外源水楊酸誘導(dǎo)香蕉苯丙烷類(lèi)代謝提高對(duì)枯萎病抗性

段雅婕，楊寶明，郭志祥，尹可鎖，胡會(huì)剛，曾 莉，白亭亭*

外源水楊酸誘導(dǎo)香蕉苯丙烷類(lèi)代謝提高對(duì)枯萎病抗性

段雅婕1，楊寶明2，郭志祥2，尹可鎖2，胡會(huì)剛1，曾 莉2，白亭亭2*

1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524091；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650205

由尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型熱帶4號(hào)生理小種（f. sp.tropical race 4, TR4）引起的香蕉枯萎病嚴(yán)重阻礙我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。外源水楊酸（SA）處理能誘導(dǎo)香蕉體內(nèi)SA合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵酶基因上調(diào)表達(dá)，激活香蕉植株內(nèi)系統(tǒng)獲得抗性，增強(qiáng)對(duì)各種生物和非生物脅迫的抵抗能力，在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)香蕉感病品種‘巴西蕉’和抗病品種‘農(nóng)科1號(hào)’進(jìn)行SA誘導(dǎo)處理，隨后接種TR4，結(jié)果顯示2個(gè)品種的病情指數(shù)均降低。為了進(jìn)一步探究水楊酸信號(hào)途徑下游的苯丙烷類(lèi)途徑在SA誘導(dǎo)的香蕉植株抗病過(guò)程中的作用，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR），對(duì)SA處理的感病品種‘巴西蕉’和抗病品種‘農(nóng)科1號(hào)’中苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分支途徑中常規(guī)苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵酶基因和、木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶基因和、黃酮類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑關(guān)鍵酶基因和，對(duì)SA處理和TR4接種均有響應(yīng)。在僅接種TR4的情況下，‘巴西蕉’相關(guān)基因主要表現(xiàn)為顯著下調(diào)表達(dá)，而‘農(nóng)科1號(hào)’相關(guān)基因主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)；僅用SA處理時(shí)，2個(gè)品種的和被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；SA處理并接種TR4，2個(gè)品種和依然保持上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，變化幅度在‘農(nóng)科1號(hào)’中偏高；‘巴西蕉’經(jīng)SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但在接種TR4后，相對(duì)表達(dá)量降低，而‘農(nóng)科1號(hào)’被SA誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，SA和TR4共同作用下，表達(dá)水平亦顯著升高；‘巴西蕉’被TR4誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，在SA處理并接種TR4的‘巴西蕉’植株中也表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，‘農(nóng)科1號(hào)’在SA處理或SA、TR4共同作用下表現(xiàn)為強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)；和在SA處理的2個(gè)品種中主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，SA和TR4雙重作用下，依然表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明外源SA處理可誘導(dǎo)感病和耐病香蕉根組織中苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵酶基因上調(diào)表達(dá)，該途徑在SA誘導(dǎo)的香蕉抗枯萎病過(guò)程中起著重要作用。

香蕉枯萎病；誘導(dǎo)抗病性；苯丙烷類(lèi)途徑；基因表達(dá)

