粗莖秦艽根結(jié)線蟲病的病原鑒定

李云霞, 楊艷梅, 李朝鳳, 彭昌田, 胡先奇*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室, 昆明 650201;2. 云南省麗江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 麗江 674100)

粗莖秦艽GentianacrassicaulisDuthieexBurk.為龍膽科秦艽組植物,是一種重要的中藥材,以干燥根入藥,味辛、苦,性平,入肝、膽、胃經(jīng),具有祛風(fēng)濕、清濕熱、退虛熱、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、健胃促消化的功效[1-2]。粗莖秦艽主要分布于云南、貴州、四川、西藏等海拔2 300～3 800 m的高山草甸、山坡草地、灌叢及林緣[3-4]。云南省麗江市為粗莖秦艽的道地產(chǎn)區(qū),是我國最大的粗莖秦艽種植基地,種植面積近1 000 hm2[5]。

根結(jié)線蟲Meloidogynespp.是一類重要的植物病原物,分布于世界各地、適應(yīng)能力和繁殖能力強,寄主范圍廣,超過3 000種,可侵染糧食、油料、纖維、煙草、茶葉、果蔬、花卉、藥用植物等[6],據(jù)報道人參、三七、西洋參、黃芪、桔梗、麥冬、梔子、燈盞花、羅漢果、地黃等百余種藥用植物受根結(jié)線蟲危害[7-8],目前,根結(jié)線蟲病是影響藥用植物生產(chǎn)的主要因子之一,已經(jīng)嚴(yán)重影響高價值藥用植物栽培的發(fā)展。廣西永福的羅漢果種植面積在2010年達(dá)3 350 hm2,其中80%的地塊受根結(jié)線蟲危害,受害較輕者減產(chǎn)20%～30%,嚴(yán)重者可減產(chǎn)50%以上[9]。根結(jié)線蟲病的發(fā)生不僅降低了藥用植物的產(chǎn)量,還影響著藥用成分的累積,根結(jié)線蟲侵染越嚴(yán)重越不利于單株三七主根和須根皂苷的合成和累積[10],陜西商洛40%以上的桔梗成品因根結(jié)線蟲病失去了商品和藥用價值,給該地區(qū)的桔梗產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。

我們在調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn),種植于云南省麗江市的粗莖秦艽受到根結(jié)線蟲病嚴(yán)重危害,且發(fā)生普遍,由于粗莖秦艽多年連作,其根結(jié)線蟲病害呈逐年加重趨勢,該病害現(xiàn)已成為制約麗江市粗莖秦艽產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。迄今尚未見麗江粗莖秦艽根結(jié)線蟲病研究的相關(guān)報道,為明確粗莖秦艽根結(jié)線蟲病病原線蟲種類,于2020年6月至10月3次到麗江市魯?shù)猷l(xiāng)調(diào)查采樣,采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定粗莖秦艽根結(jié)線蟲病病原種類。本研究結(jié)果將為制定有針對性的防治措施提供理論依據(jù),對保持麗江粗莖秦艽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)本采集

2020年6月至10月在云南省麗江市魯?shù)猷l(xiāng)采集具有明顯根結(jié)的粗莖秦艽植株,該時段粗莖秦艽處于分蘗期,采集完整植株及根際土,做好標(biāo)注后帶回實驗室進(jìn)行觀察、分離與鑒定,共采集6個標(biāo)本,編號為QJ1～QJ6。

1.2 病株田間癥狀觀察

用自來水將病根沖洗干凈,紙巾吸干水分后,在體視顯微鏡下觀察根部癥狀,并拍照記錄。

1.3 根結(jié)線蟲的分離

2齡幼蟲:將病根沖洗干凈,在體視鏡下挑取單卵塊放入裝有1 mL蒸餾水的1.5 mL離心管中,28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化得到2齡幼蟲,一部分2齡幼蟲人工接種到空心菜上保種擴繁,另一部分置于65℃水浴鍋中2～3 min殺死,用4%的甲醛溶液固定保存[12],用于形態(tài)指標(biāo)測量。

雌成蟲:解剖根結(jié),挑取雌成蟲,用于形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

2齡幼蟲:在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察、形態(tài)指標(biāo)[13]測量和拍照。

雌成蟲:在顯微鏡下觀察雌成蟲的形態(tài)并拍照、測量其形態(tài)指標(biāo)[13]。

會陰花紋制作與觀察:參照謝輝[14]的方法進(jìn)行,將單條雌成蟲放在滴有45%乳酸的有機玻璃板上,用解剖刀切取會陰花紋部分,用細(xì)小柔軟毛刷將附著在角質(zhì)層上的組織清理干凈,將會陰花紋移入滴有純甘油的載玻片上,外側(cè)朝上,蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察會陰花紋形態(tài)并拍照。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

