動物藥水牛角基礎(chǔ)與應(yīng)用研究進(jìn)展

湯佳瑤,武文星,朱悅,郭盛,趙明,2,曹鵬,2,劉睿,2,段金廒,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室,江蘇 南京 210023;2.動物類中藥與功能肽國際合作聯(lián)合實驗室,江蘇 南京 210023)

角類動物藥為傳統(tǒng)中藥的重要組成部分,它指特定動物的角及其加工品,屬于皮膚衍化物的組織,由角質(zhì)細(xì)胞組成[1]。角類動物藥可分為表皮角和角質(zhì)角,表皮角如犀牛角,由表皮角質(zhì)層所產(chǎn)生的毛狀角質(zhì)纖維組成;角質(zhì)角又分兩種,由真皮形成的骨質(zhì)芯與表皮形成角質(zhì)鞘構(gòu)成的為洞角,如水牛角、牦牛角、羚羊角;已骨化的角為骨角,如鹿角和麋鹿角[2]。2020年版《中國藥典》收載3種角類中藥,包括鹿角、羚羊角和水牛角,其中水牛角為?？苿游锼ubalusbubalisLinnaeus的角,具有清熱涼血,解毒,定驚的功效,主要用治溫病高熱,神昏譫語,發(fā)斑發(fā)疹,吐血衄血,驚風(fēng),癲狂等疾病[3]。水牛角始載于《名醫(yī)別錄》:“療時氣寒熱頭痛”[4]，其作為傳統(tǒng)動物藥,在中醫(yī)臨床已有上千年應(yīng)用歷史,其功能主治及臨床用途廣為人知。

水牛角及其濃縮粉作為犀角代用資源廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床與中藥制藥行業(yè)[5-8],取得了良好的社會與經(jīng)濟(jì)效益。40多年來,中醫(yī)藥科技工作者圍繞水牛角功效物質(zhì)基礎(chǔ)、生物效應(yīng)機制、質(zhì)量控制等方面開展系列研究,取得了階段性進(jìn)展與成效[9-11]。在此基礎(chǔ)上,本文進(jìn)一步梳理與挖掘水牛角資源價值,從水牛角本草記載、物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量評價、藥理藥效評價進(jìn)行綜述,結(jié)合團(tuán)隊前期研究進(jìn)展,提出水牛角基礎(chǔ)與應(yīng)用研究方向,并以水牛角為示范,建立科學(xué)、系統(tǒng)角類動物藥科學(xué)研究模式與評價體系,助力中藥資源產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展,進(jìn)一步提升角類動物藥的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益。

1 藥用記載與歷史沿革

1.1 基原記載

古籍中對于水牛角的原動物基原鮮有記載,大多認(rèn)為水牛角即水牛的雙角。在現(xiàn)代文獻(xiàn)中,《中華本草》記錄：“水牛四肢較短,蹄較大。皮厚無汗腺,毛粗而短,體前部較密,后背及胸腹較疏。體色大多灰黑色,但亦有黃褐色或白色的。全國大部分地區(qū)均飼養(yǎng),以南方水稻地區(qū)較多”[12]。2020年版《中國藥典》記錄:“水牛角為?？苿游锼ubalusbubalisLinnaeus的角”[3]。

水牛為一種草食反芻家畜,頭向前伸,額部突起,眼大稍突出,口方大,鼻孔大,鼻鏡寬呈黑色(白水牛為肉色)。水牛角角基近方形,向左右平伸、呈新月形或弧形;水牛全身被毛為深灰色或淺灰色,隨年齡增長,毛色逐漸由淺灰色變成深灰色或暗灰色。大型水牛體質(zhì)量平均在600 kg以上,體高在135 cm以上;小型水牛體質(zhì)量平均在500 kg以下,體高平均在126 cm以下。水牛主供役用,挽力強,行步穩(wěn)重,特別適宜于水田耕作。中國水牛屬沼澤型水牛,大多數(shù)分布于東南和西南,以在淮河以南的水稻產(chǎn)區(qū)最多。