香蕉是我國(guó)重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，香蕉產(chǎn)業(yè)在推動(dòng)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著巨大的作用。目前，我國(guó)乃至全球香蕉生產(chǎn)正面臨香蕉枯萎病的嚴(yán)重威脅，該病由尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型熱帶4號(hào)生理小種（f. sp.tropical race 4, TR4）引起，TR4由根部侵染，其厚垣孢子可在土壤中存活長(zhǎng)達(dá)30年之久[1-2]。在香蕉枯萎病防控方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了大量的研究工作，包括對(duì)香蕉抗病品種進(jìn)行選育與評(píng)價(jià)、基于土壤消毒劑進(jìn)行化學(xué)防治、利用拮抗菌進(jìn)行生物防治、圍繞輪作和土壤改良等措施進(jìn)行農(nóng)業(yè)防控；針對(duì)這些單一防控措施存在的諸多問(wèn)題，又提出了多種防治措施相結(jié)合的綜合防控方法，并在盆栽試驗(yàn)或部分蕉園中取得了良好的效果，還初步建立了針對(duì)無(wú)病區(qū)、輕病區(qū)和重病區(qū)的三大綜合防控核心技術(shù)體系，在遏制香蕉枯萎病的進(jìn)一步蔓延和擴(kuò)展方面發(fā)揮著重要的作用[2]。然而，香蕉枯萎病是一種土傳的維管束病害，一旦土壤被病原菌污染，仍然存在防治難度大、防控技術(shù)復(fù)雜的問(wèn)題。因此，開(kāi)展香蕉抗病基礎(chǔ)研究，將為綜合利用防控措施提供理論依據(jù)，為從根本上防治香蕉枯萎病、保障香蕉產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

寄主植物在應(yīng)對(duì)外界壓力的漫長(zhǎng)過(guò)程中，進(jìn)化形成一系列快速有效的防衛(wèi)體系，即病原相關(guān)分子激發(fā)的非特異性防衛(wèi)反應(yīng)PTI（也稱(chēng)作基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)）和效應(yīng)子激發(fā)的ETI，防衛(wèi)反應(yīng)首先在受侵染部位產(chǎn)生一系列的細(xì)胞響應(yīng)，包括水楊酸（SA）的產(chǎn)生；隨后SA作為關(guān)鍵信號(hào)分子，激發(fā)植株整體對(duì)同一病原或其他病原產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[3]。研究認(rèn)為，外源SA能誘導(dǎo)植物體內(nèi)SA合成途徑，其中關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）亦連接苯丙烷類(lèi)代謝途徑，植物苯丙烷類(lèi)代謝途徑主要包括常規(guī)苯丙烷類(lèi)途徑及下游分支途徑的木質(zhì)素合成途徑和黃酮類(lèi)合成途徑[4]，在抵抗病害方面具有非常重要的作用[5-7]，它產(chǎn)生的二級(jí)代謝物，如木質(zhì)素、香豆素、黃酮類(lèi)物質(zhì)、植物保衛(wèi)素是防衛(wèi)反應(yīng)的重要組成部分[8]，與苯丙烷類(lèi)代謝緊密相關(guān)的木質(zhì)化作用更是能加固寄主植物細(xì)胞壁從而避免病原菌的傷害[9]。外源SA預(yù)處理，香蕉植株體內(nèi)的PAL、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性均有所提高[10]；預(yù)處理2 d后接種TR4，感病香蕉品種SA合成途徑關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上升，對(duì)香蕉枯萎病的抗性明顯提高[11]，推測(cè)SA預(yù)處理也能提高香蕉耐病品種對(duì)TR4的抗病性，其具體的誘導(dǎo)抗病效果需要實(shí)驗(yàn)明確，誘導(dǎo)抗病機(jī)制有待深入研究。

本課題組前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究初步發(fā)現(xiàn)香蕉抗病品種受TR4脅迫，其苯丙烷類(lèi)途徑相關(guān)基因、、等被誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)[12]，與ASCENSAO等[13]研究結(jié)果一致，表明苯丙烷類(lèi)代謝途徑中的香蕉植保素的積累和細(xì)胞壁加厚是有效抵抗枯萎病侵染的重要機(jī)制，但該途徑在香蕉耐病品種中參與誘導(dǎo)抗性的情況不明確。為了探究苯丙烷類(lèi)途徑在外源SA誘導(dǎo)的香蕉抗病過(guò)程中的響應(yīng)情況，明確苯丙烷類(lèi)代謝途徑在誘導(dǎo)抗病過(guò)程中的作用，進(jìn)一步解析SA誘導(dǎo)的香蕉抗枯萎病機(jī)制，本研究運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)外源SA處理的香蕉感病和耐病品種中苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，目的是在激發(fā)香蕉對(duì)枯萎病的抗性機(jī)制方面為香蕉的綠色綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品收集

