李榮峰，韋春財(cái)，劉彩華

（百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西 百色 533000）

白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]，又名白及，在日本島內(nèi)亦被叫做“雪如來(lái)”[1]，歸屬蘭科白芨屬植物，是一類(lèi)常年不需要更新繁殖卻可以繼續(xù)生長(zhǎng)的草本植物，屬于稀少的名貴藥材，最早被記錄于秦漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]中，其藥用價(jià)值較高的是長(zhǎng)年生長(zhǎng)于地下的根狀莖，性微寒可去火，味道苦澀含甘味[3]。白芨具有醫(yī)治腫脹中毒，加快新肉生長(zhǎng)，各種出血癥的止血等奇特功效，在亞洲的緬甸北部、中國(guó)以及日本等較為潮濕的地域均有分布，在中國(guó)境內(nèi)的分布極為廣泛，主產(chǎn)省區(qū)有貴州、湖南等[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前從白芨植物中分離出來(lái)的化合物已超過(guò)90 種，主要包括菲、聯(lián)芐、糖苷、類(lèi)固醇、三萜和花青素苷類(lèi)等[4]，其中三萜物質(zhì)主要為環(huán)烷烴三萜類(lèi)化合物[5]。研究表明，三萜類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒（包括艾滋病病毒）等多種功效，在藥物研發(fā)中有很高的利用價(jià)值[6-9]。目前，關(guān)于白芨三萜類(lèi)化合物在防治疾病過(guò)程中對(duì)機(jī)體的作用及其原理已有相關(guān)報(bào)道，但有關(guān)白芨藥材中三萜類(lèi)化合物總量、提取工藝等方面的研究報(bào)道還比較少。為了更好地開(kāi)發(fā)利用白芨資源，筆者通過(guò)超聲波輔助乙醇提取法，用正交試驗(yàn)優(yōu)化白芨中三萜類(lèi)化合物的提取工藝，探究乙醇濃度、料液比、超聲波處理溫度和超聲波處理時(shí)間對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取效果的影響，以期為三萜類(lèi)化合物的后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為中草藥白芨，購(gòu)于云南省。主要試劑有熊果酸、無(wú)水乙醇、高氯酸、冰乙酸、香草醛等試劑，均為分析純。主要儀器設(shè)備有FA11204B 電子天平（安亭電子儀器）、SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器）、TD5A-WS 臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀）、KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）、DK-98-II 電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯儀器）、UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理取干燥的白芨根狀莖，用中藥材粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)60 目篩，清除難以粉碎的大顆粒以及肉眼可見(jiàn)的異物，得到白芨粉末，置于封口袋中密封保存待用。

1.2.2 白芨三萜類(lèi)化合物單因素提取方法（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取白芨粉末0.5 g，在料液比為1 ∶30（g ∶mL，下同）、溫度40℃、超聲波功率350 W 的條件下處理20 min，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響。（2）料液比。精準(zhǔn)稱取白芨粉末0.5 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、溫度為40℃、超聲波功率350 W的條件下處理20 min，研究不同料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50）對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響。（3）超聲波處理時(shí)間。精準(zhǔn)稱取白芨粉末0.5 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1 ∶40、溫度為40℃、超聲波功率350 W 的條件下，研究不同超聲波處理時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響。（4）超聲波處理溫度。精準(zhǔn)稱取白芨粉末0.5 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1 ∶40、超聲波功率350 W 的條件下處理20 min，研究不同溫度（30、40、50、60、70℃）對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化白芨三萜類(lèi)化合物提取工藝經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度4 個(gè)單因素，采用4 因素3 水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），設(shè)置12 個(gè)處理，以優(yōu)化白芨三萜類(lèi)化合物最佳的提取條件。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱量5.00 mg 熊果酸，用少量無(wú)水乙醇溶解，加至25 mL 的容量瓶中定容，制得濃度為0.2 mg/mL 的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。精密吸量0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液（濃度為0.2 mg/mL）至容量為25 mL試管中，在95℃水浴鍋中將溶劑徹底揮發(fā)，再依次加入高氯酸1 mL、5%香草醛-冰乙酸0.3 mL。放入60℃水浴鍋加熱反應(yīng)15 min，加熱結(jié)束后將其取出放置于流動(dòng)的自來(lái)水中加速冷卻，待其冷卻后加入冰乙酸5 mL，充分震蕩，靜置15 min 讓其發(fā)生顯色反應(yīng)，再用紫外分光光度計(jì)在550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

1.3.2 樣品的測(cè)定稱量0.5 g 白芨粉末，用少量無(wú)水乙醇溶解，加至25 mL 容量瓶中定容，按照1.3.1的方法測(cè)定樣品溶液在550 nm 下的吸光度值。將測(cè)得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算三萜類(lèi)化合物的質(zhì)量濃度，并按以下公式計(jì)算白芨三萜類(lèi)類(lèi)化合物的提取率。

提取率（%）=（25C/1 000M）×100

式中：C是樣品中三萜類(lèi)化合物質(zhì)量濃度（mg/mL）；M為稱取的白芨粉末質(zhì)量（g）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3 次取平均值，采用Microsoft Excel 2010 軟件和IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芨三萜類(lèi)化合物提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響 從圖1 可以看到，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%范圍內(nèi)時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，三萜類(lèi)化合物的提取率逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，白芨中三萜類(lèi)化合物的提取率達(dá)到最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，白芨三萜類(lèi)化合物提取率越來(lái)越低。原因可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始乙醇濃度小，沒(méi)能將白芨三萜類(lèi)中的物質(zhì)提取出來(lái)；所以根據(jù)物質(zhì)極性的相似相溶原理，在濃度為70%的乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，三萜類(lèi)物質(zhì)浸提出來(lái)的含量最高。因此，白芨三萜類(lèi)化合物提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響