水牛分為河流型水牛和沼澤型水牛兩種類型,河流型水牛包括印度摩拉水牛、巴基斯坦尼里-拉菲水牛和地中海水牛,主要分布在印度、巴基斯坦和地中海沿岸國家和地區(qū);沼澤型水牛包括中國水牛、越南水牛、菲律賓水牛,主要分布在中國和東南亞國家。其中,中國水牛有24個品種,水牛資源較為豐富多樣[13]。江蘇地區(qū)水牛以海子水牛和山區(qū)水牛為主,由于江蘇北部沿海群眾對生長在海邊草灘上的牛群都冠以“海子”二字而得名“海子水牛”。海子水牛為亞洲野生水牛人工馴化后的變種,2006年起,“海子水?！北晦r(nóng)業(yè)部列入國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄。海子水牛體型碩健,背部平直,額寬而突,背寬胸深,肌肉豐滿,四肢強健,前肢直立,后肢呈適度弧形,蹄圓而色黑,質(zhì)地致密,深色牛角、蹄色黑亮。海子水牛的角型大多向后成環(huán)抱形,環(huán)抱角有大、中、小之分。最大的環(huán)抱角左右兩角彎曲處的最大距離約1 m;也有兩角向左右成直線平伸,角長60 cm左右;角尖向后略彎,因左右兩角在一條直線上,形似扁擔(dān),而被稱為“扁擔(dān)角”。山區(qū)水牛體型中等,被毛也多為石板青色。頭部適中,眼大有神,角大向后上方平彎。頸粗壯較短,前軀髻甲高長,背腰寬平,胸寬,腹大而不下垂,尻部傾斜,尾根低而粗,尾長不過飛節(jié)。四肢粗壯,蹄小質(zhì)堅。

1.2 藥性及功效記載

水牛角藥用始載于《名醫(yī)別錄》,列為中品,“可療時氣寒熱頭痛”[4]?！缎滦薇静荨泛汀蹲C類本草》延用《名醫(yī)別錄》的說法[14-15]。《日華子本草》記載：“煎,治熱毒風(fēng)并壯熱”[16]?！妒?jì)總錄》記載：“牛角燒灰,酒服方寸匕,日五服”，可治石淋,破血[17]?！短绞セ莘健酚涊d：“牛角、羊角(燒灰)等分,豬脂調(diào)涂”可治赤禿發(fā)落[18]?！侗静菥V目》對水牛角的藥性進(jìn)行了說明,其：“苦,寒,無毒;水牛者燔之,治淋、破血”[19]?！蛾懘ū静荨吩疲骸靶?、咸,寒。涼血解毒,止衄。治熱病昏迷,麻痘斑疹,吐血,衄血,血熱,溺赤”[20]?！毒е楸静荨酚涊d其“清熱、利水、治下落水腫”[21]。《四川中藥志》概括其功效主治為“治風(fēng)熱頭痛,喉頭紅腫,小兒驚風(fēng)及吐血”[22]?！度珖胁菟巺R編》載其“清熱鎮(zhèn)驚,涼血止血。主治熱病驚厥,高熱,神昏,譫語,吐血,衄血,斑疹,血小板減少性紫癜,精神分裂癥,小兒夏季熱”[23]。綜合歷代本草記載,水牛角其藥性可歸納為苦、寒,鎊片水煎入藥用治溫?zé)岵?、驚風(fēng)、斑疹等疾病,而牛角燒灰后,其功效主治有所改變,主要用于治療赤禿發(fā)落和淋證、破血,不同的炮制方法,水牛角的功效有所不同,其原因可能與水牛角燒灰之后物質(zhì)成分改變有關(guān),但未見深入研究,其機制尚待闡明。歷代本草著作對水牛角的性味功效主治記載見表1。

表1 歷代本草著作對水牛角的性味功效記載

1.3 中醫(yī)藥典籍中水牛角方劑的應(yīng)用

依據(jù)水牛角的性味歸經(jīng)及功效,中醫(yī)臨床常以單方或復(fù)方應(yīng)用。以“水牛角”為關(guān)鍵詞查詢南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥方劑文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、2020年版《中國藥典》和藥智網(wǎng),共得到歷代方書記載含水牛角方劑23首。對水牛角方劑進(jìn)行統(tǒng)計梳理,發(fā)現(xiàn)水牛角成方后多水煎,以湯劑服用,或者研成細(xì)粉入丸劑,23個古籍記載方劑中有10個方劑以湯劑服用,4個方劑以丸劑服用。根據(jù)主治病癥分布對水牛角方藥進(jìn)行統(tǒng)計,結(jié)果如表2,水牛角方劑主要用于治療溫?zé)岵?、神昏譫語、斑疹、咽喉腫痛、目昏、小兒驚厥、中風(fēng)等疾病。