供試TR4菌株為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院李敏慧副教授惠贈(zèng)。香蕉感病品種‘巴西蕉’（L. AAA group, ‘Brazilian’）和耐病品種‘農(nóng)科1號(hào)’（L. AAA group, ‘Nongke No.1’）組培苗購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院華南植物研究所香蕉組培中心，將上述組培苗栽種于盛有無(wú)菌泥炭土和椰糠（比例為1∶1）的直徑10 cm的盆缽內(nèi)，置于溫室中培養(yǎng)約80 d，選擇6～7片葉且長(zhǎng)勢(shì)一致的香蕉幼苗用于SA處理，實(shí)驗(yàn)期間溫室氣溫為25～37℃，每月施用1次復(fù)合肥，保障香蕉生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)。稱(chēng)取SA（酷來(lái)搏CS9641-10g）溶于甲醇配成300 mmol/L母液，再將母液溶于單蒸水中配成300 μmol/L的工作液。對(duì)‘巴西蕉’和‘農(nóng)科1號(hào)’香蕉幼苗采用300 μmol/L SA進(jìn)行灌根處理，每株澆灌50 mL SA溶液，每2 d處理1次，連續(xù)處理5次，以澆灌等量清水作對(duì)照，連續(xù)處理5次后間隔1 d，采用傷根灌根法接種TR4，接種濃度為5×106CFU/mL。

分別在SA處理3次（SA-3）和5次（SA-5）、TR4接種3 d（SA+TR4-3）和5 d（SA+TR4-5）、僅接種TR4后3 d（TR4-3）和5 d（TR4-5）時(shí)，采集根組織樣品，樣品置于–80℃冰箱，保存?zhèn)溆?。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理與對(duì)照設(shè)5個(gè)生物重復(fù)，重復(fù)3次。

1.2 病情指數(shù)調(diào)查

對(duì)SA預(yù)處理并接種TR4后30 d的香蕉進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查，每個(gè)處理調(diào)查40株苗，病情指數(shù)等級(jí)及詳細(xì)調(diào)查方法參照徐勝濤等[14]的方法。

1.3 RNA抽提及cDNA合成

根組織中總RNA采用德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒（Code No. 74903）提取，用Thermo核酸蛋白測(cè)定儀（NanoDrop 2000c）進(jìn)行RNA濃度和完整度檢測(cè)，質(zhì)量合格的RNA用于下一步cDNA合成。以RNA為模板，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Code No. RR047A）反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈。

1.4 引物設(shè)計(jì)與基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果（SRA accession number SRP026137），獲得苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵基因，以Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物（表1），實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)中內(nèi)參基因選用香蕉基因[15]。以擴(kuò)增效率95%<< 105%、相關(guān)性2≥0.99、溶解曲線為單峰曲線為引物篩選標(biāo)準(zhǔn)，引物序列和退火溫度見(jiàn)表1。使用熒光定量PCR儀（TaKaRa公司Thermal Cycler Dice Real Time System, TP700）對(duì)基因進(jìn)行定量分析，熒光定量試劑盒為SYBR Premix ExTM（TaKaRa公司）。每個(gè)測(cè)定樣品中的每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以2–DDCT法計(jì)算各基因的表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0軟件單因素方差分析法對(duì)不同處理間各基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析，使用Excel 2010軟件進(jìn)行制表和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA預(yù)處理增加香蕉對(duì)TR4的抗病性

