戶乃麗

（首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是生成各種血細(xì)胞的最起始細(xì)胞，又稱多能造血干細(xì)胞，有著長期自我更新能力和分化成各類成熟血細(xì)胞的潛能［1］。常用的流式檢測(cè)手段主要有兩類，依據(jù)細(xì)胞功能和表面標(biāo)記物，前者主要是依據(jù)干細(xì)胞表面的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⑦M(jìn)入胞內(nèi)的核酸染料Hochest33342排出而識(shí)別出HSCs［2］，后者目前應(yīng)用更為廣泛，采用多個(gè)表面標(biāo)記共同標(biāo)記造血干細(xì)胞，應(yīng)用較廣泛的如LSK（Lineage-，Sca-1+，c-Kit+）方案［3，4］，在該群體中，還存在一些祖細(xì)胞，因此SLAM（Signaling lymphocyte activation molecule）家族蛋白CD48、CD150被加入識(shí)別長期造血干細(xì)胞（long-term HCSs，LT-HSCs，CD48-CD150+LSK）、短期造血干細(xì)胞（short-term HCSs，ST-HSCs，CD48+CD150+LSK）和多能造血祖細(xì)胞（multipotential hematopoietic progenitor cell，MPPs，CD48+CD150-LSK），其表達(dá)不受小鼠品系和發(fā)育階段等的影響［5］。流式技術(shù)可以根據(jù)表面標(biāo)識(shí)物將HSCs各亞群識(shí)別并實(shí)現(xiàn)精確的分選，但是在實(shí)際操作中遇到的困難是：首先HSCs含量過低，分選后所得到的細(xì)胞純度欠佳，其次分選時(shí)間過長，細(xì)胞活性難以保證，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合Lineage磁珠對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)純化，并加入識(shí)別細(xì)胞死活的染料7-AAD，建立了一種高效的檢測(cè)和高純度分選小鼠骨髓造血干細(xì)胞方案。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠20只，SPF級(jí)，體質(zhì)量28～30 g，5～6周齡，購于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度40%～70%，正常飲水進(jìn)食。

1.2 試劑與儀器

Lineage Cell Depletion Kit試 劑盒，MiniMACS分離器及分離柱購自Miltenyi Biotec；臺(tái)盼藍(lán)，7-AAD試 劑 購 自Sigma Aldrich；lineage cocktail-FITC、 c-Kit-APC、 Scal-1-Percp-cy5.5、CD48-BV421、CD150-PE購自Biolegend；熒光補(bǔ)償微球購自eBioscience；紅細(xì)胞裂解液、流式細(xì)胞儀質(zhì)控CST微球、Accudrop beads購自BD；實(shí)驗(yàn)所用儀器為BDAriaⅢ型流式細(xì)胞分選儀，配有488 nm、561 nm、633 nm、405 nm 4只激光器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨髓單細(xì)胞懸液的制備

頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下去除脛骨及股骨，去除周圍肌肉，剪開骨骺端，用5 ml的注射器吸取PBS+2%胎牛血清反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液并用注射器反復(fù)吹打，200目過濾網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，而后加入5mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫孵育10分鐘，離心機(jī)1500 r/min離心5分鐘，棄上清后加入PBS離心漂洗1～2次重懸浮，得到骨髓單細(xì)胞懸液。平均每只小鼠可獲得骨髓細(xì)胞5×107個(gè)細(xì)胞。

1.3.2 分選儀器的準(zhǔn)備

儀器準(zhǔn)備主要是液流參數(shù)和斷點(diǎn)的調(diào)節(jié)，鞘液桶和水桶用75%酒精浸泡消毒4h以上，用純水沖洗干凈，鞘液桶中加入無菌PBS，運(yùn)行開機(jī)程序，安裝85 μm噴嘴，分選電壓4500V，F(xiàn)req設(shè)定為47.4，調(diào)節(jié)液滴振幅Ampl，使GaP值和Drop1維持穩(wěn)定，而后選中主液流框的sweet spot鍵開啟液流自動(dòng)監(jiān)控。上樣Accudrop beads微球調(diào)節(jié)液滴延遲為30.31，微球在initial或fine tune模式下都達(dá)到側(cè)液流偏轉(zhuǎn)以99%以上，此時(shí)儀器具備分選條件。

