陳超杰 葉美麟 覃妮鳳康宸毓 江 政 黃 蘅 羅達(dá)龍*

（1梧州學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣西梧州 543002；2梧州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西梧州 543002）

鉤吻（Gelsemium elegans Benth.）是馬錢科胡蔓藤屬多年生常綠藤本植物，廣泛分布在我國的南部至西南地區(qū)，又稱為斷腸草、胡蔓草、大茶藥、野葛、過山風(fēng)等。鉤吻雖然是一種劇毒植物，但在民間常通過外用方式治療疥癩、濕疹、跌打損傷及風(fēng)濕等病痛，且使用歷史悠久[1]。生物堿是鉤吻主要活性成分，同時(shí)也是主要毒性物質(zhì)[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鉤吻生物堿具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗風(fēng)濕和抗焦慮等藥理作用[3]。本文分析鉤吻不同部位的生物堿分布，以期為鉤吻的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料。供試植物為鉤吻植株，包含根、莖、葉和花，采購自廣西壯族自治區(qū)梧州市，采收日期為2019年11月。

1.1.2 試劑。供試試劑有：鉤吻生物堿對(duì)照品，購買信息詳見表1；甲醇、甲酸、乙腈，均為色譜純，購自美國歐姆尼公司；氨水、鹽酸，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 鉤吻生物堿對(duì)照品

1.1.3 試驗(yàn)儀器。試驗(yàn)儀器有MCX固相萃取柱（型號(hào) CreoleMCX60mg/3mL，美國歐姆尼公司）；0.22 μm有機(jī)濾膜（美國歐姆尼公司）；三重四極桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 1290-QQQ6490，美國安捷倫公司）；電子天平（Quintix224-1，德國賽多利斯公司）；全自動(dòng)平行濃縮儀（AutoEVA-60，?？萍瘓F(tuán)股份有限公司）；超純水凈化系統(tǒng)（UVF，英國ELGA PURELAB Classic公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液制備。精密量取適量的11個(gè)鉤吻生物堿標(biāo)準(zhǔn)品后，分別加入甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為 4、10、20、40、100、200 ng/mL 混合溶液，作為本研究對(duì)照品溶液備用，對(duì)照品溶液均為現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 鉤吻總堿溶液制備。鉤吻總堿溶液的制備方法見參考文獻(xiàn)[4]。簡述如下：將干燥的鉤吻根、莖、葉和花粉碎過40目篩，分別稱取3份，每份100.0 g，分別加入95%乙醇1 L、0.8 L和0.6 L進(jìn)行浸泡，加熱回流3次，每次2 h，減壓過濾合并提取液，濃縮至無乙醇味。稀釋至100 mL，并加入H2SO4調(diào)pH值至1，抽濾得到酸水液，用CH2Cl2萃取，取酸水層堿化，CH2Cl2萃取，取水層，加壓濃縮后得到浸膏，減壓干燥得到鉤吻根、莖、葉和花4個(gè)部位的鉤吻總堿。鉤吻總堿用1%鹽酸稀釋至4%，超聲提取30 min后離心（3 000 r/min）5 min，取上清液2.00 mL到已活化的MCX柱進(jìn)行淋洗和洗脫，取洗脫液，用40℃氮吹至干燥，加入含0.1%甲酸的50%甲醇水1.00 mL溶解，0.22 μm有機(jī)濾膜濾過備用。

1.2.3 色譜條件。本試驗(yàn)采用Thermo Accucore aQ色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），以甲酸水（A）-乙腈（B）作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式，梯度設(shè)置為0～1.5 min（85%A）、1.5～2.0 min（55%A）、2.0～2.5 min（10%A）、2.5～3.5 min（0%A）、3.5～5.5 min（85%A），流速為0.40 mL/min，柱溫為35℃。進(jìn)樣量控制為1 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件。離子源是ESI源，參數(shù)設(shè)置如下：毛細(xì)管電壓為3 500 V（正離子模式）；離子源溫度為150℃；干燥氣流量為15 L/min；霧化氣壓力為25 Psi；鞘氣溫度為350℃；鞘氣（N2）流量為12 L/min。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

通過Graph Pad Prism 7.0軟件，采用方差檢驗(yàn)分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系結(jié)果分析