以300 μmol/L濃度的SA，預(yù)處理80 d苗齡的感病香蕉品種‘巴西蕉’和耐病品種‘農(nóng)科1號(hào)’，然后接種TR4，1個(gè)月后調(diào)查香蕉的發(fā)病情況。如圖1所示，2個(gè)香蕉品種的對(duì)照與SA處理的植株出現(xiàn)了葉片變黃、球莖變褐等枯萎病癥狀，但是SA預(yù)處理的香蕉，無(wú)論是‘巴西蕉’還是‘農(nóng)科1號(hào)’，發(fā)病情況明顯比對(duì)照輕，與WANG等[11]的研究結(jié)果一致。調(diào)查結(jié)果顯示，水楊酸預(yù)先處理的‘農(nóng)科1號(hào)’病情指數(shù)為15.7，低于對(duì)照病情指數(shù)30.8；‘巴西蕉’用SA處理后，接種TR4，病情指數(shù)為32.9，而其對(duì)照病情指數(shù)為49.2，這些結(jié)果表明SA能夠誘導(dǎo)香蕉的抗病性，但這種誘導(dǎo)作用并不能賦予香蕉百分百的抗病能力，并且它也不針對(duì)特定的感病或耐病的香蕉起作用，這正體現(xiàn)了SA誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性具有廣譜性。

表1 苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵基因引物序列

A：TR4侵染的‘巴西蕉’，左圖為清水+TR4處理，右圖為SA+TR4處理；B：TR4侵染的‘農(nóng)科1號(hào)’，左圖為清水+TR4處理，右圖為SA+TR4處理；C：清水+TR4處理的‘巴西蕉’球莖；D：SA+TR4處理的‘巴西蕉’球莖；E：清水+TR4處理的‘農(nóng)科1號(hào)’球莖；F：SA+TR4處理的‘農(nóng)科1號(hào)’球莖。

2.2 SA誘導(dǎo)常規(guī)苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)變化

苯丙烷類(lèi)途徑的核心酶包括PAL、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase, C4H）和4-香豆素輔酶A連接酶（4-coumarate: coenzyme A ligase, 4CL）[16-17]。PAL作為關(guān)鍵酶在SA合成途徑發(fā)揮著重要作用，香蕉植株經(jīng)SA誘導(dǎo)，體內(nèi)PAL基因顯著上調(diào)表達(dá)[11]。本研究對(duì)外源SA處理的抗病和感病品種植株內(nèi)和基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，RT-qPCR結(jié)果如圖2所示，未經(jīng)SA處理的‘巴西蕉’中2個(gè)基因被TR4抑制略微下調(diào)表達(dá)，基因在接種TR4后3 d小幅度下調(diào)表達(dá)，到接種5 d后又出現(xiàn)輕微上調(diào)表達(dá)，差異表達(dá)的幅度均低于2倍；在SA處理的‘巴西蕉’植株中，能被SA誘導(dǎo)強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)，上調(diào)幅度達(dá)到3.5倍，和被SA誘導(dǎo)輕微上調(diào)表達(dá)；在SA預(yù)處理后接種TR4的‘巴西蕉’植株中，3個(gè)基因表現(xiàn)出顯著上調(diào)表達(dá)。在僅接種TR4的‘農(nóng)科1號(hào)’香蕉植株中，3個(gè)基因均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，并且在SA處理的‘農(nóng)科1號(hào)’植株中也被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，接種TR4后上調(diào)表達(dá)水平更高（圖2）。基因在‘巴西蕉’接種TR4后5 d被顯著抑制表達(dá)，與對(duì)照相比下調(diào)3.3倍，‘巴西蕉’中其他基因受TR4影響較小，只表現(xiàn)輕微的上調(diào)或下調(diào)，這與抗感品種受TR4侵染后的表達(dá)譜分析結(jié)果一致[12]；SA處理的‘巴西蕉’中基因顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明SA能夠誘導(dǎo)‘巴西蕉’中基因表達(dá)，該基因在接種TR4后依然保持較高的表達(dá)量，其中在SA預(yù)處理的‘巴西蕉’接種TR4后表達(dá)量為對(duì)照的6.1倍。在‘農(nóng)科1號(hào)’中，3個(gè)受TR4影響上調(diào)表達(dá)，與對(duì)照相比最高上調(diào)幅度為4.3倍，1個(gè)基因被TR4抑制下調(diào)表達(dá)；4個(gè)基因或直接被SA誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，或被SA誘導(dǎo)暫時(shí)處于潛在激活狀態(tài)，當(dāng)TR4侵染時(shí)被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)（圖2）。以上結(jié)果說(shuō)明，相比‘巴西蕉’，‘農(nóng)科1號(hào)’植株內(nèi)和基因較易被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)以抵抗TR4的侵染，這與‘農(nóng)科1號(hào)’具有較強(qiáng)的耐病性相一致；另一方面，SA可誘導(dǎo)2個(gè)品種中和基因顯著上調(diào)表達(dá)，且在‘農(nóng)科1號(hào)’中的被誘導(dǎo)水平高于‘巴西蕉’。

