劉 俊 ,葉 靜 ,王 科，鐘 玲 ,魏雪梅

1.成都三六三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（成都610041）；2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（成都 610081）

甲狀腺乳頭狀癌（thyroid carcinoma,TC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，現(xiàn)在其主要治療方法是以手術(shù)治療為主[1]，同時(shí)給予碘131治療。隨著對(duì)甲狀腺乳頭狀癌研究的深入，該疾病發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制逐漸成為了熱點(diǎn)。有研究指出[2]，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病可能與多種基因如BRAF、P53等基因的突變和表達(dá)水平變化有密切關(guān)系。但是作為甲狀腺疾病相關(guān)基因，TSHR因子在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)對(duì)其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的研究并不十分多見(jiàn)。因此，對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的相關(guān)基因TSHR的檢測(cè)對(duì)于防治甲狀腺乳頭狀癌，改善疾病預(yù)后具有重要意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及材料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2017年3月至2018年3月就診于本院的甲狀腺乳頭狀癌病人，并隨機(jī)抽取其中符合要求的病人30 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合甲狀腺癌診療規(guī)范（2018 年版），并通過(guò)成都三六三醫(yī)院病理科行病理活檢確定診斷；②病人自入院初未經(jīng)過(guò)其他治療（如核醫(yī)學(xué)碘131治療）等；③年齡18歲以上，具有良好的依從性，并簽署知情同意書(shū)；本研究通過(guò)了倫理學(xué)審議（倫理審查號(hào)：JN.No20200630c0240731[119]）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)其他惡性腫瘤，或已接受其他治療等；②已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人；③病人拒絕參與實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；總mRNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Themo fisher公司；熒光定量PCR引物合成自上海生工公司（TSHR上游引物序列為5'-GCTTTCAGG TAAACCAATGA-3'下游引物為5'-AAGGGCCAGTGA CACTGGTTTGAGA-3'。BRAF上游引物為5'-TCGTC AATCGGTC-3'下游引物為5'-CGGCTTGCATT）；熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自大連Takara 公司；TSHR 及BRAF 一抗抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)取材 納入對(duì)象行手術(shù)治療切除甲狀腺乳頭狀癌及周圍組織，標(biāo)本送病理科進(jìn)行活檢，確定甲狀腺乳頭狀癌癌組織病灶及未被腫瘤侵犯的組織，并將組織各分為兩份，分別置于-80 ℃冰箱及RNA 保護(hù)液中保存。

1.2.2 檢測(cè)mRNA 表達(dá)水平 使用天根總mRNA 提取試劑盒分別提取各標(biāo)本總mRNA，經(jīng)凝膠電泳紫外熒光顯色觀察28s RNA及18s RNA條帶清楚，且28s RNA大約為18s RNA 量的兩倍，說(shuō)明RNA 完整性較好視為RNA 完整性良好（見(jiàn)圖1）。并通過(guò)紫外分光光度計(jì)確定OD260/OD280在1.8～2.1 之間的RNA 視為合格樣本。確定合格的樣本在定量后使用Themo公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并置于-20 ℃長(zhǎng)期保存。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性Figure 1 Integrity of RNA tested by agarose gel electrophoresis

使用聯(lián)排PCR 管，每管加入解凍后的cDNA 溶液1 μL，無(wú)菌去離子水7 μL，正反鏈引物各1 μL，熒光染料10 μL，并置于RT-qPCR 儀中，以50 ℃2 min，95 ℃10 min，（95 ℃15 s，60 ℃1 min）×40 循環(huán)，95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s的程序運(yùn)行，得到結(jié)果與內(nèi)參對(duì)比后得出△Ct后進(jìn)行分析。

1.2.3 檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)量 取約1 g 解凍后組織加入1%PMSF，研磨裂解沉淀后，14 000 r/min離心10 min取上清液，-20 ℃保存，并使用BCA試劑盒及酶標(biāo)儀測(cè)定樣本蛋白質(zhì)含量并統(tǒng)一定量后置于-20 ℃保存。取15 μL 組織總蛋白加入等量loading buffer，100 ℃水浴30 min，行恒壓電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，并加入5 mL TBST，一抗2 μL，脫脂奶粉0.4 g 配置的封閉液，混勻30 min 后4 ℃孵育過(guò)夜。次日清洗PVDF 膜后曝光顯像。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 18.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用ˉX±S表示，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌與正常組織中mRNA的表達(dá)

