甄建斌， 伊佳佳， 王龍龍， 劉翰琳， 丁歡歡

(1.太原工業(yè)學(xué)院 材料工程系， 山西 太原 030008； 2.西北大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710127)

0 引言

抗生素對(duì)人類(lèi)健康的價(jià)值毋庸置疑，它的使用改變了人類(lèi)與細(xì)菌感染性疾病長(zhǎng)久斗爭(zhēng)中的弱勢(shì)地位[1-2].隨著人們衛(wèi)生安全意識(shí)的提高，抗菌試劑的產(chǎn)量和消費(fèi)量一直在上升.然而，抗菌試劑在臨床、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等方面的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷發(fā)展增強(qiáng)，耐藥菌的出現(xiàn)使原本有效的抗生素失去其治療效果，因此增加了治療難度和醫(yī)療成本[3-5].另外，由于耐藥基因可在不同菌種之間穿梭而造成多重耐藥菌，使大多數(shù)傳統(tǒng)抗生素對(duì)其束手無(wú)策[6-8].目前，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已成為國(guó)際衛(wèi)生安全棘手的問(wèn)題之一，需要全人類(lèi)共同努力去應(yīng)對(duì)[9-10].

生物相容性良好的殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中含有大量的活性基團(tuán)氨基(-NH2)，氨基在溶液中質(zhì)子化后可賦予其殺菌功效[11-15].然而，在實(shí)際應(yīng)用中，由于殼聚糖的水溶性較差，這大大限制了其應(yīng)用范圍[16-21].另外，納米銀(AgNPs)也是公認(rèn)的最具有潛力的抗菌劑之一，但AgNPs在溶液中易團(tuán)聚沉降的缺點(diǎn)使其應(yīng)用受到很大限制[22-28].基于此，本課題先采用親疏水氨基酸對(duì)殼聚糖改性以制得兩親性肽基殼聚糖Peptide-based chitosan(PBC)，再通過(guò)對(duì)Ag+的原位還原實(shí)現(xiàn)對(duì)AgNPs的穩(wěn)定固載，最終制得肽基殼聚糖載納米銀抗菌材料(PBC@AgNPs).這種新穎結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子特征的PBC載體就像“納米彈”可通過(guò)靜電作用致密地富集在帶負(fù)電的菌體膜表面，從而改變細(xì)胞膜的通透性和膜電位，同時(shí)可提高AgNPs的有效聚集濃度，最終實(shí)現(xiàn)AgNPs和PBC載體之間的協(xié)同增效抗菌作用，這種獨(dú)特的抗菌模式與傳統(tǒng)抗生素不同，具有不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢(shì).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑：

N-ε-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸購(gòu)自北京aladdin公司；亮氨酸、三光氣、頭孢曲松、氫溴酸(70 wt%的乙酸)、三氟乙酸、碘化丙啶(PI)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，購(gòu)自上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清，胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉購(gòu)自西安科昊生物有限公司.四氫呋喃、正戊烷、乙醚、二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司，使用前蒸餾干燥.上述化學(xué)試劑均為分析純.

1.1.2 主要儀器

Agilent-8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫科技公司；370型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet Avatar公司；YX600W臥式圓形電熱蒸汽消毒器，上海市三申醫(yī)療器械公司；Ti-UX型熒光倒置顯微鏡，日本Nikon公司；TMJ-2150型恒溫霉菌培養(yǎng)箱，陜西天美科學(xué)儀器公司；Beckman coulter Avanti J-E離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；FD-1C冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肽基殼聚糖聚合物的合成

根據(jù)本課題組之前的報(bào)道[29]，分別合成Lys-Cbz-NCA和Leu-NCA單體,合成路線如圖1所示.通過(guò)氨基酸-NCA的開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)合成肽基殼聚糖peptide-based chitosan (PBC).首先，分別稱(chēng)取6.12 g Lys-Cbz-NCA和1.57 g Leu-NCA 加入100 mL過(guò)膜的殼聚糖DMF(0.01 g/mL)溶液中.在50 ℃，N2保護(hù)下反應(yīng)72 h，反應(yīng)液在過(guò)量乙醚中沉析.將所得中間產(chǎn)物充分溶于三氟乙酸中(10 mg/mL)，再加入過(guò)量的氫溴酸(70 wt%的乙酸)，在室溫下攪拌12 h，再在過(guò)量乙醚中沉析，經(jīng)透析(MWCO：8000)、冷凍干燥，得到肽基聚合物PBC，合成路線如圖2所示.