2.3 SA誘導(dǎo)木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)變化

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD）和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl CoA- O-methyltransferase, CCoAOMT）在苯丙烷類(lèi)途徑下游起作用，催化木質(zhì)素單體形成的最后一步反應(yīng)[18]，結(jié)果顯示，TR4脅迫下‘巴西蕉’中和基因被顯著抑制下調(diào)表達(dá)，在SA處理的植株中被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，SA處理并接種TR4，2個(gè)基因表達(dá)水平降低，但仍然比對(duì)照高，推測(cè)TR4也能抑制已被SA激活的基因的表達(dá)，基因表達(dá)模式與前2個(gè)基因相反，它能被TR4誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但卻被SA抑制表達(dá)，而且表達(dá)水平極低?！r(nóng)科1號(hào)’中和基因能被TR4和SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，二者共同作用下表達(dá)水平亦比對(duì)照高，而被SA和TR4抑制表達(dá)，僅在用SA預(yù)處理并接種TR4后5 d的植株中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在‘巴西蕉’和‘農(nóng)科1號(hào)’中的表達(dá)模式也許表明該基因?qū)δ举|(zhì)素的合成起負(fù)調(diào)控作用（圖3）。基因在‘巴西蕉’中可被TR4誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，這與抗感品種受TR4侵染后的表達(dá)譜分析結(jié)果一致[12]，在先用SA處理再接種TR4的‘巴西蕉’植株中表現(xiàn)出更顯著的上調(diào)表達(dá)；能被TR4誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表達(dá)水平為對(duì)照的1.5倍，SA單獨(dú)作用對(duì)其無(wú)明顯的誘導(dǎo)效果，與僅接種TR4的植株相比，在用SA處理并接種TR4的植株中表達(dá)無(wú)顯著性差異。TR4脅迫下，‘農(nóng)科1號(hào)’中2個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)；SA處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)‘農(nóng)科1號(hào)’植株基因上調(diào)表達(dá)，最高上調(diào)6倍，再接種TR4后基因表達(dá)水平與對(duì)照相比仍處于上調(diào)狀態(tài)（圖3）。

CK：未處理的健康植株；SA-3：SA處理3次：SA-5：SA處理5次；TR4-3：接種TR4后3 d；TR4-5：接種TR4后5 d；SA+TR4-3：SA預(yù)處理并接種TR4后3 d；SA+TR4-5：SA預(yù)處理并接種TR4后5 d。*表示處理與對(duì)照間差異顯著（P<0.05）。

CK：未處理的健康植株；SA-3：SA處理3次：SA-5：SA處理5次；TR4-3：接種TR4后3 d；TR4-5：接種TR4后5 d；SA+TR4-3：SA預(yù)處理并接種TR4后3 d；SA+TR4-5：SA預(yù)處理并接種TR4后5 d。*表示處理與對(duì)照間差異顯著（P<0.05）。

