胥雅靜 王佳偉 趙巖秋 江 成 黃李超 安 軼 曾 為 張 進 盧孟柱

(浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術(shù)學院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

木材即次生木質(zhì)部，是維管形成層細胞增殖、分化的產(chǎn)物，包含木質(zhì)部細胞次生細胞壁加厚的過程(Chaffeyetal., 2002)。次生壁是木材的主要成分，主要由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等構(gòu)成。其中木質(zhì)素是植物中含量僅次于纖維素的第二大高聚物(Zhangetal., 2020)。

木質(zhì)素可提供植物機械支撐力，并可作為天然屏障抵御生物侵害，在植物生長過程中起重要作用(Voelkeretal., 2010)。木質(zhì)素在木材產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用有利有弊：一方面木質(zhì)素存在會降低傳統(tǒng)造紙的出漿率和紙張質(zhì)量；另一方面木質(zhì)素可作為生物質(zhì)固碳并在新能源開發(fā)上得到利用(Wengetal., 2008)?；趯δ举|(zhì)素的不同需求，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控木材中木質(zhì)素含量具有重要意義(李少鋒, 2019)。

木質(zhì)素由對香豆醇、松柏醇和芥子醇3種單體按照一定比例組合而成。木質(zhì)素生物合成過程中有很多酶參與催化反應(yīng)(Boerjanetal., 2003)，根據(jù)木質(zhì)素生物合成途徑中不同酶的作用部位，可通過調(diào)節(jié)酶活性實現(xiàn)對木質(zhì)素生物合成的調(diào)控。肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、香豆酸-3-羥基化酶(C3′H)、阿魏酸-5-羥基化酶(F5H)是3種木質(zhì)素單體合成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位細胞色素P450單氧酶，分別催化3種單體前體的合成。C3′H、C4H、F5H是具有錨點或成核中心的拓撲結(jié)構(gòu)特征的Ⅰ型膜蛋白，能與該途徑中其他酶結(jié)合調(diào)控木質(zhì)素代謝通路(Bassardetal., 2012; Scottetal., 2016)。在苜蓿(Medicagosativa)中降低C4H、C3′H表達能夠減少木質(zhì)素含量，而F5H表達的改變不影響木質(zhì)素的含量(Reddyetal., 2005)。在木本植物毛果楊(Populustrichocarpa)中有參與促進P450單氧酶形成復合物的膜蛋白，可以確保酶活性以進行高效催化(Chenetal., 2011)。

膜相關(guān)孕激素受體(MAPRs)是一類具有非共價細胞色素b5-like類固醇結(jié)合域(cytochrome b5-like haem/steroid-binding domain，Cyt-b5)的小分子蛋白質(zhì)，可以調(diào)節(jié)P450酶活性(Chenetal.，2011; Kimuraetal.，2012; Ryuetal., 2017; Mifsudetal., 2002)。膜類固醇結(jié)合蛋白(MSBP)AtMSBP1是植物中鑒定的第一個膜類固醇結(jié)合蛋白，屬Cyt-b5蛋白超家族(Kaoetal.，2005; Mifsud et al., 2002)，MSBP1是擬南芥(Arabidopsisthaliang)中響應(yīng)甾體信號的關(guān)鍵蛋白，在負調(diào)節(jié)細胞伸長、響應(yīng)鹽脅迫和調(diào)控木質(zhì)素合成等過程中發(fā)揮重要作用(Shietal., 2011; Witzeletal., 2018; Yangetal., 2008; Gouetal., 2018)。鑒于MSBP1對植物生長發(fā)育的多重影響，該蛋白被進一步認為是質(zhì)膜衍生的內(nèi)吞小泡，可以通過參與生長素轉(zhuǎn)運蛋白PIN2的循環(huán)調(diào)節(jié)生長素的再分配(Yangetal., 2008)，以及通過介導BR信號受體BAK1的內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)BR信號(Shietal., 2011; Songetal., 2009)。近期在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，MSBP1可與其同系物MSBP2形成復合體，并與3種木質(zhì)素單體合成P450單加氧酶相互作用，從而形成MSBP-P450酶蛋白復合物。MSBPs可以維持相互作用的P450酶的活性和穩(wěn)定性，對于可溶性酚酯和苯丙烷類單體生物合成十分重要 (Shietal., 2011; Gouetal., 2018)。