表2 水牛角方藥主治病證分布

2 水牛角物質(zhì)基礎(chǔ)研究

水牛角主要含有蛋白質(zhì)類、肽類、氨基酸類、含硫類、核苷類、無機元素類等化合物。

2.1 蛋白質(zhì)類

水牛角含有豐富的蛋白質(zhì)類成分,是構(gòu)成水牛角致密結(jié)構(gòu)的主要成分,更是水牛角的重要功效物質(zhì)。課題組前期研究通過反復(fù)抽提蛋白質(zhì)類成分,將水牛角細(xì)粉制備獲得可溶性蛋白與不溶性蛋白兩部分,基于Shotgun蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)[24],從可溶性蛋白部分中鑒定了46個蛋白質(zhì),其中角蛋白17個,占比37.0%;不溶蛋白部分鑒定了72個蛋白質(zhì),其中角蛋白16個,占比22.2%。合并兩部分鑒定信息,從水牛角中共鑒定了90個蛋白質(zhì)類成分,基于蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋率、多肽數(shù)量,多肽匹配圖譜(PSM)等信息比較歸類,水牛角中角蛋白(Keratins)、角蛋白相關(guān)蛋白(Keratin associated protein)、連接蛋白(Junction plakoglobin)、橋粒蛋白(Desmoplakin)等結(jié)構(gòu)蛋白占主導(dǎo)數(shù)量。在此基礎(chǔ)上,課題組進(jìn)一步通過iTRAQ同位素標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,對不同角類動物藥中共性蛋白質(zhì)的相對含量進(jìn)行比較分析,結(jié)果表明,盡管水牛角抽提液的蛋白質(zhì)總量顯著低于犀角、廣角的抽提液,但水牛角與犀角、廣角的蛋白質(zhì)類成分組成、相對含量比例接近。主成分分析(PCA)表明水牛角中角蛋白、角蛋白相關(guān)蛋白、橋粒芯蛋白(Desmoglein)、橋粒糖蛋白(Desmocollin)、連接蛋白、橋粒蛋白等主成分與犀角、廣角最接近。此外,水牛角中2種蛋白質(zhì)交聯(lián)酶Transglutaminase 1(TGM1)與Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E(TGM3)的水平與犀角、廣角接近,TGM3參與催化角蛋白的N-(γ-谷氨酰)賴氨酸交聯(lián)形成等肽鍵,將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)相互連接,而TGM1可交聯(lián)細(xì)胞周邊的蛋白質(zhì)。上述研究表明水牛角在蛋白質(zhì)種類、結(jié)構(gòu)組成方面與犀角、廣角接近,為水牛角作為犀角類效資源使用提供了依據(jù)。

2.2 肽類

水牛角傳統(tǒng)用法常以煎煮單用或入方劑使用,經(jīng)過煎煮后，蛋白質(zhì)類成分經(jīng)非特異性降解釋放一些可溶性肽類成分。近年來隨著現(xiàn)代儀器與技術(shù)手段的發(fā)展進(jìn)步,圍繞水牛角肽類成分的分離、純化、鑒定等方面開展了進(jìn)一步研究。

課題組前期通過凝膠、離子交換、反相色譜多維色譜結(jié)合從水牛角提取液中分離純化獲得3個活性肽,氨基酸序列分別為QYDQGV、YEDCTDCGN、AADNANGLFPPN,對過氧化氫誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用[25]?；钚詫?dǎo)向下的多維色譜聯(lián)用分離活性肽類成分是經(jīng)典的肽類分離、分析方法,但效率較低。課題組進(jìn)一步采用多肽組學(xué)的方法,從水牛角活性部位中鑒定了824個肽段信息,進(jìn)一步通過肽序列熱圖分析,發(fā)現(xiàn)水牛角活性部位的肽段來源于KRT14、KRT34、KRT86等主要角蛋白的特定序列,提示我們水牛角活性多肽可能為一類具有相同或相似氨基酸序列信息的物質(zhì)[26]。

角蛋白是構(gòu)成水牛角的主要蛋白質(zhì)類成分,角蛋白穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)與其二硫鍵(-S-S-)的形成密切相關(guān),而水牛角在特定條件下,如高溫煎煮、體內(nèi)生物酶等作用下,其角蛋白發(fā)生非特異性降解,甚至可能發(fā)生-S-S-斷裂形成游離巰基(-SH)。-SH作為一種活潑基團(tuán),在多種生物過程和疾病中起到重要作用,近年來受到廣泛關(guān)注[27],如-SH經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化為硫化氫(H2S),H2S作為重要的內(nèi)源性氣體信號因子在維持內(nèi)皮功能穩(wěn)定等方面起到重要作用,王春雪等[28]通過熒光衍生法測定水牛角-SH含量為18.3～38.3 μmol·g-1,含有-SH的肽類成分可能為水牛角重要物質(zhì)基礎(chǔ),如水牛角提取液分離得到的活性肽YEDCTDCGN,即含有2個-SH。為此,課題組制備了核殼型Fe3O4@PDA@Au納米材料對水牛角中含-SH肽類成分進(jìn)行富集、鑒定與表征,結(jié)果水牛角含-SH部位(富集液)中共檢測到2 254個肽類成分,其中含-SH肽類成分709個,水牛角含-SH部位的活性評價表明,相較于水牛角提取液,其抗氧化、抗炎活性均顯著提升。如此表明,活性肽類是水牛角重要功效物質(zhì),其中含-SH肽類成分是其抗炎、抗氧化關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)[25,29]。