2.4 SA誘導(dǎo)黃酮類(lèi)物質(zhì)生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)變化

查爾酮合成酶（chalcone synthase, CHS）催化苯丙烷類(lèi)生物合成途徑分支黃酮類(lèi)色素合成的第一步，也是最關(guān)鍵的一步反應(yīng)[19]。研究結(jié)果如圖4所示，TR4侵染下，‘巴西蕉’中3個(gè)基因表達(dá)被抑制，但下調(diào)倍數(shù)小于2；‘農(nóng)科1號(hào)’接種TR4后，和被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，最高上調(diào)7.4倍，被抑制下調(diào)表達(dá)，下調(diào)倍數(shù)小于2；SA處理后，‘巴西蕉’和‘農(nóng)科1號(hào)’基因都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)；SA處理后接種TR4的‘巴西蕉’中3個(gè)基因比對(duì)照顯著上調(diào)表達(dá)，比僅接種TR4的植株基因表達(dá)水平顯著升高；SA處理后接種TR4的‘農(nóng)科1號(hào)’中，表達(dá)水平顯著高于僅接種TR4的植株（圖4）。查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase, CHI）也是黃酮類(lèi)分子生物合成的關(guān)鍵酶，基因在‘巴西蕉’接種TR4后3 d被抑制下調(diào)表達(dá)，到接種后5 d又恢復(fù)為正常水平，基本不受TR4脅迫影響；2個(gè)基因在‘農(nóng)科1號(hào)’接種TR4后主要被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，最高上調(diào)表達(dá)6.6倍；SA處理‘巴西蕉’誘導(dǎo)其體內(nèi)基因輕微上調(diào)表達(dá)，再接種香蕉枯萎病5 d后，表達(dá)量上調(diào)3.3倍，而SA處理的‘農(nóng)科1號(hào)’中，基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，最高上調(diào)6.0倍，再接種TR4后依然保持較高的表達(dá)水平，但是與僅接種TR4的‘農(nóng)科1號(hào)’相比差異不大；‘農(nóng)科1號(hào)’基因在TR4脅迫下略微上調(diào)，但受SA影響不顯著（圖4）。

3 討論

當(dāng)前香蕉主栽品種多為三倍體且高度不育，面對(duì)香蕉枯萎病毀滅性病害，生產(chǎn)上沒(méi)有完全抗病的栽培品種，因此，研究香蕉誘導(dǎo)抗病性及抗病機(jī)制在香蕉綠色防控方面具有重要的意義。外源SA能誘導(dǎo)感病香蕉植株中游離態(tài)SA積累，促使SA合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵酶基因上調(diào)表達(dá)，提高香蕉感病品種對(duì)枯萎病的抗性[11, 20]。位于SA合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游，苯丙烷類(lèi)途徑在植物防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要作用，病原物誘導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng)，包括侵染點(diǎn)周?chē)?xì)胞壁加固、PR蛋白積累、H2O2的產(chǎn)生、細(xì)胞過(guò)敏性壞死，以及胼胝質(zhì)、酚類(lèi)化合物、木質(zhì)素的積累[21-22]，本研究使用外源SA處理香蕉感病品種‘巴西蕉’并接種TR4，結(jié)果表明SA可誘導(dǎo)感病品種抗病性；外源SA處理耐病品種‘農(nóng)科1號(hào)’并接種TR4一個(gè)月后，植株病情指數(shù)和球莖褐化程度明顯比僅接種TR4的對(duì)照低，表明外源SA處理耐病香蕉品種，也能誘導(dǎo)耐病香蕉提高對(duì)土傳病害香蕉枯萎病的抗病能力，耐病品種和外源SA誘導(dǎo)抗性對(duì)香蕉枯萎病的防控效果達(dá)到68.09%。

CK：未處理的健康植株；SA-3：SA處理3次：SA-5：SA處理5次；TR4-3：接種TR4后3 d；TR4-5：接種TR4后5 d；SA+TR4-3：SA預(yù)處理并接種TR4后3 d；SA+TR4-5：SA預(yù)處理并接種TR4后5 d。*表示處理與對(duì)照間差異顯著（P<0.05）。