1.3.3 流式細(xì)胞染色和分選

將收集到的骨髓細(xì)胞，F(xiàn)c-R阻斷劑封閉后根據(jù)說明書配比加入anti-mouse lineage cocktail-FITC、c-Kit-APC、Scal-1-Percp-cy5.5、CD48-BV421、CD150-PE，4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，將細(xì)胞懸液加PBS定容至2 ml，加入20 μl 7-AAD混勻待上機(jī)，上樣后通過陰性對(duì)照和扣除對(duì)照管確定目的細(xì)胞群，收集各群細(xì)胞比例數(shù)據(jù)并圈定Lineage-，Sca-1+，c-Kit+細(xì)胞群體進(jìn)行分選，接收管中預(yù)置0.5 mL培養(yǎng)基或工作液接收所得細(xì)胞。

1.3.4 磁珠純化后流式分選

取5×107個(gè)骨髓細(xì)胞，加入50μL生物素抗體Biotinylated lineage cocktail，4℃孵 育30 min，PBS清洗1次，加入100μL抗生物素抗體磁珠，4℃孵育15 min，PBS清洗1次，將磁柱置于磁力架上，將單細(xì)胞懸液經(jīng)過磁柱分選，收集流下的細(xì)胞再次過磁柱，PBS沖洗磁柱一次，收集磁珠分選后的液體，離心去上清定容，依次加入按配比加入流式檢測(cè)抗體，染色和流式分選LSK細(xì)胞方法同前。

1.3.5 分選后純度檢測(cè)

吸取400 μL分選后的細(xì)胞上流式細(xì)胞儀，在原分選方案中檢測(cè)分選后細(xì)胞的純度及各亞群的表達(dá)。

1.3.5 分選后細(xì)胞存活率檢測(cè)

吸取新提取的細(xì)胞懸液90 μL，加入0.4%臺(tái)盼蘭溶液10 μL，充分混勻后。加入改良的牛鮑計(jì)數(shù)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞見未被染色細(xì)胞為活細(xì)胞。細(xì)胞存活率=拒染細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓干細(xì)胞的染色結(jié)果

每個(gè)樣品收集1～2×106的細(xì)胞數(shù)據(jù)得到正常小鼠造血干細(xì)胞比例，7-AAD-活細(xì)胞為81.5±4.2%，Lineage-細(xì)胞（P2），LSK（P3）及LT-HSCs、ST-HSCs、MPPs各群細(xì)胞（Q1、Q2、Q3）比例如表1所示，圖1顯示為單次檢測(cè)結(jié)果，P3門為分選的目的細(xì)胞群。

圖1 正常小鼠骨髓干細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

表1 正常小鼠骨髓干細(xì)胞分群表達(dá)情況（x±s，n=4，% Parent：在上一級(jí)邏輯門中的比例）

2.2 流式直接分選和磁珠加流式分選結(jié)果

骨髓細(xì)胞經(jīng)Lineage-磁珠預(yù)純化后，Lineage-細(xì)胞 群 由 原 來 的（13.1±2.35）%增 加 為（53.6±4.35）%，如圖2所示（P＜0.05），由于Lineage-細(xì)胞的富集，使得LSK由之前的（0.2±0.03）%Total增加至（5.6±0.2）%Total，此富集后的樣品再經(jīng)流式染色分選，LSK可近一步純化為（93.6±1.1）%，比單一流式分選純度（82.5±1.7）%有所提升，如圖3（P＜0.05）。5只小鼠骨髓細(xì)胞混合共得到LSK+細(xì)胞約為3×105。CD150，CD48在LSK中各亞群比例不受磁珠和流式分選的影響，相比分選前無顯著變化。

圖2 磁珠分選前后Lineage-細(xì)胞比例的變化情況

圖3 LSK細(xì)胞分選結(jié)果

2.3 分選后LSK細(xì)胞存活率

經(jīng)臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，流式分選細(xì)胞存活率（91.3±2.03）%，磁珠+流式分選得到細(xì)胞存活率為（90.7±1.54）%，P＞0.05。