楊樹是研究木本植物生長發(fā)育的模式物種，揭示楊樹木材形成機制可為林木育種提供重要理論支撐?；贛SBP調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要作用，研究其在楊樹木材形成，尤其是木質(zhì)素合成中的作用具有重要意義。鑒于此，本研究通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和實時熒光定量PCR，從銀腺楊84K(PopulusalbaXP.glandulosa‘84K’)克隆得到擬南芥AtMSBP1同源基因PagMSBP1/2a，進行理化性質(zhì)和亞細胞定位分析后，進一步構(gòu)建PagMSBP1/2a基因過表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得過表達PagMSBP1/2a的轉(zhuǎn)基因楊樹，分析植株生長發(fā)育和木質(zhì)素含量，為研究MSBP1對木本植物木質(zhì)素合成的調(diào)控作用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗材料為銀腺楊無性系84K，由浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室林木木材品質(zhì)研究團隊保存。試驗所用楊樹均由組培苗擴繁而來，并由組培苗移栽至培養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。楊樹幼苗培養(yǎng)條件為16 h/8 h(光照/黑暗)，溫度25 ℃。取不同組織樣品用于基因表達組織特異性分析。

試驗所使Gateway入門載體pDNOR207、帶GFP的過表達載體PMDC43、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌種均購自維地生物?？俁NA提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit購自TaKaRa公司，PCR高保真酶Prime STAR HS、DNA marker等購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Gateway試劑盒購于Life Technologies公司。

1.2 楊樹MSBP基因獲取及結(jié)構(gòu)分析

取擬南芥AtMSBP1序列在楊樹基因組中進行Blast分析，獲取楊樹MSBP基因的氨基酸序列； 通過MEGA7軟件基于遺傳距離的鄰近法構(gòu)建擬南芥和楊樹的MSBP基因系統(tǒng)進化樹(Kumaretal., 2016)。根據(jù)擬南芥和楊樹的MSBP基因序列信息，通過GSDS2.0在線分析擬南芥和楊樹MSBP基因的內(nèi)含子與外顯子結(jié)構(gòu)，并繪制基因結(jié)構(gòu)圖(Huetal., 2015)。

1.3 RNA提取、cDNA合成及組織特異性表達分析

將不同組織樣品在液氮中研磨成粉，頂芽、根、幼莖(1～3節(jié)間)、老莖(6～8節(jié)間)、葉的RNA提取與cDNA的合成分別采用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)和PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)完成，具體方法參見試劑盒使用說明。qPCR使用CFX96 Real-time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, CA)，反應(yīng)體系按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)說明書，每個樣品4個重復。PCR程序： 95 ℃，30 s預(yù)變性； 95 ℃，5 s變性，55 ℃，30 s退火，72 ℃，30 s延伸，35次循環(huán)。內(nèi)參基因為PtACTIN。楊樹MSBP1/2基因定量引物(表1)使用在線引物設(shè)計軟件BatchPrime(https:∥probes.pw.usda.gov/batchprimer3/index.html)設(shè)計得到。利用楊樹資源數(shù)據(jù)庫(AspWood, http:∥aspwood.popgenie.org)獲取MSBPs在木材形成過程中的表達情況 (Sundelletal., 2017)。

1.4 楊樹PagMSBP1/2a基因的克隆與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)毛果楊中PtMSBP1/2a(Potri.015G139800)基因序列，在銀腺楊84K基因組數(shù)據(jù)庫(Qiuetal., 2019)中進行Blast分析以得到其同源基因PagMSBP1/2a，使用Primer3設(shè)計特異引物PagMSBP1/2a-F和PagMSBP1/2a-R，以84K楊cDNA為模板，利用高保真聚合酶Prime STAR HS進行PCR擴增，得到目的基因PagMSBP1/2a后進行測序驗證。使用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)和TMHMM網(wǎng)站(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對MSBP1/2a蛋白的三級結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析預(yù)測。通過NCBI Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和植物基因組網(wǎng)站(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)對不同物種中MSBP1氨基酸序列進行查找獲取。利用DNAMAN軟件對多物種MSBP1蛋白氨基酸序列比對分析，獲得保守結(jié)構(gòu)域。

表1 84K楊PagMSBP1/2基因克隆和定量PCR引物Tab.1 Primer sequences for 84K poplar PagMSBP1/2 cloning and qPCR analysis