2.3 氨基酸類

水牛角中的蛋白質(zhì)與肽類經(jīng)水解后得到多種氨基酸,氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本單位,對于維持正常生理功能和機體代謝過程具有重要意義。課題組前期研究對水牛角18種水解氨基酸進(jìn)行了測定,其中谷氨酸含量最高,為12.59%,其次分別為精氨酸(10.00%)、亮氨酸(8.50%)、半胱氨酸(8.35%)、酪氨酸(8.05%)、天冬氨酸(6.95%)、絲氨酸(6.90%)、甘氨酸(6.76%)等,水牛角中8中必需氨基酸含量為36.95%[30]。此外,?；撬嶙鳛橐环N結(jié)構(gòu)簡單的含硫氨基酸,是調(diào)節(jié)機體正常生理活動的活性物質(zhì),采用OPA柱前衍生法,測得水牛角中?；撬岬暮繛?.46 μg·g-1[31]。

2.4 核苷類

核苷類是具有廣泛生理活性的一類水溶性成分。課題組前期通過UPLC-Q-TOF/MS分析水牛角水提液活性部位(MW<1 000 kDa)中含有尿苷、次黃嘌呤、鳥苷和腺苷核4種苷類成分[24]。采用親水作用色譜-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(HLIIC-UPLC-QQQ-MS)測定了9個批次水牛角樣品14個核苷和含氮堿基類成分的含量,結(jié)果表明水牛角總核苷含量范圍為123.36～233.22 μg·g-1,其中黃嘌呤和鳥嘌呤占比較大[32]。因此,水牛角的核苷類成分含量可以為水牛角質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供參考。

2.5 無機元素類

無機元素是生物體的構(gòu)成元素,其參與多種生理過程,具有重要的生物功能。

王斐[30]通過微波消解制備水牛角樣品,測定水牛角中的35種無機元素,結(jié)果表明硫、鈣、鋅、磷、鉀、鈉、鐵等為水牛角主要元素,其中硫元素含量最為豐富,達(dá)28.10 mg·g-1。

3 水牛角質(zhì)量評價研究

3.1 藥材鑒定

3.1.1 性狀鑒定和顯微鑒定 水牛角形狀彎曲呈弧形,根部方形或略呈三角形,中空,一側(cè)表面有多數(shù)平行的凹紋,角端尖銳。色黑褐,質(zhì)堅硬,剖面紋細(xì)而不顯,氣腥。一般多用其角尖部。水牛角的基礎(chǔ)為額骨的角突,角突腔與額竇相通,幼牛的角突內(nèi)腔有若干不完整的中隔,隨著年齡的增長,中隔逐漸為骨嵴所替。角突之外有骨膜和真皮層,最外部為角殼,真皮實角質(zhì)發(fā)生部位。角的基部有豐富的血管和神經(jīng)分布,是供應(yīng)角生長所需營養(yǎng)的源泉。當(dāng)水牛角處于營養(yǎng)好的時期,其角生長較好,角殼較厚。反之,則角生長較慢,角殼較薄。由于生理與環(huán)境等因素的影響,如懷孕、哺乳、飼草因四季變化而營養(yǎng)成分不同,使得水牛的角上形成了一圈圈的溝和脊,呈輪狀構(gòu)造,稱之為“角輪”[33]。水牛角性狀外觀參見圖1。

水牛角粉末為灰褐色,不規(guī)則形碎塊淡灰白色、淡灰黃色或灰褐色,縱斷面可見細(xì)長梭形紋理或有縱長裂縫。布有微細(xì)灰棕色色素顆粒;橫斷面梭形紋理平行排列,呈弧狀彎曲,似波峰樣,有眾多黃棕色色素顆粒。有的碎塊表面較平整,色素顆粒及裂縫均少[3]。水牛角切片直接顯微觀察,切面呈水波紋樣。水牛角粉為不規(guī)則碎塊淡灰白色或灰黃色?？v斷面觀可見細(xì)長梭形紋理,有縱長裂縫,布有微細(xì)灰棕色色素顆粒;橫斷面觀梭形紋理平行排列,并弧狀彎曲似波峰樣,有眾多黃棕色色素顆粒。有的碎塊表面較平整,色素顆粒及裂隙較小,難于察見[3]。

盡管薄層法[34]、紅外法[35]、高效液相法[36]、毛細(xì)管等電聚焦法[37]等已應(yīng)用于水牛角的鑒別及區(qū)分其他角類,但是由于專屬性不強,或檢測靈敏度不高,不能行之有效地用于水牛角鑒別。近年來DNA條形碼、蛋白質(zhì)、多肽檢測的技術(shù)手段應(yīng)用于水牛角專屬性鑒別,并取得了較好的效果。