通過(guò)RT-qPCR進(jìn)一步研究外源SA誘導(dǎo)香蕉體內(nèi)苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)變化情況，解析外源SA誘導(dǎo)的抗病機(jī)制。苯丙烷類(lèi)途徑包含常規(guī)苯丙烷類(lèi)途徑、木質(zhì)素合成途徑、黃酮類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑，分別對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵酶基因?yàn)?、和，和，和[4]。PAL是SA合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵酶，亦是苯丙烷類(lèi)途徑的關(guān)鍵酶和限速酶[6, 23]。PAL催化苯丙氨酸去氨基形成肉桂酸，再由C4H氧化形成香豆酸，香豆酸在4CL硫酯化作用下形成香豆酰-CoA，其后的2個(gè)分支途徑可產(chǎn)生木質(zhì)素和黃酮類(lèi)物質(zhì)；CAD和CCoAOMT參與木質(zhì)素單體形成的最后一步[18]，CHS作用于苯丙烷類(lèi)途徑黃酮類(lèi)分子形成分支途徑的第一步，催化查兒酮的形成，CHI催化查兒酮環(huán)化形成黃酮類(lèi)分子[16, 24]。本研究結(jié)果顯示，僅接種TR4，‘巴西蕉’苯丙烷類(lèi)途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平無(wú)顯著差異或呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，表明感病品種‘巴西蕉’中抗病反應(yīng)被抑制[25]，而‘農(nóng)科1號(hào)’相關(guān)基因表達(dá)水平呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明TR4侵染時(shí)耐病品種根系細(xì)胞壁木質(zhì)化作用較強(qiáng)，黃酮類(lèi)植保素積累較快，因此，耐病香蕉對(duì)TR4的抵抗力增強(qiáng)。但是水楊酸誘導(dǎo)的木質(zhì)化作用和黃酮類(lèi)合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)在耐病品種‘農(nóng)科1號(hào)’和‘巴西蕉’中仍具有差異，大部分基因在‘農(nóng)科1號(hào)’中誘導(dǎo)上調(diào)幅度強(qiáng)于‘巴西蕉’，這可能就是SA處理的‘農(nóng)科1號(hào)’對(duì)TR4的抵抗能力強(qiáng)于‘巴西蕉’的原因。值得注意的是，SA處理后接種TR4，‘農(nóng)科1號(hào)’和‘巴西蕉’仍有部分植株表現(xiàn)出典型的枯萎病癥狀，其原因一方面可能是接種的TR4孢子濃度（5×106CFU/mL）過(guò)高，高濃度的TR4產(chǎn)生大量的鐮刀菌酸，破壞香蕉組織的細(xì)胞壁功能[26]；另一方面，該現(xiàn)象說(shuō)明SA誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性在TR4侵染的初始階段延緩了TR4的入侵及在根組織的擴(kuò)散，而當(dāng)外源SA補(bǔ)給終止時(shí)，SA誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗病性減弱甚至消失。

苯丙烷類(lèi)途徑位于SA合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游，外源SA處理誘導(dǎo)感病香蕉品種和耐病香蕉品種根組織中苯丙烷類(lèi)途徑與木質(zhì)素產(chǎn)生和黃酮類(lèi)合成的關(guān)鍵酶基因上調(diào)表達(dá)，提高對(duì)TR4的抗病性；水楊酸誘導(dǎo)的大部分木質(zhì)化作用和黃酮類(lèi)合成關(guān)鍵酶基因在‘農(nóng)科1號(hào)’中誘導(dǎo)上調(diào)幅度強(qiáng)于‘巴西蕉’，因此，SA誘導(dǎo)的耐病品種‘農(nóng)科1號(hào)’對(duì)TR4的抵抗能力強(qiáng)于感病品種‘巴西蕉’；SA處理后接種TR4，‘農(nóng)科1號(hào)’和‘巴西蕉’仍有部分植株表現(xiàn)出典型的枯萎病癥狀，表明高濃度TR4接種條件下，SA誘導(dǎo)的香蕉系統(tǒng)獲得抗性并不能賦予香蕉完全的抗病能力，但抗病品種結(jié)合SA抗性誘導(dǎo)處理相比感病品種，在降低香蕉枯萎病病情指數(shù)以及香蕉病害的防控方面具有顯著效果。本研究確定了外源SA對(duì)耐病品種的誘導(dǎo)抗病效果，明確了苯丙烷類(lèi)代謝途徑參與SA誘導(dǎo)的香蕉抗病過(guò)程，揭示了SA誘導(dǎo)的香蕉抗枯萎病機(jī)制。