1.5.1DNA提取

根結(jié)線蟲DNA的提取參照Adam等[15]的方法稍做改進(jìn):挑取單條雌成蟲放入加有5 μL ddH2O的200 μL PCR管中,用滅菌槍頭刺破蟲體,加入5 μL細(xì)胞裂解液(1 μL 10×PCR Buffer (Mg2+,free)、0.8 μL MgCl2、0.05 μL蛋白酶K、3.15 μL ddH2O),短暫離心,放入液氮中冷凍20 min,加入10 μL石蠟油,短暫離心,置于PCR儀中56℃反應(yīng)80 min,95℃反應(yīng)15 min,得到根結(jié)線蟲DNA提取液。

1.5.2rDNA-ITS區(qū)、mtDNA-COⅠ區(qū)序列擴增得到的DNA提取液選用引物F195/V5367擴增rDNA-ITS序列,F195:5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′,V5367:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′[16],用引物COX1F/COX1R擴增mtDNA-COⅠ序列,COX1F:5′-GGCTGAGCATAGTAGATGATGTT-3′,COX1R:5′-CTACAACATAATAAG-

TATCATG-3′[17],25 μL PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(Mg2+,PLus) 2.5 μL、dNTPs 2 μL、10 μmoL/L上、下游引物各1 μL、DNA模板2.5 μL、Taq酶0.25 μL、ddH2O 15.75 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,55℃或54℃退火30 s(F195/V5367退火溫度為55℃,COX1F/COX1R退火溫度為54℃),72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物,取5 μL擴增產(chǎn)物、1 μL 6×DNA Loading buffer混勻后點入1.2%瓊脂糖凝膠膠孔,110 V、180 mA條件下電泳30 min,使用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

回收PCR擴增產(chǎn)物,回收產(chǎn)物連接到pMDTM18-T載體,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞液中加入50 μL SOD培養(yǎng)基,37℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。取150 μL菌液涂布在LB(氨芐青霉素)固體培養(yǎng)基上,過夜培養(yǎng),挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定,將陽性克隆委托擎科生物科技有限公司測序,測序結(jié)果在GenBank中BLAST比對分析[12]。

1.5.3SCAR特異性片段擴增

使用北方根結(jié)線蟲的特異性引物Mh-F/Mh-R擴增,Mh-F:5′-GGCTGAGCATAGTAGATGATGTT-3′,Mh-R:5′-ACCCATTAAAGAGGAGTTTTGC-3′[18]。PCR反應(yīng)體系同1.5.2。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL擴增產(chǎn)物、1 μL 6×DNA Loading buffer混勻后點入1.2%瓊脂糖凝膠膠孔,110 V、180 mA條件電泳30 min,使用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序結(jié)果提交至National Center for Biotechnology Information(NCBI)核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對。采用MAGA 6.0軟件的鄰接法(neighbor-joining, NJ)以1 000進(jìn)行bootstrap校驗,構(gòu)建基于rDNA-ITS和mtDNA-COⅠ的系統(tǒng)發(fā)育樹,分析病原線蟲的親緣關(guān)系[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗莖秦艽根結(jié)線蟲病田間癥狀

被線蟲侵染的粗莖秦艽葉片黃化,長勢不良,根部膨大,形成根結(jié),侵染嚴(yán)重時,根上形成串珠狀根結(jié)及大根結(jié),主根也出現(xiàn)根結(jié),根結(jié)處有白色卵塊溢出,部分卵塊在溢出根表皮前有淺紅色膠狀物包裹(圖1)。

2.2 病原線蟲形態(tài)學(xué)特征

2齡幼蟲頭冠狹小,頭區(qū)無環(huán)紋,透明尾有明顯界限,尾端通常無紋,少數(shù)尾端有縊縮,尾尖闊圓或尖(圖2a～c),形態(tài)測量數(shù)據(jù)見表1。雌成蟲蟲體梨形,頸短,頸部與體分界不明顯,口針纖細(xì),口針基部球球形或扁球形,中食道球卵圓形或圓形,中食道球瓣卵圓形(圖2d、e),形態(tài)測量數(shù)據(jù)見表1。雌成蟲會陰花紋整體呈卵圓形,背弓中等高或低平,線紋平滑至波浪形,側(cè)線不明顯,背線與腹線相遇呈一定角度,從而露出側(cè)線的痕跡,有時線紋向一側(cè)或兩側(cè)形成翼,尾區(qū)有刻點(圖2f),故將其初步鑒定為北方根結(jié)線蟲Meloidogynehapla。

圖2 粗莖秦艽根結(jié)線蟲病病原形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of pathogenic nematode of Gentiana crassicaulis

2.3 分子生物學(xué)鑒定

使用通用引物V5367/F195對粗莖秦艽病原線蟲rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴增,6份標(biāo)本中分離到的根結(jié)線蟲均能擴增出約770 bp的目的條帶,使用通用引物COX1R/COX1F擴增粗莖秦艽病原線蟲mtDNA-COⅠ區(qū),6份標(biāo)本中分離到的根結(jié)線蟲均能擴增出大小約410 bp的目的條帶(圖3)。使用北方根結(jié)線蟲的特異引物Mh-F/Mh-R擴增6份標(biāo)本中分離到的根結(jié)線蟲均能擴增出約為1 500 bp的特異性片段(圖4),綜上,將危害粗莖秦艽的根結(jié)線蟲鑒定為北方根結(jié)線蟲。