3.1.2 DNA條形碼鑒定 劉旭朝[38]以COⅠ序列為DNA條形碼,取水牛角及其易混品的原動物和市售藥材樣品155份,從中獲得93條水牛角及其易混偽品的原動物COⅠ序列,經(jīng)核驗后均已納入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫,建立基于DNA條形碼技術(shù)的水牛角及其易混偽品鑒定方法。

3.1.3 特征肽鑒定 課題組前期基于多肽組與數(shù)學(xué)集合分析的方法,發(fā)現(xiàn)4條水牛角特征肽:通過nanoLC-Orbitrap-MS質(zhì)譜分析12批水牛角、6批山羊角、3批豬蹄甲和2批牦牛角經(jīng)胰蛋白酶酶切后的全部肽段信息,結(jié)合數(shù)學(xué)集合理論分析,從水牛角肽組中排除非水牛角的肽類,進(jìn)一步通過BLAST比對,確定4個水牛角特征肽,序列分別為GPSLAGSASSVR、GGVTCGGLTYSTTAGR、ICEGVGPVDIAVSSSR、LVNELTEFAK,采用UPLC-QQQ-MS的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,對4個特征肽的離子對進(jìn)行優(yōu)化,并對不同角類樣品進(jìn)行檢測,驗證4個特征肽的專屬性,結(jié)果表明4個特征肽在水牛角與牦牛角中均可檢測到,而在山羊角、豬蹄甲中未見響應(yīng),表明可用于區(qū)分水牛角與山羊角、豬蹄甲[39]。后續(xù)基于數(shù)學(xué)集合與Label free定量多肽組學(xué)分析篩選,確定3條牛角特征肽段,序列分別為:AIGCGFGSSGGSSSTIK(特征肽1)、TCGFSTVGSGFGSR(特征肽2)及SDLEAEVESLK(特征肽3),3個特征肽在水牛角、黃牛角及牦牛角中相對含量不同,根據(jù)3個特征肽存在方式可進(jìn)行判別:水牛角樣品可檢出特征肽1與3,黃牛角可檢出特征肽1與2,牦牛角可檢出特征肽2與3[40],這一策略為近緣物種動物藥鑒別區(qū)分提供思路與方法。

3.2 質(zhì)量評價

為有效控制水牛角的質(zhì)量,按照藥典規(guī)定方法,侯惠嬋等[41]測定水牛角中含氮量,發(fā)現(xiàn)12批水牛角濃縮粉與角尖、角樁間氮總量差距較小,平均值為15.9%;課題組前期測定了10批水牛角濃縮粉樣品中水分、總灰分、酸不溶灰分、浸出物和?；撬岷?結(jié)果表明10批水牛角濃縮粉水分為1.8%～13.8%,總灰分為1.0%～6.0%,酸不溶性灰分為0.2%～2.2%,水溶性浸出物含量為3.2%～6.9%,牛磺酸含量為2.9～61.5 μg·g-1[42]。另外,現(xiàn)代研究通過高效液相法檢測水牛角中氨基酸含量,以此控制水牛角質(zhì)量。裴玉等[43]采用Prevail C18柱,以磷酸二氫鈉緩沖液、甲醇、乙腈為流動相,建立了OPA-FMOC試劑聯(lián)用柱前衍生氨基酸的高效液相色譜分析方法,能夠同時測定水牛角藥材中18種常見氨基酸含量。劉博譞等[44]采用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化法建立水牛角濃縮粉氨基酸成分含量分析方法和總氨基酸HPLC特征圖譜,能夠同時測定6種氨基酸成分含量,得到14個氨基酸類特征峰。盡管科研工作者采用了多種方法對水牛角的質(zhì)量進(jìn)行評價與控制,但目前質(zhì)控體系仍有待深入與完善,為藥材與原料、中藥制藥行業(yè)質(zhì)量控制提供靈敏度高、專屬性強的方法體系。

4 水牛角生物效應(yīng)評價研究

水牛角具清熱解毒、涼血定驚之功效,現(xiàn)代藥理研究主要圍繞水牛角解熱、鎮(zhèn)靜、促凝血等藥理活性展開。中醫(yī)臨床常用水牛角及其方劑治療熱證,療效確切,近10年來,水牛角生物效應(yīng)研究主要以解熱效應(yīng)評價為主。

4.1 解熱作用

發(fā)熱模型按發(fā)熱機制的不同,可以分為兩大類:感染性發(fā)熱和非感染性發(fā)熱。課題組前期研究選擇兩種整體動物發(fā)熱模型研究水牛角水提液解熱效應(yīng),結(jié)果表明水牛角對感染性發(fā)熱(酵母致熱)與非感染性發(fā)熱(脫脂牛奶致熱)動物均有顯著的解熱作用,2種發(fā)熱模型均與PGE2水平升高有關(guān)[45-46]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)水牛角顯著降低酵母致熱大鼠體溫的同時,亦可顯著降低發(fā)熱大鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2等炎癥因子水平[47]。