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Exogenous Salicylic Acid Induced Phenylpropane Metabolism in Banana to Improve the Resistance AgainstWilt

DUAN Yajie1,YANG Baoming2, GUO Zhixiang2, YIN Kesuo2, HU Huigang1, ZENG Li2, BAI Tingting2*

1. South Subtropical Crops Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Key Laboratory of Hainan Province for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products, Zhanjiang, Guangdong 524091, China; 2. Agricultural Environment and Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Green Prevention and Control of Agricultural Transboundary Pests of Yunnan Province, Kunming, Yunnan 650205, China

Bananawilt caused byf. sp.tropical race 4 (TR4) seriously hinders the green and sustainable development of banana industry in China. Exogenous salicylic acid (SA) treatment can induce the key enzyme genes up-regulation in SA synthesis and signaling pathway and further activate systemic resistance in bananas against a variety of biotic and abiotic stresses. In this research, the susceptible banana cultivar ‘Brazilian’ and resistant banana cultivar ‘Nongke No.1’ after treated with SA were inoculated with TR4. The results showed that the disease index of the two cultivars treated with SA decreased when it was compared with the SA-untreated control. In order to explore the role of phenylpropanoid pathway located downstream of SA synthesis and signaling pathway during banana resistance induced by exogenous SA againstwilt, the key genes’ expression of phenylpropanoid pathway in susceptible and resistant banana cultivars treated with SA was analyzed by fluorescence quantitative PCR (RT -qPCR). It was found that the key genesandin general phenylpropanoid pathway were responsive to both SA induction and TR4 inoculation. The same was true forandin lignin biosynthesis pathway andandin flavonoid pathway. When only TR4 was inoculation, the expression of related genes in ‘Brazilian’ mainly showed significant down-regulation, while it was mainly up-regulated in ‘Nongke No.1’. When treated with SA only,andwere up-regulated in the two cultivars. After SA treatment and TR4 inoculation, the expression ofandin the two cultivars’ maintained up-regulated trend. The up-regulation range in ‘Nongke No.1” was higher compared with ‘Brazilian’. The expression ofin ‘Bralizian’ was up-regulated treated with SA, while it decreased when further inoculated with TR4. The expression ofin ‘Nongke No.1’ was also up-regulated treated with SA, and so was it in ‘Nongke No.1’ under the double treatments with SA and TR4.in ‘Brazilian’ was induced by TR4 and showed significant up-regulation. After SA treatment and TR4 inoculation, the expression ofin ‘Brazilian’ still maintained strong up-regulation. The expression ofwas strongly induced up-regulation in ‘Nongke No.1’ treated only with SA or further inoculated with TR4.andshowed significant up-regulation in the two cultivars treated with SA. And it still was up-regulated after SA and TR4 double treatments. Results indicated that exogenous SA could induce the up-regulated expression of key enzyme genes of phenylpropanoid pathway in the roots of susceptible and resistant banana cultivars and phenylpropanoid pathway plays a very important role in the induced resistance against TR4 in banana.

bananawilt; induced resistance; phenylpropanoid pathway; gene expression

S432.2.3

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.09.015

2022-01-20；

2022-06-06

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2019YFD1000903）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（No. CARS-31）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 2018A030313602）。

段雅婕（1983—），女，博士，助理研究員，研究方向：香蕉枯萎病防治。*通信作者（Corresponding author）：白亭亭（BAI Tingting），E-mail：baiting8797@126.com。