圖1 氨基酸-NCA的合成路線

圖2 PBC的合成路線

1.2.2 肽基殼聚糖載納米銀的制備

稱(chēng)取9 mg肽基殼聚糖PBC溶于3 mL四氫呋喃中，將其緩慢滴加到6 mL去離子水中并充分?jǐn)嚢? h，隨后再加入AgNO3溶液(1 mL，0.1 M).在避光條件下勻速攪拌3 h，使肽基殼聚糖結(jié)構(gòu)中的-NH2等雜原子與Ag+充分配位、絡(luò)合，將Ag+吸附在PBC分子結(jié)構(gòu)中，然后緩慢滴入1 mL NaBH4(0.5 M)，將吸附在PBC位點(diǎn)上的Ag+還原成零價(jià)銀原子(Ag0)，繼續(xù)攪拌4 h，Ag0在原吸附位點(diǎn)上(原位)生長(zhǎng)為銀寡聚簇，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，寡聚簇銀繼續(xù)生長(zhǎng)為AgNPs，再經(jīng)去離子水透析48 h，最終制得肽基殼聚糖載納米銀復(fù)合材料(PBC@AgNPs)，如圖3所示.此方法將抗菌PBC作為基體，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)AgNPs的成功負(fù)載，而且克服了單獨(dú)使用納米銀時(shí)易團(tuán)聚沉降的缺陷，同時(shí)達(dá)到了PBS與AgNPs協(xié)同增效的殺菌目的.

圖3 PBC@AgNPs的制備示意圖

1.3 性能測(cè)試與表征

1.3.1 PBC@AgNPs和細(xì)菌細(xì)胞的表征與分析

采用FT-IR和UV-vis分別對(duì)PBC和PBC@AgNPs進(jìn)行表征.PBC的相對(duì)分子質(zhì)量采用GPCmax+TDA305型Viscotek TDAmax科研級(jí)多檢測(cè)器凝膠滲透色譜系統(tǒng)測(cè)定；設(shè)置流動(dòng)相為NaNO3溶液(0.12 mol/L，1.0 mL/min，50 μL).通過(guò)掃描電子顯微鏡SEM(SU8010)觀察 PBC@AgNPs及菌體細(xì)胞經(jīng)PBC@AgNPs作用前后的形貌，將配制濃度為1 mg/mL的PBC@AgNPs溶液，滴置單晶硅片，冷凍干燥.將樣品噴金處理后，在3.0 keV的加速電壓下觀察樣品形態(tài).

1.3.2 抗菌性能測(cè)試

(1)最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定：根據(jù)本課題組之前報(bào)道[11]，采用肉湯稀釋法在無(wú)菌96孔板中測(cè)定PBC@AgNPs的MIC以評(píng)價(jià)其抗菌活性；MIC值為肉眼可見(jiàn)混合懸浮液出現(xiàn)澄清透亮?xí)rPBC@AgNPs所對(duì)應(yīng)的最低的濃度.將E.coli(BL21)，P.aeruginosa，K.pneumonia,MRSA(ATCC43300),VRE和S.aureus(ATCC29213)作為測(cè)試菌株.首先將測(cè)試菌株單克隆菌落接種到10 mL MH培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)菌溶液OD600值達(dá)到0.8時(shí)，再稀釋至106CFU/mL備用.在無(wú)菌96孔板中加入100 μL不同濃度的PBC@AgNPs溶液，再加入100 μL備好的菌液，在37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng).其中，不含菌液的MH培養(yǎng)基(200 μL)和不含PBC@AgNPs的菌液(200 μL)作為對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)至少平行重復(fù)3次.

(2)最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定：MBC是指殺死99%以上細(xì)菌所對(duì)應(yīng)抗菌劑的最低濃度.在上述測(cè)試 PBC@AgNPs的MIC的96孔板中，從大于MIC濃度以上孔中分別吸取50 μL的混合液，將其稀釋105倍，隨后分別吸取10 μL后直接均勻涂抹至固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h.以未經(jīng)過(guò)PBC@AgNPs處理的菌液作為空白對(duì)照.最后，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上菌落形成單位(CFU)，記為CFU/mL，經(jīng)計(jì)算得出PBC@AgNPs的MBC.

