面粉中霉菌和酵母計數(shù)能力驗證結(jié)果分析

能力驗證（Proficiency Testing）是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構(gòu)檢測能力的活動，是檢驗實驗室檢測水平的一項重要手段。實驗室通過參加能力驗證活動，不僅可以清楚了解本機構(gòu)實驗室的檢測能力和水平，考察檢驗人員的技術(shù)水平和設(shè)備的性能，還可以從外部尋找與同行之間的差異，發(fā)現(xiàn)自身存在的不足，及時有效地提出改進(jìn)措施，持續(xù)改進(jìn)和完善實驗室的質(zhì)量控制和管理[1-2]。

霉菌和酵母屬于真菌，在食物中繁殖速度非?？欤瑫a(chǎn)生大量的毒素，對人體造成致命性的危害。例如，黃曲霉毒素就是由黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素，黃曲霉毒素已被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)劃定為一類天然存在的致癌物[3]?；ㄉ?、花生油、玉米等食品中極易受到黃曲霉毒素的污染。同時，霉菌和酵母也是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌，已成為食品中常規(guī)的檢測項目之一[4]。目前，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）是普遍采用的霉菌和酵母檢驗方法，該方法操作簡單，但由于霉菌和酵母自身繁殖特點，前期生長緩慢，后期急劇生長，蔓延生長甚至連片，導(dǎo)致計數(shù)時比較困難，因此霉菌和酵母計數(shù)也是考察實驗室和檢測人員技術(shù)水平的重要參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

本次能力驗證樣品由中國食品藥品檢定研究院提供，2份待測樣品，每份樣品包含裝有菌球的西林瓶1瓶（規(guī)格：1粒/瓶）和相同編碼的面粉1袋（規(guī)格：25 g/袋），2份樣品的編號分別為TF03280014和TF03280027。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

孟加拉紅瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；0.85%無菌生理鹽水，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

無菌均質(zhì)器S-154，上海德記行科技發(fā)展公司；MJ-250BSH-Ⅲ型霉菌培養(yǎng)箱S-01，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品處理

在生物安全柜內(nèi)打開裝有霉菌和酵母菌球的西林瓶，并將霉菌和酵母菌球加入到盛225 mL 0.85%無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，充分均質(zhì)混勻。再將與西林瓶相同編碼的面粉基質(zhì)加入到上述生理鹽水中，充分均質(zhì)混勻，作為1∶10的樣品勻液。

1.4.2 樣品稀釋

（1）吸取1∶10樣品勻液1 mL，加入到盛有9 mL無菌生理鹽水的無菌試管中，混勻，制成1∶100的樣品勻液，依此法繼續(xù)用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，制備1∶1 000的樣品勻液。

（2）分別吸取各稀釋級的樣品勻液1 mL于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋級做2個平皿。同時，分別取1 mL 0.85%無菌生理鹽水加入到兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。及時將20～25 mL冷卻至46 ℃的孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻，置水平臺面待培養(yǎng)基完全凝固。

（3）培養(yǎng)。將上述凝固后培養(yǎng)基，正置平板，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第5天，逐日觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取樣方式下霉菌和酵母的計數(shù)結(jié)果

面粉一般指小麥粉，即由小麥磨成的粉狀物。面粉主要成分是淀粉，是不溶于水的，會形成懸濁液[5]，面粉在0.85%的無菌生理鹽水中也不能完全溶解，會形成懸濁液，放置1～2 min面粉會下沉至底部，所以取樣方式對檢測結(jié)果會有一定影響。本實驗設(shè)計兩種取樣方式。第一種是用無菌均質(zhì)器均質(zhì)1 min混勻后直接取懸濁液進(jìn)行后續(xù)檢測，第二種是用無菌均質(zhì)器均質(zhì)1 min混勻后放置1～2 min取上清液進(jìn)行后續(xù)檢測。從計數(shù)結(jié)果來看，第二種取樣方式霉菌和酵母數(shù)均比第一種取樣方式多，詳見表1、表2。本實驗選取第二種取樣方式（上清液）的結(jié)果報數(shù)，TF03280014的Z值為1.68，TF03280027的Z值為0.66，兩份樣品|Z|值均小于2.0，|Z|值≤2為滿意結(jié)果，故兩份樣品結(jié)果均為滿意。