2.1.1 TSHR mRNA在正常組織與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)差異 正常組織中TSHR mRNA的△Ct值為11.783±0.21，而甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR mRNA的△Ct值為8.189±0.42（見(jiàn)圖2），甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR的mRNA表達(dá)較正常組織升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 TSHR mRNA在正常組織與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)Figure 2 Expressions of TSHR mRNA in normal tissue and PTC tissues

2.1.2 BRAF mRNA 在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)差異 正常組織中BRAF mRNA的△Ct值為7.478±0.35而甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF mRNA的△Ct值為5.216±0.47（見(jiàn)圖3），甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF的mRNA表達(dá)較正常組織升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 Braf mRNA在正常組織與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)Figure 3 Expressions of Braf mRNA in normal tissue and PTC tissues

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織與正常組織中的蛋白表達(dá)

2.2.1 TSHR 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)差異 正常組織中TSHR 蛋白TSHR/β-actin相對(duì)灰度值為0.955±0.12，甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR/β-actin 相對(duì)灰度值為1.452 ± 0.09（見(jiàn)圖4，圖5），甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR蛋白表達(dá)較正常組織升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 TSHR 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)Figure 4 Expressions of TSHR protein in normal tissue and PTC tissues

圖5 TSHR 蛋白在正常組織與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)柱狀圖Figure 5 Bar chart of expressions of TSHR protein in normal tissue and PTC tissues

2.2.2 BRAF 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)差異 正常組織中BRAF 蛋白BRAF/β-actin 相對(duì)灰度值為1.721 ± 0.09，甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF/β-actin相對(duì)灰度值為2.012 ± 0.13（見(jiàn)圖6,圖7），甲狀腺乳頭狀癌BRAF 蛋白較正常組織升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 BRAF 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)Figure 6 Expressions of BRAF protein in normal tissue and PTC tissues

圖7 TSHR 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)柱狀圖Figure 7 Bar chart of expressions of TSHR protein in normal tissue and PTC tissues

2.2.3 BRAF 基因與TSHR 基因表達(dá)的相關(guān)性 將QPCR 分析所得TSHR與BRAF基因表達(dá)結(jié)果通過(guò)SPSS 18.0 進(jìn)行相關(guān)性雙變量分析后，發(fā)現(xiàn)TSHR表達(dá)與BRAF表達(dá)呈正相關(guān),r 值為0.799（見(jiàn)圖8），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

圖8 TSHR與Braf 蛋白表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖Figure 8 Correlation between THSR and Braf protein

將Western-bolting 分析所得TSHR與BRAF基因表達(dá)結(jié)果通過(guò)SPSS 18.0進(jìn)行相關(guān)性雙變量分析后，發(fā)現(xiàn)TSHR表達(dá)與BRAF表達(dá)呈正相關(guān),r 值為0.904（見(jiàn)圖9），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

圖9 TSHR與Braf mRNA表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖Figure 9 Correlation between THSR and Braf mRNA