基于UPLC-Q-TOF-MS和多變量統(tǒng)計分析方法檢測水牛角提取物對解熱相關(guān)的所有生物標(biāo)志物干預(yù)情況,結(jié)果表明,水牛角可調(diào)節(jié)包括甘油磷脂、花生四烯酸(Arachidonic acid)、氨基酸、鞘脂和嘌呤代謝等生物標(biāo)志物,水牛角解熱作用與干預(yù)花生四烯酸代謝通路與氧化應(yīng)激通路相關(guān)[48]。

在炎癥發(fā)生過程中,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞受到IL-1β或TNF-α等炎癥因子刺激后釋放PGE2類物質(zhì),從而影響中樞體溫調(diào)定點進(jìn)而引起體溫上升。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),水牛角提取液可下調(diào)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥應(yīng)激下釋放的PGE2水平,且水牛角對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷也具有保護(hù)作用,可抑制乳酸脫氫酶(LDH)的釋放,提高超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性[47]。

此外,水牛角水提液<3 kDa部位可顯著降低發(fā)熱大鼠體溫,顯著降低發(fā)熱大鼠血漿IL-1β、TNF-α、PGE2與cAMP水平[24],有報道含-SH的化合物具有一定的解熱作用,如α-硫辛酸和N-乙?；?L-半胱氨酸能夠通過抑制NMDA受體依賴羥基自由基通路降低自由基產(chǎn)生來緩解發(fā)熱[49-50]。而水牛角肽類分析結(jié)果表明,His、Pro、Cys、Tyr、Trp、Phe、Met等氨基酸的出現(xiàn)頻次較高,Cys為含-SH氨基酸,且作為良好的質(zhì)子供體,Cys可參與氧化還原反應(yīng)對抗氧化應(yīng)激,亦具有發(fā)揮解熱、抗炎作用的潛力。此外,-SH及活性硫簇(Reactive sulfur species,RSS),如HS·、H2Sn、H2S等可降低腦內(nèi)視前區(qū)PGE2、cAMP、cGMP等的釋放,從而緩解炎性,-SH作為關(guān)鍵RSS類物質(zhì)與解熱作用密切相關(guān)[51-52]。因此,水牛角解熱作用確切,與其干預(yù)炎癥發(fā)生過程、氧化應(yīng)激發(fā)生過程密切相關(guān)。

4.2 鎮(zhèn)靜作用

研究表明,水牛角具有較好的鎮(zhèn)靜作用,可顯著減少小鼠自發(fā)活動次數(shù),可協(xié)同戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時間[10]。李寶國等[53-54]研究給予小鼠以水牛角不同相對分子質(zhì)量的酶解液,發(fā)現(xiàn)水牛角能延長戊巴比妥鈉致小鼠睡眠的時間,其中相對分子質(zhì)量<3 kD和10～30 kD的酶解液有明顯的鎮(zhèn)靜作用。

4.3 止血作用

通過小鼠斷尾模型和玻管凝集試驗測定水牛角的凝血時效,發(fā)現(xiàn)水牛角止血作用起效快,止血作用持續(xù)6 h左右。其中,相對分子質(zhì)量>30 kD酶解液有明顯的止血作用。此外,在體外血小板聚集試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)水牛角水解物具有血小板激活作用,但作用強度較弱,水牛角的止血作用可能與激活血小板有關(guān)[54-57]。

水牛角藥理作用以解熱、鎮(zhèn)靜、止血作用為主,作為一種活潑基團(tuán),-SH水平及正常機體血漿中-SH與-S-S-的比例(-SH/-S-S-)穩(wěn)態(tài)平衡與多種疾病相關(guān),病理狀態(tài)下機體的-SH/-S-S-水平會發(fā)生不同程度的上調(diào)或下調(diào)[58]。機體在發(fā)熱、炎癥、驚厥等狀態(tài)下,-SH/-S-S-水平會發(fā)生不同程度改變。例如,在驚厥動物模型中,血漿-SH的水平顯著降低,而-S-S-的水平顯著升高[59];有研究表明,GSH、N-乙酰半胱氨酸(NAC)等含-SH化合物可降低LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱大鼠體溫,并降低腦內(nèi)視前區(qū)PGE2、cAMP、cGMP等的釋放,從而緩解炎性發(fā)熱[60-61],-SH、H2S等關(guān)鍵RSS與發(fā)熱、炎癥等密切相關(guān);另有研究表明,-SH/-S-S-的平衡與凝血酶功能、血液凝固有關(guān),-SH/-S-S-的交換可能是諸多凝血因子活性的限速步驟,也可能是凝血級聯(lián)的整合和控制的基礎(chǔ)[62]。根據(jù)文獻(xiàn)報道及課題組前期研究結(jié)果,水牛角中含-SH類化合物與其清熱、鎮(zhèn)靜、止血等藥理作用緊密相關(guān)。