表1 TF03280014霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果表

表2 TF03280027霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果表

2.2 孟加拉紅培養(yǎng)基上霉菌和酵母生長形態(tài)變化

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基中的氯霉素可抑制細(xì)菌的生長，孟加拉紅是一種選擇性抑菌劑，也可抑制細(xì)菌的生長，并減緩某些霉菌菌落的蔓延生長。孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基可選擇性地抑制細(xì)菌生長而不影響霉菌和酵母的生長，排除細(xì)菌生長帶來的干擾。

在孟加拉紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)霉菌和酵母，到第2天才開始有菌落生長，以10-1稀釋級霉菌和酵母培養(yǎng)第2～5天的生長形態(tài)為例來描述霉菌和酵母生長趨勢，見圖1。霉菌和酵母均在培養(yǎng)至第2天時可以看到明顯的菌落，第3～5天霉菌迅速生長，酵母相對比較小，霉菌菌絲蔓延成片。對于霉菌而言培養(yǎng)至第3天的時候菌落已出現(xiàn)連片現(xiàn)象，從正面不易計數(shù)，從背面可以清晰看見菌核，易于計數(shù)。實驗中發(fā)現(xiàn)在菌落數(shù)比較少的稀釋級平板上（如10-2稀釋級），培養(yǎng)至第2天到第5天的菌落數(shù)基本沒有變化。

綜合以上描述，觀察結(jié)果應(yīng)逐天進(jìn)行，尤其是培養(yǎng)2～3 d時，霉菌計數(shù)比較關(guān)鍵。酵母相對于霉菌菌落較小，菌落形態(tài)清晰，易于計數(shù)。

圖1 TF03280014霉菌和酵母10-1級兩個平行平皿培養(yǎng)后的菌落形態(tài)變化圖

3 結(jié)論與討論

3.1 影響計數(shù)的關(guān)鍵因素

3.1.1 取樣方式

本次能力驗證設(shè)計了兩種取樣方式來考察霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果。第二種取樣方式（取上清液開展后續(xù)試驗）比第一種取樣方式（取懸濁液開展后續(xù)試驗）計數(shù)結(jié)果偏多，分析原因有兩個方面。①經(jīng)過均質(zhì)的樣品勻液可認(rèn)為是菌株均勻分布于0.85%的生理鹽水中，放置一會兒面粉顆粒會下沉至底部，此時分別吸取1 mL樣品懸濁液和上清液，懸濁液中的面粉顆粒會占據(jù)一部分的體積，上清液中面粉顆粒相對較少菌含量相對較高。②面粉顆粒在后續(xù)觀察時會影響視線，容易少計數(shù)，所以本實驗選擇取上清液的結(jié)果報數(shù)。

3.1.2 計數(shù)方法

（1）培養(yǎng)時間。實驗觀察發(fā)現(xiàn)霉菌和酵母從培養(yǎng)至第2天開始計數(shù)，此后霉菌生長速度很快，至第4天菌絲布滿整個平板，霉菌和酵母相互覆蓋影響準(zhǔn)確計數(shù)。培養(yǎng)至第5天時，從正面無法計數(shù)，只能從背面計數(shù)（圖2）。此時計數(shù)相對來說誤差會比較大。同時霉菌會產(chǎn)生菌絲，在觀察結(jié)果的過程移動平板，會造成菌絲飄散，形成次生菌。

圖2 TF03280014培養(yǎng)至第5天霉菌和酵母的菌落形態(tài)圖

（2）菌落形態(tài)。每份樣品中都有霉菌和酵母，霉菌生長速度快，后期逐漸形成褶皺，第4天、第5天霉菌布滿整個平板，此時霉菌從正面難以計數(shù)，從背面計數(shù)霉菌主要以菌核計算（如圖2），但是有些菌核不明顯，此時能不能記為單獨菌落又因人而異（如圖3中B處）。霉菌培養(yǎng)至第4天時就產(chǎn)生明顯的褶皺，從背面看像是兩個菌核（如圖3中A處），容易計成兩個菌落。部分酵母長在培養(yǎng)基內(nèi)部，部分長在培養(yǎng)基表面，霉菌蔓延至整個平皿的時候掩蓋住部分酵母，正面難以準(zhǔn)確計數(shù)，而從背面計數(shù)時因酵母有大有小，小的菌落與面粉顆粒容易混淆，菌落計數(shù)存在誤差（如圖4標(biāo)識圓圈內(nèi)）。