3 討論

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤總病例的1%，是近年來(lái)發(fā)病率增長(zhǎng)較快的實(shí)體腫瘤[3]。有報(bào)道指出，全球2018 年估計(jì)新發(fā)567 000例,死亡41 000 例，其發(fā)病趨勢(shì)在世界范圍內(nèi)快速上升[4]。在我國(guó)，甲狀腺癌亦是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率亦快速上升[5-6]。而甲狀腺乳頭狀癌則是甲狀腺癌中最常見(jiàn)的類型[7]。有報(bào)道指出，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病可能與輻射、激素水平、碘攝入量等因素有關(guān)[4,8-9]，但其發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制并沒(méi)有被完全揭示。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及對(duì)甲狀腺乳頭狀癌研究的不斷深入，有報(bào)道指出甲狀腺乳頭狀癌與多種基因如BRAF、P53等基因的突變和表達(dá)差異有密切關(guān)系[10-12]。其中TSHR基因突變與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系逐漸引起人們的關(guān)注[13]。作為甲狀腺疾病的相關(guān)因子，TSHR基因的變異與表達(dá)的變化與以Graves 病、橋本氏甲狀腺炎為代表的眾多甲狀腺疾病有關(guān)[14-15]。作為調(diào)控甲狀腺細(xì)胞代謝的關(guān)鍵因子，TSHR基因的表達(dá)受到多種基因的表達(dá)調(diào)控[16-19]。在作用機(jī)制上，TSHR 作為G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員，對(duì)甲狀腺細(xì)胞分化起到了重要的調(diào)節(jié)作用，TSH與TSHR相偶聯(lián)，激活異源三聚體G 蛋白介導(dǎo)TSHR 信號(hào)，同時(shí)引發(fā)cAMP級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而控制了甲狀腺乳頭狀癌相關(guān)基因的表達(dá)并影響了甲狀腺腫瘤及相關(guān)疾病的發(fā)展[20-21]。同時(shí)有研究認(rèn)為，甲狀腺乳頭狀癌中，RASSF1A、P16啟動(dòng)子甲基化率明顯增高[22]，此時(shí)促甲狀腺激素TSH與位于甲狀腺表面的TSHR相結(jié)合，引發(fā)TSHR表達(dá)變化，引發(fā)碘攝入及甲狀腺素合成變化，進(jìn)而影響甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展。

傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，TSHR作為抑癌因子，對(duì)甲狀腺乳頭狀癌尤其是合并甲亢的乳頭狀癌的進(jìn)展起到了抑制的作用[14,24-25]，這與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR表達(dá)量較正常組織明顯升高相悖。但同時(shí)有報(bào)道認(rèn)為，甲狀腺乳頭狀癌病人TSHR基因表達(dá)較正常病人高[19,26-27]。上述研究認(rèn)為，甲狀腺乳頭狀癌病人THSR基因高表達(dá)可能與甲狀腺腫物導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)有關(guān)，同時(shí)該現(xiàn)象可能與BRAF基因的高表達(dá)相關(guān)[28-30]。這些觀點(diǎn)，與本研究中甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR與BRAF表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系的結(jié)論相同。但其并未對(duì)合并甲亢的甲狀腺乳頭狀癌出現(xiàn)的上述情況做詳細(xì)解釋，同時(shí)其未對(duì)甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR的進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。本研究認(rèn)為，甲狀腺乳頭狀癌中THSR高表達(dá)可能是由于甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展刺激了TSHR被動(dòng)表達(dá)，進(jìn)一步引起上述表現(xiàn)。

甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展受到了多基因的調(diào)控。但對(duì)于TSHR基因，更多的研究著眼于TSHR啟動(dòng)子甲基化率[31]及外周血中TSHR-mRNA表達(dá)[32]與甲狀腺乳頭狀癌的相關(guān)性。目前為止，僅有極少研究對(duì)TSHR基因在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常組織中的表達(dá)變化進(jìn)行研究[33]，且上述少量研究并未通過(guò)Westen-Bolting 等分子生物學(xué)方法對(duì)TSHR基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)進(jìn)行精確的定量[31]。于此，我們采取Q-PCR及Western-Bolting方式對(duì)TSHR基因進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與腫瘤相關(guān)因子BRAF基因的表達(dá)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR表達(dá)量較正常組織明顯升高，同時(shí)，甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR表達(dá)與作為參考基因的BRAF表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步揭示了TSHR基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中發(fā)生、發(fā)展中起到的作用。

4 結(jié)論

甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中TSHR 因子的表達(dá)水平較正常組織顯著升高，且與BRAF 的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，其成因可能與甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展刺激TSHR 的被動(dòng)表達(dá)有關(guān)，以致進(jìn)一步引起TSHR的高表達(dá)。

（利益沖突：無(wú)）