1.4 抗菌機(jī)理研究

1.4.1 細(xì)菌形貌分析

為了從微觀角度研究PBC@AgNPs對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的抗菌機(jī)制，通過(guò)SEM觀察細(xì)菌經(jīng)PBC@AgNPs作用前后的形態(tài).以未經(jīng)PBC@AgNPs處理的細(xì)菌細(xì)胞作為對(duì)照.先將測(cè)試菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后用PBC@AgNPs作用8 h.收集菌體細(xì)胞重懸在PBS中，隨后在2.5%的戊二醛溶液中進(jìn)行固定.再收集菌體細(xì)胞，用梯度濃度的乙醇溶液對(duì)菌體細(xì)胞脫水，并用叔丁醇置換乙醇.最后將懸浮液滴加在單晶硅片上，干燥、噴金觀察.

1.4.2 熒光染色實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步探究細(xì)菌經(jīng)PBC@AgNPs作用后，細(xì)胞膜是否完整，選用DAPI和PI對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行熒光染色標(biāo)記.首先，將完好的細(xì)菌單克隆在37 ℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.4～0.6)，并用濃度為2×MIC的PBC@AgNPs作用8 h.然后經(jīng)離心收集菌體細(xì)胞，并用PBS洗滌3～4次，再收集細(xì)胞與PI(5 μg/mL)在0 ℃避光條件下靜置15 min.DAPI的染色過(guò)程同上.以未經(jīng)PBC@AgNPs作用的細(xì)菌細(xì)胞作為對(duì)照.

1.4.3 活性氧簇(ROS)的測(cè)定

PBC@AgNPs在殺菌過(guò)程中釋放的AgNPs可以促發(fā)ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致低氧應(yīng)激反應(yīng)等多種機(jī)制進(jìn)而抑制細(xì)菌的繁殖.為了探究PBC@AgNPs的殺菌機(jī)制，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)PBC@AgNPs作用前后菌體內(nèi)ROS量的變化.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度為5×106CFU/mL的細(xì)菌懸浮液與不同濃度的PBC@AgNPs溶液混合，在37 ℃下孵育8 h.隨后加入氧化應(yīng)激指示劑DCFH-DA(10.0 μM)培養(yǎng)1 h，通過(guò)離心、洗滌后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同菌體細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，以分析細(xì)胞內(nèi)ROS的含量.

1.5 耐藥性評(píng)價(jià)

細(xì)菌經(jīng)常暴露于抗生素環(huán)境時(shí)會(huì)逐漸產(chǎn)生抗藥性.為了評(píng)價(jià)PBC@AgNPs是否容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，將PBC@AgNPs濃度為1/2 MIC孔中的細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600=0.4～0.6)，稀釋至5×106CFU/mL，與不同濃度的PBC@AgNPs溶液混合后加到無(wú)菌96孔板中培養(yǎng).在37 ℃下孵育16 h，得到PBC@AgNPs新的MIC值.重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)連續(xù)傳代14次，通過(guò)分析每次得到的MIC判斷測(cè)試菌株是否產(chǎn)生了耐藥性.以市售抗生素頭孢曲松作為對(duì)照.

1.6 體內(nèi)抗菌活性評(píng)價(jià)

通過(guò)建立小鼠腹腔感染模型評(píng)價(jià)PBC@AgNPs的體內(nèi)抗菌效果.以5～7周齡，20 g左右的昆明雄性小鼠作為研究對(duì)象.用革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureue(ATCC29213)和革蘭氏陰性菌E.coli(BL21)分別將不同組小鼠感染，待不同處理后，監(jiān)測(cè)不同組別中小鼠臟器(心、肝、脾、肺、腎)內(nèi)菌落數(shù)變化，從而評(píng)價(jià)PBC@AgNPs的體內(nèi)抗菌活性.先將感染菌培養(yǎng)至OD600=0.8～1.0，再用無(wú)菌生理鹽水重懸至OD600=0.8.將小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組1(Group 1)和實(shí)驗(yàn)組2(Group 2)，每組小鼠6只.分別對(duì)Group 1和Group 2中的小鼠進(jìn)行腹腔感染，2 h后分別注射生理鹽水和PBC@AgNPs溶液(350 μL，0.4 mg/mL).對(duì)所有測(cè)試小鼠等時(shí)等量連續(xù)注釋 3 d，每12 h一次，隨后解剖取其臟器，充分研磨，吸取10 μL勻漿液均勻涂抹于LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約16 h.通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法(CFU/mL)評(píng)估PBC@AgNPs的體內(nèi)抗菌活性.