5 水牛角作為犀角代用資源的應(yīng)用歷史

犀角為哺乳綱奇蹄目犀科動物印度犀RhinocerosunicornisLinnaeus、爪哇犀RhinocerossondaicusDesmarest、蘇門犀RhinocerossumatrensisFischer的角;廣角為黑犀RhinocerosbicornisLinnaeus或白犀RhinocerossimusCottoni的角。犀(廣)角具有清熱定驚、涼血解毒等功效,可用治熱盛火熾、壯熱不退、神昏譫語、驚厥抽搐等癥,《神農(nóng)本草經(jīng)》始載道:“味苦寒”“治百毒,蟲疰,邪鬼,瘴氣,殺鉤吻,鴆羽,蛇毒,除邪,不迷惑,魘寐,久服輕身”[63]。1963年版《中國藥典》記載犀角“味苦、酸、咸,性寒”“具有清熱,涼血,解毒之功效;主治傷寒時疫,熱入營分,驚狂,發(fā)黃,班疹,神昏譫語,血熱妄行,吐血,衄血,下血,熱毒瘡腫”[64],臨床療效顯著,但犀角多依賴進(jìn)口,價格昂貴,且資源匱乏,應(yīng)用于臨床治療受到一定限制。1970年,犀牛被CITES列入瀕危物種,受到國家保護(hù);1993年5月29日,國務(wù)院發(fā)布《關(guān)于禁止犀牛角和虎骨貿(mào)易的通知》,明令禁止交易和使用犀角產(chǎn)品。此外,加之賽加羚羊的數(shù)目驟減,犀角、羚羊角在臨床使用受到極大限制。珍稀角類藥材臨床使用的必要性與現(xiàn)有法令禁止使用的矛盾加劇,因此越來越多的研究人員開展尋找珍稀角類動物藥材替代資源的研究。

20世紀(jì)70年代,為尋找犀、廣角替代資源,國家行業(yè)部門對多種角類進(jìn)行了比較性研究與評價,結(jié)果認(rèn)為水牛角具有相似和確切的功效,且資源豐富、取材廣泛、價格低廉,有效地緩解了中醫(yī)臨床對于犀、廣角的依賴性與法律禁止使用犀、廣角的矛盾。而后1977年版《中國藥典》收載了“水牛角濃縮粉”,即以水牛角管狀部分磅片、水煎、取煎液濃縮后加入經(jīng)微粉化的角尖粉混合制粒所得,并廣泛代用犀、廣角用作醫(yī)藥工業(yè)和臨床調(diào)劑,取得了良好療效。據(jù)統(tǒng)計,現(xiàn)制藥行業(yè)和臨床上使用的現(xiàn)代水牛角處方制劑共計172種,包括濃縮水牛角顆粒、紫雪膠囊、安宮牛黃丸等,在臨床上主要用治高熱、神昏譫語、驚風(fēng)抽搐、小兒熱急驚風(fēng)、頭暈?zāi)垦?、高血壓等疾病?/p>

目前中醫(yī)臨床及中藥制藥行業(yè)以水牛角或水牛角濃縮粉替代犀角應(yīng)用于方劑及中成藥，如：清營湯、犀角湯、犀角地黃湯等均以水牛角替代犀角使用,這些方劑在清熱解毒、定驚涼血等方面均取得了較好的功效。3 871例臨床資料分析表明,水牛角替代犀角治療乙腦、小兒夏季熱、急性扁桃體炎等高熱病證的效果明顯[65]。藥理學(xué)研究表明水牛角與犀角在解熱、止血、鎮(zhèn)靜等方面具有相似的藥理作用。犀角水煎液與水牛角濃縮粉水煎液均能明顯降低大腸埃希菌內(nèi)毒素所致小鼠死亡率;縮短DIC模型大鼠凝血活酶時間、凝血酶原時間、凝血酶時間,升高血小板數(shù);能協(xié)同戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時間,二者均具有抗炎、止血、鎮(zhèn)靜的作用[10]。在松節(jié)油致大鼠發(fā)熱模型中,2.5 g·mL-1犀牛角和水牛角的水提物均表現(xiàn)出顯著的解熱作用[55]。但是在實際臨床應(yīng)用中,水牛角替代犀角入藥時,往往需要加大劑量,其功效才能與犀角相當(dāng)。例如,水牛角代用犀角使用的比例(犀角∶水牛角),在清營湯中為3∶10～3∶20或1∶15，在犀角地黃湯中為1∶10～1∶20，在紫雪中為3∶5或4∶15，在蘇合香丸中為1∶10，在清瘟敗毒飲中為1∶10，在安宮牛黃丸中為1∶20，在至寶丹中為1∶10[23,66-69]。犀角藥用歷史及水牛角代用現(xiàn)狀見圖2。