1.5 載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

使用特異引物gw-PagMSBP1/2a-F和gw-PagMSBP1/2a-R，利用Gateway技術(shù)將PagMSBP1/2a基因連接至入門載體pDNOR207上，后分別連接至帶GFP熒光蛋白標簽的載體pMDC43和過表達載體pMDC32，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并測序驗證。將構(gòu)建好的35S∷GFP-PagMSBP1/2a轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Marker SPAtWAK2-CFP-HDEL (cyan) (Zengetal., 2016)共同在野生型本氏煙草葉片下表皮細胞中表達，過夜暗培養(yǎng)后室溫培養(yǎng)3天取樣共聚焦顯微鏡觀察。將構(gòu)建好的過表達載體35S∷pMDC32-PagMSBP1/2a利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化84K楊(Zhouetal., 2019)，將篩選的轉(zhuǎn)基因植株提取RNA進行qPCR分析，選擇表達量較高的2個過表達轉(zhuǎn)基因株系進行試驗。

1.6 組織切片染色及木質(zhì)素含量測定

每個株系各選3株在營養(yǎng)土中生長9周的楊樹苗，觀察植株生長的表型變化。取其基部節(jié)間約1 cm長，用振動式切片機(LEICA VT1 200 S)進行切片，厚度40 μm，分別用0.05%的甲苯胺藍O(TBO)染液和1%間苯三酚-HCL染液染色，鏡檢觀察，拍照記錄。

取生長5個月的PagMSBP1/2a過表達和對照84K楊莖部作為材料，樣品80 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過40目篩，稱取約5 mg(記為W)，采用乙酰溴法測定總木質(zhì)素含量(Barnesetal., 2017; Fosteretal., 2010)，參照科銘生物的木質(zhì)素含量檢測試劑盒說明書進行，按照以下公式計算木質(zhì)素含量:

木質(zhì)素(mg·g-1干質(zhì)量)=((ΔA-0.006 8)×Vt×

10- 3×T)/(0.069 4×W)。

式中： ΔA為測定管OD280讀值-空白管OD280讀值；Vt為反應(yīng)總體積2.04 mL；T為稀釋倍數(shù)；W為樣本質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹MSBP基因的序列分析

以擬南芥MSBP1蛋白序列在毛果楊和84K楊基因組中進行同源序列比對，分別得到MSBP同源基因。利用MEGA7軟件構(gòu)建楊樹和擬南芥MSBP基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖1A)，楊樹中MSBP成員根據(jù)進化樹中兩物種間的對應(yīng)關(guān)系進行命名，其中與AtMSBP1、AtMSBP2同源關(guān)系較近的基因有3個，分別命名為PtMSBP1/2a、PtMSBP1/2b和PtMSBP1/2c； 與AtMSBP3同源的基因有2個，分別命名為PtMSBP3a和PtMSBP3b； 與AtMSBP4同源的基因有2個，分別命名為PtMSBP4a和PtMSBP4b。84K楊中MSBP命名同理。同時利用GSDS2.0進行基因結(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建結(jié)構(gòu)圖(圖1B)。楊樹中MSBP1同源基因PtMSBP1/2a與PtMSBP1/2b長度均為2 kb左右，而PtMSBP1/2c長度不到1 kb，在基因結(jié)構(gòu)上3個基因都各包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，與擬南芥MSBP1基因結(jié)構(gòu)相比具有保守性，表明進化歷程中結(jié)構(gòu)相對保守。

圖1 擬南芥與楊樹中MSBP基因分析Fig. 1 Phylogenetic tree and gene structure of MSBP from Arabidopsis and PopulusA.楊樹MSBP與擬南芥同源蛋白的系統(tǒng)進化樹分析 B.擬南芥與楊樹MSBP基因結(jié)構(gòu)分析。Pt:毛果楊； At： 擬南芥； Pag: 84K。A. Phylogenetic tree analysis of homologous proteins of Populus and Arabidopsis. B. Structural analysis of MSBP genes in Arabidopsis and Populus. Pt: Populus trichocarpa; At: Arabidopsis thaliana； Pag: 84K.