2 結(jié)果與討論

2.1 肽基殼聚糖的表征

通過(guò)氨基酸-NCA的開(kāi)環(huán)聚合制得PBC，通過(guò)傅里葉紅外光譜儀對(duì)PBC進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，以分析其結(jié)構(gòu).肽基殼聚糖PBC的紅外光譜圖見(jiàn)圖4所示，3 520 cm-1和2 860 cm-1附近的峰對(duì)應(yīng)PBC中-OH、-NH2和-NH-的伸縮振動(dòng)吸收峰；2 930 cm-1左右的峰是聚合物結(jié)構(gòu)中-CH3、-CH2-的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 670 cm-1處的峰是PBC的酰胺基團(tuán)中羰基(-C=O)的伸縮振動(dòng)吸收峰，該特征峰是由殼聚糖分子中的-NH2對(duì)氨基酸-NCA開(kāi)環(huán)聚合物后形成的新的酰胺基團(tuán)的特征峰；1 450 cm-1左右的特征峰對(duì)應(yīng)-CH2-的吸收峰，1 350cm-1處的峰是-C-N-的特征峰，1 090 cm-1處的吸收峰來(lái)源于分子結(jié)構(gòu)中-C-O-的伸縮振動(dòng).分析以上紅外光譜圖說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功制得了PBC.

圖4 PBC的紅外光譜圖

肽基聚合物PBC的相對(duì)分子量通過(guò)GPC測(cè)定.配置PBC濃度為8 g /L，測(cè)試溫度為30 ℃，測(cè)得PBC的Mw為45 167，Mn為39 166，分散度為1.15，由此說(shuō)明PBC分子量分布較均一.

2.2 肽基殼聚糖載納米銀的表征

從圖5中插圖所示的a瓶可以看出，PBC@AgNPs溶液呈現(xiàn)黃棕色，圖5中插圖所示的b瓶顯示PBC溶液成無(wú)色狀態(tài)，根據(jù)文獻(xiàn)[27]報(bào)道，該結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功制得了納米銀AgNPs.而且，該溶液在室溫避光條件下下靜置保存2 mth后，其溶液狀態(tài)良好，呈現(xiàn)均一透亮狀，更沒(méi)有沉淀出現(xiàn)，該溶液經(jīng)動(dòng)態(tài)激光散射儀測(cè)得PBC@AgNPs的粒經(jīng)約為270 nm，分散系數(shù)PDI為0.67， 由此說(shuō)明AgNPs被PBC穩(wěn)定負(fù)載且PBC@AgNPs在溶液中具有較好分散性和穩(wěn)定性，這克服了AgNPs在溶液中團(tuán)聚沉降的缺陷.同時(shí)，通過(guò)UV-vis分別對(duì)PBC和PBC@AgNPs進(jìn)行表征，結(jié)果如圖5所示，PBC在紫外可見(jiàn)光譜350～600 nm之間沒(méi)有吸收峰，而PBC@AgNPs在420 nm左右有明顯吸收峰，再次確認(rèn)AgNPs的成功制備.

圖5 PBC@AgNPs的紫外可見(jiàn)光譜吸收?qǐng)D(插圖為其在水溶液中的狀態(tài))

2.3 PBC@AgNPs的形貌分析

殼聚糖經(jīng)賴(lài)氨酸和亮氨酸改性后具備兩親性結(jié)構(gòu)，其在溶液中可以通過(guò)自組裝形成納米結(jié)構(gòu)，從而提高其正電荷密度，達(dá)到增強(qiáng)殺菌活性的效果.通過(guò)SEM觀察PBC@AgNPs的形貌，結(jié)果如圖6所示，該納米顆粒為分散型球形納米顆粒，尺寸約為250±10 nm.