6 水牛角資源利用與前景展望

水牛角為傳統(tǒng)角類動物藥,在中醫(yī)臨床與中藥制藥行業(yè)應(yīng)用廣泛,歷史悠久。然而一直以來水牛角的基礎(chǔ)研究薄弱,盡管多年來中醫(yī)藥科研工作者圍繞水牛角等角類動物藥的物質(zhì)基礎(chǔ)、生物效應(yīng)、質(zhì)量控制等方面開展研究,但尚不完善,符合水牛角以及角類動物藥資源功效特點、化學(xué)物質(zhì)組分特點的方法體系與開發(fā)模式亟待構(gòu)建。

6.1 深入開展水牛角功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究,闡釋水牛角功效物質(zhì)基礎(chǔ)與效應(yīng)機制的科學(xué)內(nèi)涵

前期研究表明,蛋白質(zhì)、肽類為水牛角重要的功效物質(zhì)基礎(chǔ),其中豐富的含-SH肽類成分更是關(guān)鍵的功效物質(zhì)。緊扣水牛角清熱、鎮(zhèn)靜、止血等藥理作用,合理運用有機化學(xué)、分析化學(xué)、材料化學(xué)等交叉學(xué)科的技術(shù)手段,有針對性地富集、表征并制備水牛角含-SH肽類成分,如利用制備高效-SH富集納米材料,通過親和層析方法批量制備水牛角含-SH肽類成分,采用高通量液質(zhì)聯(lián)用分析手段,結(jié)合“蛋白質(zhì)組-多肽組-修飾組”等多組學(xué)聯(lián)用策略[2,28-29,38],對水牛角功效物質(zhì)進(jìn)行全面表征;進(jìn)一步采用經(jīng)典藥理學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)方法,合理利用模式生物建立符合水牛角傳統(tǒng)功效的動物模型,并從整體動物、細(xì)胞、離體器官、分子水平,圍繞其解熱、鎮(zhèn)靜、止血作用深入開展效應(yīng)機制研究,從而系統(tǒng)闡釋水牛角功效物質(zhì)基礎(chǔ)與效應(yīng)機制的科學(xué)內(nèi)涵。

6.2 構(gòu)建水牛角質(zhì)量控制和評價體系

2020年版《中國藥典》中水牛角項下僅有性狀與鑒別項,水牛角濃縮粉項下有性狀、檢查、浸出物、含量測定,這些方法與指標(biāo)無法全面評價水牛角藥材、中間體、含水牛角成藥或配方顆粒等樣品的質(zhì)量,對中藥制藥過程的質(zhì)量控制、產(chǎn)品溯源、臨床用藥安全等方面不能形成全面質(zhì)控,因而,科學(xué)、系統(tǒng)的水牛角質(zhì)量控制和評價體系亟待構(gòu)建。在2020年版《中國藥典》中,DNA條形碼、專屬肽檢測已應(yīng)用于多個動物藥品種的鑒別,如基于COⅠ序列的DNA條形碼可用于區(qū)分水牛角及其偽品,課題組前期發(fā)現(xiàn)的水牛角特征肽可用于水牛角配方顆粒的檢測。2020年版《中國藥典》阿膠品種除了以氨基酸為含測指標(biāo)外,增加了驢源多肽的含量指標(biāo),如此可顯著提升含量測定指標(biāo)的專屬性,更適合于藥材中間體、成藥、配方顆粒等產(chǎn)品的質(zhì)量控制。因此,以特征性肽類成分的含量對藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)控模式亦可應(yīng)用于水牛角及水牛角濃縮粉。此外,采用Q-maker法[83],根據(jù)“屬性-效應(yīng)-成分”理論,對水牛角進(jìn)行“質(zhì)量標(biāo)記”,對多個活性成分進(jìn)行同步測定,這種方法用于藥效成分復(fù)雜的中藥的質(zhì)量評控更加科學(xué)、高效[84-85]。

本文從水牛角的本草記載、物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量評價、藥理藥效評價進(jìn)行梳理與歸納,結(jié)合課題組前期在水牛角基礎(chǔ)與應(yīng)用研究,在水牛角清熱解毒、涼血定驚的傳統(tǒng)功效應(yīng)用基礎(chǔ)上,圍繞水牛角功效物質(zhì)基礎(chǔ)與效應(yīng)機制科學(xué)內(nèi)涵的闡釋,水牛角質(zhì)量控制和評價體系的構(gòu)建等方面提出設(shè)想與展望,以期更好地服務(wù)于中藥動物藥資源產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)增效及可持續(xù)發(fā)展。