圖3 TF03280027 10-2級在孟加拉紅瓊脂上培養(yǎng)至第4天的形態(tài)（背面觀察）圖

圖4 TF03280014 10-2級在孟加拉紅瓊脂上培養(yǎng)至第4天的形態(tài)（背面觀察）圖

3.2 能力驗證中關(guān)鍵控制點

3.2.1 人員

檢測人員是影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確性和真實性至關(guān)重要的因素。食品微生物檢測人員需具備食品微生物檢測的專業(yè)知識，并有相關(guān)的實習(xí)經(jīng)驗或工作經(jīng)驗，檢測人員需通過食品微生物檢測相關(guān)理論知識和實操技能考試，取得上崗證后方可上崗。檢測人員實驗操作熟練度和規(guī)范性直接影響實驗結(jié)果，檢測人員可每年參加專業(yè)機構(gòu)組織的“生物安全”“食品微生物檢測理論和實操”等主題的培訓(xùn)班來提高自身理論知識和檢驗水平，不斷積累總結(jié)好的經(jīng)驗，優(yōu)化自身知識結(jié)構(gòu)，提升自身綜合素質(zhì)。實驗室可結(jié)合日常工作情況、外部審核、能力驗證等對檢驗人員定期開展監(jiān)控。對于特殊情況，如新項目、新設(shè)備、新人員上崗、投訴和結(jié)果偏離等情況應(yīng)隨時開展監(jiān)控[6]。

3.2.2 實驗條件

實驗室應(yīng)配備滿足檢驗要求的儀器設(shè)備，設(shè)備應(yīng)檢定合格，使用之前應(yīng)做好確認(rèn)，并定期做期間核查；實驗室應(yīng)配備符合要求的培養(yǎng)基及試劑，培養(yǎng)基應(yīng)驗收合格，使用之前應(yīng)完成質(zhì)量控制，因孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基見光易分解，配制好的培養(yǎng)基可應(yīng)避光放置，培養(yǎng)基最好現(xiàn)用現(xiàn)配，不要放置于冰箱中過夜保存。

3.2.3 實驗方法

確認(rèn)樣品完好無誤后，檢測人員應(yīng)認(rèn)真閱讀相關(guān)能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書，嚴(yán)格按要求處理樣品，在轉(zhuǎn)移西林瓶里的菌球時，應(yīng)注意看菌球是否有散落，可用稀釋液反復(fù)沖洗西林瓶，保證目標(biāo)菌盡可能完全轉(zhuǎn)移，目標(biāo)菌的轉(zhuǎn)移對后續(xù)菌落計數(shù)至關(guān)重要。后續(xù)檢測應(yīng)嚴(yán)格按照GB 4789.15—2016要求進(jìn)行，操作要規(guī)范。微量移液器卡緊槍頭，防止漏液，保持豎直，在轉(zhuǎn)移過程中不要碰到試管內(nèi)側(cè)；每次稀釋要充分混勻，操作過程要規(guī)范，防止樣液噴濺；培養(yǎng)基溫度需冷卻至46 ℃，加入培養(yǎng)基后需立即轉(zhuǎn)動平皿混勻，力度不要過大，防止培養(yǎng)基濺出。

3.2.4 結(jié)果計數(shù)

在本次能力驗證中發(fā)現(xiàn)，霉菌和酵母一般在48 h以后開始生長，所以本文建議從培養(yǎng)至第2 天開始計數(shù)，計數(shù)過程中注意輕拿輕放平，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)平板，防止霉菌菌絲飄散形成次生菌。霉菌后期生長速度很快，菌絲蔓延，計數(shù)比較困難，霉菌在培養(yǎng)至第3天、第4天和第5天時菌落數(shù)基本一致，本文建議霉菌計數(shù)可密切關(guān)注培養(yǎng)至第3天的結(jié)果，酵母計數(shù)可重點關(guān)注培養(yǎng)至第4天、第5天的結(jié)果。