圖6 PBC@AgNPs的SEM圖

2.4 抗菌性能分析

從表1中數(shù)據(jù)可以看出，PBC@AgNPs具有良好的廣譜抗菌效果，MIC在6～12 μg/mL之間，MBC值在10～18 μg/mL之間，且滅菌率均在95%以上.其中，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus(ATCC29213)的抗菌效果最好，MIC值為6 μg/mL，MBC值為10 μg/mL，對(duì)耐藥菌VRE和MRSA的MIC值分別為8 μg/mL和10 μg/mL，MBC值分別為12 μg/mL和16 μg/mL.對(duì)革蘭氏陰性菌也顯示出良好的抗菌效果，其MIC和MBC值分別為6～12 μg/mL和12～18 μg/mL.由此說(shuō)明，將AgNPs負(fù)載到PBC分子中，可以達(dá)到協(xié)同增效的滅菌目的.

另外，從表1數(shù)據(jù)可以看出PBC@AgNPs對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌較陰性菌具有更好的抗菌效果，這可能是由于在革蘭氏陰性菌的肽聚糖層外還有一層可以起保護(hù)作用的外層膜脂多糖(LPS)所致，這種額外的LPS在一定程度上阻礙了PBC@AgNPs的殺菌作用.

表1 PBC@AgNPs的抗菌活性

2.5 抗菌機(jī)理研究

為探究納米顆粒PBC@AgNPs的抗菌機(jī)制，通過(guò)SEM觀察其對(duì)菌體細(xì)胞形態(tài)的影響.以未經(jīng)PBC@AgNPs作用的細(xì)菌細(xì)胞作為對(duì)照.從圖7(a)、(b)中觀察到，在沒(méi)有PBC@AgNPs的情況下，細(xì)菌細(xì)胞都具有完整光滑的表面.然而，當(dāng)以濃度為2×MIC的PBC@AgNPs作用細(xì)菌細(xì)胞后，細(xì)菌形貌發(fā)生了明顯改變，如圖7 (c)、(d)所示，作用8 h后，細(xì)菌結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，膜表面出現(xiàn)了褶皺，細(xì)胞實(shí)體結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全坍塌并破裂.由此說(shuō)明，PBC@AgNPs確實(shí)可以機(jī)械性地?fù)p壞菌體細(xì)胞形貌，造成細(xì)菌不可逆轉(zhuǎn)地凋亡.

圖7 細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)PBC@AgNPs作用前后的SEM圖

為了進(jìn)一步探討抗菌納米顆粒PBC@AgNPs對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制，采用DAPI和PI熒光染色實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜通透性的變化.如圖8所示，未經(jīng)PBC@AgNPs作用的細(xì)菌細(xì)胞，用DAPI孵育后發(fā)出藍(lán)色熒光(圖8(a1)、(a2))，而經(jīng)PI孵育后均沒(méi)有發(fā)出紅色熒光(圖8(b1)、(b2))，說(shuō)明測(cè)試細(xì)菌細(xì)胞膜完好.然而，經(jīng)PBC@AgNPs作用后的兩種細(xì)菌再與DAPI作用后發(fā)出了藍(lán)色熒光(圖8(c1)、(c2))，其與PI共混后明顯發(fā)出紅色熒光(圖8(d1)、(d2))，該結(jié)果證實(shí)菌體細(xì)胞經(jīng)納米顆粒作用后，細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)確實(shí)受損，其通透性發(fā)生了改變.

圖8 MRSA(ATCC43300)和E.coli (BL21)的熒光染色圖

PBC@AgNPs中具有“粒子效應(yīng)”的AgNPs可通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，隨后釋放的Ag+可以與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的-SH、二硫鍵等基團(tuán)結(jié)合，進(jìn)而破壞其生理活性.特別是Ag+可以誘發(fā)菌體細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)效抗菌作用.通過(guò)DCFH-DA衡量細(xì)菌經(jīng)PBC@AgNPs作用前后菌體細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化.結(jié)果如圖9所示，菌體細(xì)胞內(nèi)ROS的含量隨著PBC@AgNPs用量的增加而增加；當(dāng)PBC@AgNPs的濃度為9 μg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS的量增加了近15倍；由此說(shuō)明在PBC@AgNPs的殺菌過(guò)程中，AgNPs確實(shí)發(fā)揮了不可忽視的抗菌作用.