根據(jù)以上色譜條件進(jìn)行檢測分析，以鉤吻生物堿對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、離子掃描模式測得的質(zhì)量數(shù)峰面積為縱坐標(biāo)（y）建立線性回歸方程，經(jīng)計(jì)算分析后，鉤吻素甲、鉤吻素子、鉤吻素戊、（Z）-阿枯米定堿、鉤吻素己、鉤吻綠堿、蘭金斷腸草堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丁、N-甲氧基無水老刺木堿二醇和常綠鉤吻堿在一定濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系（表2）。

表2 11個(gè)鉤吻生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度、重現(xiàn)性和加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

分別取11種生物堿的對(duì)照品10 ng/mL，按上述儀器條件平行測定6次，計(jì)算它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；取鉤吻總堿溶液，按上述儀器條件平行測定6次，計(jì)算重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；取同一批鉤吻總堿溶液，分別添加濃度為200、1 000 μg/kg的對(duì)照品，按上述儀器條件平行測定6次，計(jì)算回收率。11個(gè)鉤吻生物堿檢測的精密度、重復(fù)性、回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。它們的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.6%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.3%，表明該方法的重復(fù)性好；添加 200 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為93.2%～98.8%，添加1 000 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為94.4%～97.6%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 11個(gè)鉤吻生物堿檢測的精密度、重復(fù)性和回收率

2.3 不同部位的鉤吻生物堿含量測定

對(duì)鉤吻根、莖、葉和花4個(gè)部位的11種鉤吻生物堿含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4。4個(gè)部位鉤吻生物堿含量從高到低依次是根＞葉＞花＞莖。從根的鉤吻生物堿含量來看，11種生物堿的檢出量從高到低依次為鉤吻素甲＞鉤吻素子＞鉤吻綠堿＞鉤吻素己＞胡蔓藤堿?。竞賶A乙＞（Z）-阿枯米定堿＞鉤吻素戊＞N-甲氧基無水老刺木堿二醇＞蘭金斷腸草堿＞常綠鉤吻堿。

表4 鉤吻不同部位的11種生物堿含量比較 單位：（mg·g-1）

3 結(jié)論與討論

鉤吻4個(gè)部位的生物堿含量從高到低依次為根＞葉＞花＞莖。從根的鉤吻生物堿含量來看，11種生物堿的檢出量從高到低依次為鉤吻素甲＞鉤吻素子＞鉤吻綠堿＞鉤吻素己＞胡蔓藤堿?。竞賶A乙＞（Z）-阿枯米定堿＞鉤吻素戊＞N-甲氧基無水老刺木堿二醇＞蘭金斷腸草堿＞常綠鉤吻堿。說明鉤吻根部是獲取生物堿的最佳提取部位；根部含量較高的生物堿鉤吻素甲、鉤吻素子和鉤吻素己可能是主要的藥理和毒性活性成分。

本研究使用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法確定11種鉤吻生物堿的含量，方法便捷靈敏、準(zhǔn)確可靠，便于快速掌握鉤吻的活性成分[4-5]。

鉤吻是世界聞名的劇毒植物，具有良好的藥用前景，生物堿是其主要活性成分。因此，有必要對(duì)鉤吻的主要部位根、莖、葉和花的生物堿含量進(jìn)行檢測，為其合理高效應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，鉤吻根的生物堿含量最高，莖的含量最低，兩者相差約10倍，葉和花的含量也不足根的1/3。在利用鉤吻植物制備生物堿過程中，應(yīng)盡量挑選鉤吻根作為原料，若將該植物的各個(gè)部位混合進(jìn)行制備，將會(huì)降低生物堿的產(chǎn)量。

在鉤吻根中，含量最多的生物堿成分是鉤吻素甲、鉤吻素子、鉤吻綠堿和鉤吻素己。有研究發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子在中國鉤吻生物堿檢出量中最高，其次是鉤吻素甲[2]，而本次研究的結(jié)果則與之存在一定的差異，這可能與鉤吻產(chǎn)地、采摘時(shí)間和提取方法的差異有關(guān)。在這些含量較高的生物堿中，鉤吻素甲、鉤吻素子和鉤吻素己相關(guān)的藥理和毒性研究報(bào)道較多，這3種物質(zhì)在鎮(zhèn)痛和抗焦慮等方面表現(xiàn)較為突出，但鉤吻素己的急性毒性最大[6-7]。綜上所述，推斷出鉤吻素甲和鉤吻素子具有較好的成藥性，而鉤吻素己則可作為研究鉤吻中毒的代表性活性物質(zhì)。