圖3 6份粗莖秦艽樣本中根結(jié)線蟲rDNA-ITS序列、mtDNA-COⅠ序列擴增片段電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of PCR product of rDNA-ITS and mtDNA-COⅠ sequences from root-knot nematode on six samples of Gentiana crassicaulis

2.4 病原線蟲PCR產(chǎn)物序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

6份標(biāo)本中分離到的根結(jié)線蟲rDNA-ITS序列在BLAST中比對,結(jié)果均與北方根結(jié)線蟲(登錄號為MT249016.1、KJ572385.1、MT951634.1)相似,相似性為100%,mtDNA-COⅠ區(qū)序列在BLAST中比對,結(jié)果均與北方根結(jié)線蟲(登錄號為MT251177.1、JX683718.1、AY268113.1、MH128567.1、MH399801.1、JX683718.1)相似,相似性為100%。

6份標(biāo)本上分離到的根結(jié)線蟲rDNA-ITS序列以100%的支持率與GenBank中已登錄的北方根結(jié)線蟲(登錄號為MT249016.1、KJ572385.1、MT951634.1)聚為一支,mtDNA-COⅠ區(qū)序列以99%的支持率與GenBank中已登錄的北方根結(jié)線蟲(登錄號為MT251177.1、JX683718.1、AY268113.1、MH128567.1、MH399801.1、JX683718.1)聚為一支,故將其鑒定為北方根結(jié)線蟲(圖5)。

3 結(jié)論與討論

本研究通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法將粗莖秦艽根結(jié)線蟲病的病原鑒定為北方根結(jié)線蟲,屬國內(nèi)在粗莖秦艽上的首次報道,研究結(jié)果為制定粗莖秦艽根結(jié)線蟲病的防治方案提供了理論依據(jù)。北方根結(jié)線蟲是世界上最常見的4種根結(jié)線蟲之一[21],通常分布于北方冷涼地區(qū)。在云南,北方根結(jié)線蟲主要分布在海拔 1 700 m以上的地區(qū),根據(jù)現(xiàn)有報道,昆明、蒙自、大理等地均發(fā)現(xiàn)有北方根結(jié)線蟲的分布[22-23]。多數(shù)藥用植物種植在高海拔地區(qū),氣候冷涼,這些區(qū)域恰巧適合北方根結(jié)線蟲生存。前人調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)附子、三七、人參、白術(shù)、甘草、決明、黨參等藥用植物都受到北方根結(jié)線蟲危害[24-26];在河北省安國縣有62種藥用植物被北方根結(jié)線蟲危害[27];據(jù)統(tǒng)計我國14個省、市、自治區(qū)有100余種藥用植物受到根結(jié)線蟲的危害,其中70余種藥用植物受到北方根結(jié)線蟲危害[7]。麗江市魯?shù)猷l(xiāng)海拔在2 100 m以上,年平均氣溫11℃,霜期180 d左右,年平均氣溫較低,該地區(qū)地理環(huán)境適宜北方根結(jié)線蟲生存,在調(diào)查研究中也僅發(fā)現(xiàn)北方根結(jié)線蟲危害,這和前人的研究報道是一致的。

是否存在其他種類根結(jié)線蟲為害粗莖秦艽,是一個值得探索的問題。本研究所采集的標(biāo)本僅局限于麗江市魯?shù)猷l(xiāng)粗莖秦艽種植區(qū),要評估該病的發(fā)生范圍,還需擴大樣本采集區(qū)域,進(jìn)一步開展相應(yīng)工作。

根結(jié)線蟲病的發(fā)生為害將嚴(yán)重影響粗莖秦艽的生產(chǎn),應(yīng)加強粗莖秦艽根結(jié)線蟲病的防控。鑒于粗莖秦艽為藥用植物,采用綠色綜合防治策略是粗莖秦艽產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)的有效途徑。建議在粗莖秦艽種植過程中注重育苗地的選擇及管理,防止種苗攜帶根結(jié)線蟲病;與菊科、禾本科等根結(jié)線蟲非寄主植物輪作,可明顯降低土壤中根結(jié)線蟲蟲口數(shù)量[28];施用淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus等微生物菌劑可通過改變根系微生態(tài),促進(jìn)植株生長,抑制根結(jié)線蟲的侵染,同時這些微生物還能寄生在根結(jié)線蟲卵和幼蟲體內(nèi)使其死亡[29];施用生物活性有機肥可改良土壤,增加植株株高、莖粗和地上部分生物量,并對根結(jié)線蟲病有良好抑制效果[30]。藥用植物的特殊性決定了粗莖秦艽的質(zhì)量尤為重要,為使粗莖秦艽達(dá)到高效、安全、綠色無污染的標(biāo)準(zhǔn),在粗莖秦艽根結(jié)線蟲病防治方面,科學(xué)地將農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治和生物學(xué)防治等方法相結(jié)合,以達(dá)到專一性強、操作簡單并且對人畜環(huán)境無害等要求。