圖9 菌體細(xì)胞內(nèi)ROS的含量

2.6 細(xì)菌耐藥性評(píng)價(jià)

耐藥細(xì)菌，特別是多重耐藥細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)市售抗生素都表現(xiàn)出了抗性，人類(lèi)安全健康面臨著巨大挑戰(zhàn).因此，評(píng)估細(xì)菌對(duì)PBC@AgNPs的抗性是非常必要的.在含PBC@AgNPs(1/2 MIC)的培養(yǎng)液中對(duì)細(xì)菌連續(xù)傳代14次，測(cè)定每代細(xì)菌的MIC值.以頭孢曲松作為對(duì)照.測(cè)試結(jié)果如圖10 (a)、(b)所示，對(duì)于S.aureus(ATCC29213)，頭孢曲松的MIC值在第3傳代后就增加了近3倍，傳代14次后增加了近25倍.對(duì)于E.coli(BL21)，頭孢曲松的最小抑菌濃度在第4次傳代后出現(xiàn)了抗藥性，在第14代后提高了近22倍.然而，這兩種不同測(cè)試菌株連續(xù)傳代14代后，PBC@AgNPs對(duì)兩種細(xì)菌的MIC值基本沒(méi)有發(fā)生大幅度變化，更沒(méi)有明顯增加.由此表明，測(cè)試菌株S.aureus(ATCC29213)和E.coli(BL21)對(duì)抗生素頭孢曲松產(chǎn)生了明顯耐藥性，而PBC@AgNPs納米抗菌顆粒不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性.

圖10 不同細(xì)菌細(xì)胞對(duì)PBC@AgNPs的耐藥性評(píng)價(jià)

2.7 體內(nèi)抗菌評(píng)價(jià)

通過(guò)小鼠腹腔感染模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)PBC@AgNPs納米抗菌顆粒體內(nèi)的抗菌效果.從圖11(a)、(b)可以看出，在Group 1中都有明顯的菌落生長(zhǎng)，且菌落數(shù)較大，說(shuō)明小鼠的檢測(cè)組織(心、肝、脾、肺、腎)在3 d內(nèi)一直處于感染狀態(tài)，自身免疫系統(tǒng)不足以抵抗該菌感染.然而，Group 2中的小鼠經(jīng)PBC@AgNPs連續(xù)治療后，各內(nèi)臟組織研磨液中菌落數(shù)的減少明顯非常，該結(jié)果說(shuō)明PBC@AgNPs在體內(nèi)依然具有很好的抗菌效果.

圖11 小鼠體內(nèi)不同組織的菌落數(shù)變化(Heart:Hea.; Liver:Liv.; Spleen:Spl..; Lung:Lun.; Kidney:Kid.)

3 結(jié)論

為了應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性，以殼聚糖為引發(fā)劑，通過(guò)對(duì)氨基酸-NCA的開(kāi)環(huán)聚合合成了肽基殼聚糖(PBC)，并通過(guò)對(duì)Ag+的絡(luò)合、原位還原實(shí)現(xiàn)了對(duì)納米銀(AgNPs)的穩(wěn)定負(fù)載，最終制得PBC@AgNPs，其尺寸約為250 nm(+26.7 mV)左右的納米顆粒.抗菌性能評(píng)價(jià)顯示，該納米顆粒具有很好的廣譜抗菌活性，其MIC值在6～12 μg/mL之間，殺菌率均超過(guò)了95%.經(jīng)SEM、熒光染色和ROS機(jī)理探究顯示，PBC@AgNPs能不可逆轉(zhuǎn)地破壞菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、通透性，同時(shí)促發(fā)胞內(nèi)ROS的釋放，導(dǎo)致低氧應(yīng)激反應(yīng)等多種機(jī)制聯(lián)合殺菌，這種殺菌模式使即使是多重耐藥菌也難以抵抗，最終致細(xì)菌不可逆轉(zhuǎn)地凋亡.小鼠體內(nèi)感染模型表明，PBC@AgNPs在體內(nèi)也具有良好的抗菌活性.PBC@AgNPs這種獨(dú)特的抗菌機(jī)制使細(xì)菌沒(méi)有機(jī)會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，這為有效應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性提供了一種安全有效的潛在策略.