圖2 PtMSBP1/2基因表達分析Fig. 2 Tissue-specific expression analysis of PtMSBP1/2A. qPCR分析PagMSBP1/2a、PagMSBP1/2b和PagMSBP1/2c基因在84K楊樹頂芽、葉、幼莖、老莖和根中的表達; B.楊樹PtMSBP1/2a、PtMSBP1/2b和PtMSBP1/2c基因在韌皮部、形成層及木質(zhì)部中的表達。A. qPCR analysis of the expression of PagMSBP1/2a, PagMSBP1/2b and PagMSBP1/2c genes in 84K poplar top buds, leaves, young stems, old stems, and roots; B. Analysis of PtMSBP1/2a, PtMSBP1/2b PtMSBP1/2c gene in phloem, cambium and xylem expression.

圖3 PagMSBP1/2a序列結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 The sequence analysis of PagMSBP1/2aA. 6種植物同源MSBP1蛋白氨基酸序列比對，下劃線代表Cyt-b5保守結(jié)構(gòu)域； B.PagMSBP1/2a蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測； C. PagMSBP1/2a氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測,峰值即代表跨膜結(jié)構(gòu)域。A. Alignment of the amino acid sequence of MSBP1 protein with homologous genes of other species, the underline represents the Cyt-b5 conserved domain; B. PagMSBP1/2a protein tertiary structure prediction; C. The transmembrane domain prediction of PagMSBP1/2a amino acid sequence, the peak value represents the transmembrane domain.

圖4 PagMSBP1/2a亞細胞定位分析Fig. 4 Subcellular localization of PagMSBP1/2aA. GFP-PagMSBP1/2a亞細胞定位載體圖; B.熒光共聚焦表明PagMSBP1/2a定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。A. PagMSBP1/2a subcellular localization vector map; B. GFP-PagMSBP1/2a localized on the endoplasmic reticulum by fluorescence confocal microscope tracking.

2.2 楊樹MSBP基因組織表達分析

取土培6個月的84K楊的頂芽、葉、嫩莖、老莖和根提取RNA，qPCR分析PagMSBP1/2a、PagMSBP1/2b和PagMSBP1/2c基因表達情況，結(jié)果表明，3個基因在頂芽、葉、莖和根中均有表達，其中PagMSBP1/2c在各組織的表達量相對較低。PagMSBP1/2a在老莖表達量最高，為表達量最低的幼莖中的6倍，另外，PagMSBP1/2a在莖中的表達顯著高于其他2個基因(圖2A)。參考AspWood數(shù)據(jù)庫(http:∥aspwood.popgenie.org)對3個基因在韌皮部、形成層及木質(zhì)部中的表達譜進行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)楊樹MSBP1的3個成員均在成熟木質(zhì)部表現(xiàn)出高表達，同時根據(jù)相對表達量分析，發(fā)現(xiàn)PtMSBP1/2a在木質(zhì)部與韌皮部中的表達相對較高(圖2B)。為此，本研究選擇PagMSBP1/2a基因深入研究其在楊樹木材形成中的調(diào)控作用。

2.3 PagMSBP1/2a基因克隆及序列分析

對84K楊中克隆出的PagMSBP1/2a基因分析發(fā)現(xiàn)，PagMSBP1/2a包含一個全長648 bp 的CDS，編碼215個氨基酸，由2個外顯子組成，分子量為2.33 kDa，理論等電點(PI)為4.53。利用DNAMAN軟件進行多重序列比對表明，PagMSBP1/2a蛋白序列與毛果楊、擬南芥、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和番茄(Solanumlycopersicum)5種植物的MSBP1蛋白序列相似度較高，一些區(qū)域存在明顯的保守序列。MSBP蛋白在單子葉和雙子葉植物中具有一定保守性，且都有Cyt-b5結(jié)構(gòu)域(圖3A)。應(yīng)用ExPAsy提供的SWISS-MODEL 對PagMSBP1/2a蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，以人類膜相關(guān)孕激素受體組分1(PGRMC1)蛋白(4x8y.1.A)為模板，同源建模PagMSBP1/2a蛋白的完整氨基酸序列，預(yù)測所得模型見圖3B，分析表明此蛋白具有類固醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是一個α+β混合結(jié)構(gòu)，2對α-螺旋在β-折疊的一側(cè)形成三明治口袋結(jié)構(gòu)。采用TMHMM網(wǎng)站對MSBP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果表明，PagMSBP1/2a在N端第22～44位氨基酸形成跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3C)。