2.1.2 料液比對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響從圖2 可以看出，隨著溶劑體積的增加，白芨三萜類(lèi)化合物的提取率先增加后下降，當(dāng)料液比為1 ∶40 時(shí)，提取率最高，達(dá)到0.608%，繼續(xù)增加溶劑的體積，提取率有所下降。因此，白芨三萜類(lèi)化合物提取的最佳料液比為1 ∶40。原因可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始乙醇體積不多時(shí)，超聲波沖擊液體產(chǎn)生的氣泡使得介質(zhì)的傳播速率受到限制，所以三萜類(lèi)化合物提取效果不佳；而當(dāng)達(dá)溶劑體積超過(guò)適宜量時(shí)，隨著乙醇體積的增加，超聲波無(wú)法充分發(fā)揮將聲能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮艿淖饔?，振?dòng)效果不佳，不利于三萜類(lèi)物質(zhì)的析出，同時(shí)反而有利于其他物質(zhì)析出，導(dǎo)致三萜類(lèi)化合物提取率下降。

圖2 料液比對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響

2.1.3 超聲波處理時(shí)間對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響 從圖3 可以看出，超聲波處理10～50 min 時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，白芨三萜類(lèi)化合物提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲波處理20 min 時(shí)，白芨三萜類(lèi)化合物提取率達(dá)到最大，為0.644%。當(dāng)超聲波處理時(shí)間超過(guò)20 min 后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，白芨三萜類(lèi)化合物提取率呈直線下降，可能是因?yàn)槌暡üβ蔬^(guò)大，溶液分子運(yùn)動(dòng)過(guò)快，有利于其他成分溶出，但是三萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)被破壞，從而降低了三萜類(lèi)化合物的提取率。因此，超聲波輔助提取白芨三萜類(lèi)化合物的最佳處理時(shí)間為20 min。

圖3 超聲波處理時(shí)間對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響

2.1.4 超聲波處理溫度對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響 從圖4 可以看出，在超聲波處理溫度階梯式的變更中，白芨三萜類(lèi)化合物的提取率并不是隨著溫度的升高而升高，反而是呈下降趨勢(shì)；當(dāng)溫度為40℃時(shí)，白芨三萜類(lèi)化合物提取率最高，為0.646%。原因可能是隨著提取溫度的升高，乙醇的蒸發(fā)速率變快，溶劑量減少，導(dǎo)致三萜類(lèi)化合物難以溶出，從而使提取率下降。因此，超聲波輔助提取白芨三萜類(lèi)化合物的最佳溫度為40℃。

圖4 超聲波處理溫度對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化白芨三萜類(lèi)化合物的提取工藝

根據(jù)單因素結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%和80%，料液比為1 ∶30、1 ∶40 和1 ∶50，超聲波處理時(shí)間為10、20 和30 min，超聲波處理溫度為30、40 和50℃進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)（表2）。從表2中的極差（R 值）數(shù)據(jù)可以看出，各因素對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響程度由大到小排列依次為B ＞A ＞C ＞D，即對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率影響最大的因素是料液比，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，超聲波處理溫度的影響稍小于超聲波處理時(shí)間。從各因素不同水平的均值可以看出，白芨三萜類(lèi)化合物提取的最佳工藝組合為A2B2C1D2，即最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1 ∶40、超聲波處理時(shí)間10 min、超聲波處理溫度40℃。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 白芨三萜類(lèi)化合物的提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

由于最佳工藝組合未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的處理中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證提取工藝的可行性和穩(wěn)定性，在最優(yōu)組合A2B2C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1 ∶40、超聲波處理時(shí)間10 min、超聲波處理溫度40℃的試驗(yàn)條件下，平行重復(fù)3 次試驗(yàn)，結(jié)果如表3 所示，3 次試驗(yàn)白芨三萜類(lèi)化合物的平均提取率為0.645%，且各重復(fù)的提取率均高于正交試驗(yàn)9 個(gè)處理中的最高提取率（0.626%），說(shuō)明該工藝參數(shù)合理可靠，可作為白芨三萜類(lèi)化合物的最佳提取工藝。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

三萜類(lèi)化合物是由數(shù)個(gè)異戊二烯去掉羥基后首尾相連構(gòu)成的物質(zhì)，是一類(lèi)含有多種生物活性成分的重要天然化合物，可加速紅細(xì)胞破裂，具有抗癌癥、抗炎癥、抗微生物、降低膽甾醇以及殺滅貝類(lèi)等軟體動(dòng)物的功效，已成為學(xué)術(shù)研究的熱門(mén)方向之一[10]。提取三萜類(lèi)化合物的方法從最早使用的傳統(tǒng)熱提取法，逐漸衍生出如索式抽提法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、微波-超聲波協(xié)同提取、化學(xué)衍生法、半仿生提取等新興的提取方法[11]。該研究采用超聲波輔助乙醇提取法，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，各因素對(duì)白芨三萜類(lèi)化合物提取率的影響由大到小排列依次為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲波處理時(shí)間＞超聲波處理溫度。在單因素試驗(yàn)中，最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1 ∶40、超聲波處理時(shí)間20 min、超聲波處理溫度40℃；而在正交組合優(yōu)化試驗(yàn)中，最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1 ∶40、超聲波處理時(shí)間10 min、超聲波處理溫度40℃；以此提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，白芨三萜類(lèi)化合物的平均提取率為0.645%。超聲波提取法作為新的輔助提取手段，因其操作簡(jiǎn)便和高效率而受到眾多研究人員的喜愛(ài)，但由于設(shè)備成本較高以及在提取過(guò)程中會(huì)有一部分的有機(jī)溶劑無(wú)法回收，還需在以后的研究中慢慢改進(jìn)。