3 討論

3.1 樣品的染色

小鼠造血干細(xì)胞最常用的表面標(biāo)記分子是LSK，同時(shí)，可通過SLAM家族蛋白CD150，CD48進(jìn)一步將細(xì)胞分為3個(gè)亞群，即LT-HSCs、ST-HSCs，MPPs。LT-HSCs具有很強(qiáng)的自我更新能力，可以維持機(jī)體終生的造血，但由它分化而來的ST-HSCs以及MPPs只能在短期內(nèi)執(zhí)行造血功能［6］，MPPs具有多向分化潛能，可進(jìn)一步分化為淋巴祖細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞。無論是LSK，或者CD150，CD48，在全部骨髓細(xì)胞中都屬于低表達(dá)量，因此在熒光抗體的選擇上應(yīng)注意選擇熒光強(qiáng)度較強(qiáng)或中強(qiáng)的抗體，例如：PE、BV421、APC等，而Lineage+細(xì)胞屬于被排除掉的部分，因此要選取熒光強(qiáng)度較弱的FITC等熒光素。若抗體熒光強(qiáng)弱搭配不當(dāng)，有可能導(dǎo)致含量低的LSK細(xì)胞被掩蓋［7］，陽性率不準(zhǔn)確。由于實(shí)驗(yàn)樣品在抽吸沖洗骨髓組織以及離心過程中不可避免地產(chǎn)生死細(xì)胞，因此檢測(cè)方案中加入識(shí)別細(xì)胞死活的染料是必要的，對(duì)于檢測(cè)，死活染料的加入可去除死細(xì)胞引起的非特異著色，對(duì)于分選，有助于提高分選后細(xì)胞的活性。目前流式多用的細(xì)胞死活染料分為兩大類，核酸染料和氨基反應(yīng)性染料［8］，氨基反應(yīng)性染料可以用于標(biāo)記固定和非固定過的細(xì)胞，染色后需要洗滌，有可能對(duì)細(xì)胞數(shù)量造成少量損失。核酸染料以7-AAD為主，主要適用于非固定細(xì)胞的表面標(biāo)記物的染色，7-AAD的優(yōu)點(diǎn)在于染色快捷，樣品上機(jī)前加入，無需洗滌，缺點(diǎn)是它的激發(fā)和發(fā)射光譜范圍較寬，與PE，APC等常用染料存在漏光，樣品檢測(cè)時(shí)需設(shè)立單陽樣品調(diào)節(jié)補(bǔ)償。對(duì)于本方案由于Sca-1、c-Kit、CD48、CD150表達(dá)量低，在調(diào)節(jié)補(bǔ)償時(shí)，單陽樣品的陽性峰非常不明顯，無法準(zhǔn)確調(diào)節(jié)補(bǔ)償值，因此，對(duì)于這一類低陽性率樣品，推薦使用熒光補(bǔ)償微球進(jìn)行各通路補(bǔ)償值的調(diào)節(jié)。

3.2 樣品的分選

分選后細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞的活性和純度是評(píng)估分選效果的重要指標(biāo)。AriaⅢ型流式細(xì)胞儀每小時(shí)識(shí)別處理約為1～2×107個(gè)細(xì)胞，對(duì)于含量僅有0.1～0.2%的LSK細(xì)胞群，直接分選的弊端在于耗費(fèi)時(shí)間過長，獲取目的細(xì)胞困難，分選后純度不佳。在本實(shí)驗(yàn)中，由于樣品中含有約90%的Lineage+細(xì)胞群的干擾，因此，利用生物素抗體Biotinylated lineage cocktail，再經(jīng)生物素與磁珠結(jié)合，將樣品過兩遍分離柱，去除一半以上的Lineage+細(xì)胞，可顯著提升目的細(xì)胞LSK在樣品中的比例，明顯縮短分選時(shí)間。由于在實(shí)際操作中，磁珠分選會(huì)造成細(xì)胞總數(shù)的損失，因此，在此方案中，不必要求將Lineage-細(xì)胞純化至90%以上，只需去除一半即可，這樣可避免細(xì)胞過多丟失且能節(jié)省抗體，再結(jié)合后續(xù)的流式分選，能夠得到純度90%以上的LSK細(xì)胞。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)中使用的FACSAriaⅢ型流式細(xì)胞儀，在流式細(xì)胞儀分選設(shè)置上，首先要注意調(diào)節(jié)穩(wěn)定的液流參數(shù)，液流的穩(wěn)定是保證分選準(zhǔn)確進(jìn)行的基礎(chǔ)，分選過程中開啟液流“sweet spot”模式，一旦液流不穩(wěn)定時(shí)分選能夠自動(dòng)停止，防止液滴飛濺污染影響收集管中細(xì)胞的陽性率。此外，液滴延遲的調(diào)節(jié)是十分重要，可自動(dòng)結(jié)合手動(dòng)重復(fù)調(diào)節(jié)確定正確的Drop delay數(shù)值，一旦液流參數(shù)發(fā)生變化，需要重新校準(zhǔn)Drop delay，這些是保證分選進(jìn)行的基本條件。在分選過程中，選取的是85 μm的噴嘴，上樣速度控制在6000～8000 evts/秒，此時(shí)回收率可達(dá)85～90%之間，較少有細(xì)胞丟失，通過上述手段，可以將含量僅為0.1～0.2%Total的LSK純化為91.3±2.03%，同時(shí)活性也在90%以上，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。