2.4 亞細胞定位分析

將35S∷GFP-PagMSBP1/2a重組載體在煙草表皮細胞中瞬時表達，分析其在細胞中的定位。結(jié)果表明，在注射含有35S∷GFP-PagMSBP1/2a過表達載體農(nóng)桿菌的本氏煙草葉片表皮細胞中，在488 nm波長的激發(fā)光下使用共聚焦熒光顯微鏡觀察到的GFP熒光信號與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Marker重合，表明PagMSBP1/2a蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖4)。

2.5 PagMSBP1/2a過表達載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

為深入研究PagMSBP1/2a基因?qū)顦渖L發(fā)育的作用，實驗構(gòu)建了35 S∷35S∷PagMSBP1/2a表達載體(圖5A)，采用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹，獲得了過量表達的轉(zhuǎn)基因株系(PagMSBP1/2a-OE)。通過PCR鑒定和qPCR檢測表達情況后，獲得PagMSBP1/2a過量表達的陽性轉(zhuǎn)基因苗。選取2個表達量較高的株系#24、#33進行試驗(圖5C)。生長9周的過表達PagMSBP1/2a楊樹株高生長明顯低于對照(圖5B)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，過表達PagMSBP1/2a楊樹2個株系株高分別比對照株高減少21%、5%。

圖5 PagMSBP1/2a過表達載體圖譜及轉(zhuǎn)基因植株Fig. 5 PagMSBP1/2a overexpressed vector and transgenic PopulusA.PagMSBP1/2a過表達載體圖 B. PagMSBP1/2a過表達植株表型C.選定的過表達植株P(guān)agMSBP1/2a基因的相對表達量。A. Vector of PagMSBP1/2a overexpression. B. Phenotype of PagMSBP1/2a overexpressed Populus C. Relative expression of PagMSBP1/2a gene in selected overexpressed plants.

2.6 過表達PagMSBP1/2a對木質(zhì)素合成的影響

MSBP1是調(diào)控木質(zhì)素合成過程的重要支架蛋白，為研究PagMSBP1/2a基因在木質(zhì)素合成中發(fā)揮的作用，對PagMSBP1/2a過表達株系#24和#33進一步解剖分析。觀察莖橫切面染色情況，發(fā)現(xiàn)過表達PagMSBP1/2a楊樹比對照組間苯三酚-HCL染色淺，說明其木質(zhì)素的含量有所降低。利用乙酰溴法測定木質(zhì)素含量，在過表達PagMSBP1/2a株系#24和#33中，木質(zhì)素含量與對照組相比分別減少34.6%、26.5%。

圖6 過表達PagMSBP1/2a 影響木質(zhì)素合成Fig. 6 PagMSBP1/2a affects lignin biosynthesis比例尺Scale bar in A-C is 200 μm; and in D-E is 80 μm.； C： 第7節(jié)間橫切片甲苯胺藍O染色(A： 對照植株，B-C： 轉(zhuǎn)基因株系#24、#33)； D-F： 第7節(jié)間橫切片間苯三酚-HCL染色(D： 對照植株，E-F： 轉(zhuǎn)基因株系#24、#33)； G.乙酰溴法測定木質(zhì)素含量。t檢驗P值用星號表示，***表示差異極顯著(P<0.01)。A-C. 7th internode transverse section stained with TBO (A, control plants; B, C, transgenic plants #24, #33, respectively); D-F. 7th internode transverse section phloroglucinol-HCL staining (D, control plants; E, F, transgenic plants #24, #33, respectively); G. Acetyl bromide method to determine the content of lignin. The P value of t test is indicated by stars,*** indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 討論

木材形成是一個極為精細的過程，對于次生壁的合成機制已進行大量研究工作，目前木質(zhì)素的生物合成及調(diào)控通路解析取得較大進展(Shietal., 2010)。最近表明，MSBP1作為動物膜相關(guān)孕激素受體PGRMC1(Falkensteinetal., 1996)同源基因在木質(zhì)素合成中有重要作用(Shietal., 2011; Gouetal., 2018)。本研究對MSBP在楊樹中的7個成員進行分析，包括進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)及其在楊樹組織中的表達等。分析發(fā)現(xiàn)，楊樹中MSBP蛋白結(jié)構(gòu)相對保守，均具有Cyt-b5保守結(jié)構(gòu)域(Mifsudetal., 2002)，推測MSBP在功能上可能具有高度保守性。

