能是因?yàn)榱鑫肝⑸镞€在適應(yīng)這類飼料。在發(fā)酵48 h 時(shí)，C30 組、C50 組和C70 組之間差異不顯著，說明30%～70%混貯飼料與精料的組合對(duì)NH-N 濃度無影響。

瘤胃內(nèi)微生物可以利用飼料降解產(chǎn)生氨基酸、肽等作為氮源合成MCP，為反芻動(dòng)物的生命活動(dòng)提供40%～80%的蛋白質(zhì)。NH-N 是合成MCP 的前體物質(zhì)，MCP 與NH-N 密切相關(guān)。王仁杰等以閹割南江黃羊作為瘤胃液供體動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)MCP 濃度并沒有隨著精粗比（30:70、50:50、70:30）的增加而增加，其中50:50 組、70:30 組顯著高于30:70 組，50:50 組、70:30組之間差異不顯著。在本試驗(yàn)中，培養(yǎng)48 h 時(shí)，C0 組MCP 含量顯著高于C30 組，可能是因?yàn)樵黾泳系谋壤岣吡肆鑫肝⑸锓纸釳CP 生成NH-N 的能力。

日糧中碳水化合物在瘤胃中的發(fā)酵終產(chǎn)物是VFAs，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。TVFA 以及VFAs能夠反映飼料在瘤胃中的利用效率和瘤胃發(fā)酵方式。本試驗(yàn)中，在發(fā)酵各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TVFA 濃度與精粗比呈正比，這是因?yàn)殡S著精料比例的增加，飼料中纖維類物質(zhì)含量隨之降低，有利于微生物生長(zhǎng)繁殖，從而增加TVFA 含量。但隨著精料比例增加，乙酸比例會(huì)有所下降。乙酸比例與日糧中NDF 含量呈高度正相關(guān)，以混貯飼料作為單一粗飼料也符合這一發(fā)酵特性。一般認(rèn)為，提高日糧中精料比例，可以提高丙酸、丁酸比例，而降低乙酸/丙酸。在本試驗(yàn)中，丙酸比例在發(fā)酵4 h時(shí)含量較高，可能是因?yàn)榛熨A飼料的有機(jī)物含量較高且消化速度更快。但隨著發(fā)酵的進(jìn)行及精料作用的發(fā)揮，精粗比占據(jù)主導(dǎo)作用，但由于混貯中部分可溶性糖之類的物質(zhì)占比較高，導(dǎo)致最終丙酸比例有所增加。此外，乙酸/丙酸的范圍在1.82～2.79，均屬于乙酸發(fā)酵。

3.3 精料與混貯飼料不同比例的組合效應(yīng) 不同飼料組合之間會(huì)產(chǎn)生不同組合效應(yīng)，組合效應(yīng)分為SFAEI 和MFAEI。SFAEI 是從單一方面衡量飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，難以做出全面評(píng)價(jià)；而MFAEI 綜合多個(gè)指標(biāo)對(duì)飼料進(jìn)行評(píng)價(jià)，具有一定參考價(jià)值。本試驗(yàn)綜合考慮發(fā)酵48 h累積產(chǎn)氣量、pH、NH-N、MCP、TVFA 以及DMD 6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算分析組合效應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)3 組日糧均出現(xiàn)了正組合效應(yīng)，可能是因?yàn)榛熨A飼料與精料達(dá)到適宜比例，經(jīng)過瘤胃微生物的作用，各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間以及非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間互作效應(yīng)增加了飼糧的發(fā)酵作用，提高了日糧發(fā)酵效果。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，混貯飼料與精料的組合能夠改善體外瘤胃發(fā)酵特性，即存在正組合效應(yīng)，其中C50 組的組合效應(yīng)值最高，即混貯飼料與精料的最佳比例是50:50。