結(jié)合組織定量分析以及AspWood在線分析表明，MSBP1/2a基因在成熟莖段的木質(zhì)部表達水平高(圖2)。擬南芥MSBP1以前被認定為質(zhì)膜蛋白，可作為類固醇/BR激素信號成分負調(diào)控細胞伸長(Yangetal., 2005)，后來熒光蛋白GFP介導的亞細胞定位研究表明，MSBP1主要是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白(Gouetal., 2018)，本研究的PagMSBP1/2a亞細胞定位也證實了這一觀點(圖4)。MSBP1/2a的表達模式和定位分析表明MSBP1可能對莖的生長發(fā)育有影響，因此本文對84K楊中在木質(zhì)部組織高表達的PagMSBP1/2a進行深入研究。

NST是NAC家族中參與調(diào)節(jié)次生壁加厚 (Mitsudaetal., 2007) 的重要轉(zhuǎn)錄因子，有研究證明在nst-1突變體中MSBP基因的表達降低了50%左右 (Gouetal., 2018)，同時發(fā)現(xiàn)在楊樹的發(fā)育木質(zhì)部中MSBP同源基因表達水平較高 (Baoetal., 2013)，這證明MSBP1和MSBP2與次生細胞壁合成和木質(zhì)素的形成相關(guān)。在擬南芥突變體msbp1進一步的實驗中，抑制MSBP2表達會致使C4H、C3′H和F5H蛋白水平的大幅下降以及C4H酶催化活性的降低，使植株呈現(xiàn)木質(zhì)化程度低的表型(Gouetal., 2018)。采用間苯三酚-HCL對6周大的擬南芥基莖測定維管束和束間纖維的染色強度發(fā)現(xiàn)，雙基因敲除系與野生型msbp2-1相比明顯較弱，表明雙基因敲除植株維管中木質(zhì)素總量降低(Gouetal., 2018)。本研究通過過表達楊樹PagMSBP1/2a基因，乙酰溴法測定轉(zhuǎn)基因植株成熟莖段的木質(zhì)素含量，PagMSBP1/2a過表達植株中的木質(zhì)素含量明顯低于對照植株(圖6G)。本研究中過表達MSBP1導致木質(zhì)素含量降低的結(jié)論，與已報道的減少MSBP1表達會降低木質(zhì)素含量相矛盾。原因可能是植物在調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成途徑中對MSBP1蛋白具有嚴苛的要求。MSBP1做為支架蛋白連接P450酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成蛋白復合體，維持酶的活性和穩(wěn)定性，MSBP1蛋白的增多極有可能打破了復合體的調(diào)控平衡，導致3個P450酶的排列及功能發(fā)生變化，從而直接影響復合體催化木質(zhì)素的形成。有研究稱在苜蓿中C3′H、C4H表達下降的植株中乙酰溴化木質(zhì)素含量降低，而F5H表達降低不影響總含量。C4H、F5H的降低都提高了木質(zhì)素G單體的比例，并且F5H的降低還增加了硫代酸解木質(zhì)素的含量(Reddyetal., 2005; Stewartetal., 2009)。說明C3′H、C4H、F5H在木質(zhì)素合成途徑中存在精密的調(diào)控平衡中，MSBP作為木質(zhì)素合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，與相關(guān)酶的互作關(guān)系直接影響其調(diào)控作用的發(fā)揮，且PagMSBP1/2a與其他成員之間是否存在相互作用也有待進一步研究。本研究表明了該基因過量表達可以降低木質(zhì)素的含量，但植株生長受到了較大影響。因此若采用該基因啟動子進行木質(zhì)部細胞特異表達，則可能實現(xiàn)PagMSBP1/2成員對木質(zhì)素合成過程的精準調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究克隆了84K楊PagMSBP1/2a基因，預(yù)測其編碼膜蛋白，與其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相一致。PagMSBP1/2a基因在成熟莖中表達量較高，尤其在木質(zhì)部發(fā)育中表達量最高。通過高表達PagMSBP1/2a證明了其參與木質(zhì)部發(fā)育過程，導致植株矮化，木質(zhì)素含量減少。PagMSBP1/2a在木材形成過程中的調(diào)控作用，可以作為靶基因進行分子育種，調(diào)控木質(zhì)素的含量。