邢立剛，鄒 峰，梁 靜，張燦峰，李澤舟，羅大剛，梅 剛，馬 磊，周群文

[1.長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶涪陵 408000；2.重慶中邦藥業(yè)（集團(tuán)）有限公司，重慶涪陵408000]

黑斑病是烏頭、冬青、薔薇、甜菜等植物的普通病害，由多種真菌所致，包括假單胞屬（Pseudomonas）細(xì)菌及多腔菌屬（Asterina）、星盾炱屬（Asterinella）、小星盾炱屬（Asteroma）、星殼孢屬（Diplotheca）、小叢殼屬（Glomerella）、日規(guī)殼屬（Gnomonia）、裂盾菌屬（Microthyriella）、扁殼黴屬（Placosphaeria）、疵黴屬（Stigmea）等真菌。莖瘤芥黑斑病是由半知菌亞門鏈格孢屬蕓薹鏈格孢侵染引起[1]，它對(duì)莖瘤芥的侵染一般發(fā)生在潮濕季節(jié)[2]，可能發(fā)生在葉或莖部，癥狀為出現(xiàn)圓形或不規(guī)則形黑色斑片狀病損，病斑隨著病害的持續(xù)而逐漸加深并且出現(xiàn)凹陷，最終形成黑色硬質(zhì)斑塊，嚴(yán)重影響莖瘤芥的生長[3]。病害發(fā)展到后期嚴(yán)重時(shí)，會(huì)出現(xiàn)多個(gè)病斑連結(jié)成一塊大的病斑。在有機(jī)農(nóng)藥出現(xiàn)以前，我國常使用的農(nóng)藥有植物源農(nóng)藥及無機(jī)農(nóng)藥，只是在有機(jī)農(nóng)藥出現(xiàn)以后，有機(jī)農(nóng)藥快速占據(jù)主導(dǎo)地位，因?yàn)橛袡C(jī)農(nóng)藥對(duì)病蟲害的防治效果要遠(yuǎn)強(qiáng)于植物源農(nóng)藥和無機(jī)農(nóng)藥[4]，雖然防治效果好，但會(huì)帶來環(huán)境污染、生態(tài)平衡破壞和食品安全等一系列問題，因此在開發(fā)低毒有機(jī)農(nóng)藥的同時(shí)，具有安全、有效、無污染等優(yōu)點(diǎn)的植物源農(nóng)藥重新回歸人們的視野[5-7]。自然界中蘊(yùn)藏大約50 萬種的植物資源[8]，許多植物具有抑菌成分，可按照不同比例復(fù)配形成植物源抑菌劑，已廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)貯藏。植物農(nóng)藥與有機(jī)農(nóng)藥各有優(yōu)缺點(diǎn)，植物農(nóng)藥有安全、無污染等優(yōu)點(diǎn)，但其防治效果遠(yuǎn)不如有機(jī)農(nóng)藥；而有機(jī)農(nóng)藥則相反，防治效果好，但有環(huán)境污染、不安全等缺點(diǎn)。通過對(duì)不同復(fù)配比例及濃度進(jìn)行試驗(yàn)[9-10]，篩選出效果好、污染低、更加安全的農(nóng)藥[11]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

本試驗(yàn)從重慶市涪陵區(qū)義和街道采集莖瘤芥的黑斑病標(biāo)本，在PDA 培養(yǎng)基上用常規(guī)組織分離法獲得純培養(yǎng)。參試中藥包括貓爪草、白頭翁、千年健、五指毛桃、蟬花、蛇床子、蒙古蒿、穿心蓮、豨薟草、寬筋藤、鴨腳艾、草豆蔻、燈心草、柚核、麻黃，分別購于桐君閣大藥房和廣州采芝林國醫(yī)館有限公司北商大藥房，對(duì)照農(nóng)藥為25%多菌靈。

恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱（ZHWY-2102C），高溫?cái)?shù)顯陶瓷電熱板（C-MAG HP 7），自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（GI54DWS），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基制備

稱取200 g 土豆加入足量超純水，煮至土豆酥軟且水量小于500 mL，各稱取20 g 葡萄糖、瓊脂，加超純水至500 mL，制成兩倍濃度PDA培養(yǎng)基，再分裝入2 個(gè)錐形瓶，其中1 瓶加250 mL 超純水制成正常的PDA 培養(yǎng)基。吸取10 mL 兩倍濃度PDA 培養(yǎng)基于6 支試管中，取培養(yǎng)皿，同時(shí)將6 支試管及200 mL 超純水一同滅菌，115 ℃下滅菌30 min[12-13]。取出后置于水浴鍋中，90 ℃保溫?？赵嚬芎团囵B(yǎng)皿滅菌烘干備用。

1.2.2 真菌復(fù)蘇

取出水浴鍋中正常PDA 培養(yǎng)基置于超凈工作臺(tái)，倒平板，取出莖瘤芥黑斑病真菌的菌液置于超凈工作臺(tái)，吸取50 μL 菌液加入平板中，涂均勻后封口，放入25 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，下次接取菌餅備用。

1.2.3 中藥提取液的制備

每種中藥稱取30 g，加入適量超純水，浸泡30 min，進(jìn)行熬制，待煮沸開始計(jì)時(shí)，熬制20 min 后倒入大燒杯，共熬制3 次，用4 層紗布過濾[14]，繼續(xù)濃縮至30 mL，放入4 ℃冰箱備用[15]。

1.2.4 單味中藥與復(fù)方中藥的抑菌試驗(yàn)

將試管和培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)，吸取中藥液和滅菌水加入試管中，制成濃度為0.2、0.6、1.0 g·mL-1的藥液10 mL，塞上棉塞取出進(jìn)行90 ℃水浴加熱。將兩倍濃度PDA 培養(yǎng)基的試管取出，放入恒溫水浴鍋，取出2支裝培養(yǎng)基的試管和2支裝藥液的試管，75%酒精消毒后移入超凈工作臺(tái)，倒入培養(yǎng)皿之中混勻。冷卻后，切取5 mm的菌餅，向藥基中接入菌餅，用封口膜進(jìn)行封口[16]。取出，置于恒溫培養(yǎng)箱，25 ℃倒置培養(yǎng)[17]。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[18]。

待中藥篩選完畢，通過前面單味中藥試驗(yàn)結(jié)果制出復(fù)方中藥，按照比例稱取藥材，加水熬制濃縮成1 g·mL-1的中藥提取液，制成0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 g·mL-1的藥基[19]，向培養(yǎng)基中接入菌餅，封口，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)[20]，待培養(yǎng)結(jié)束，取出測(cè)量菌落直徑，拍照。

1.2.5 農(nóng)藥的抑菌試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)中，向試管中加入1 g 多菌靈粉劑，加入超純水至10 mL，吸取1 mL 藥液加入另一支試管中，再加入超純水至10 mL，進(jìn)行梯度稀釋[21]，稀釋成0.1 mg·mL-1的稀釋液，取出PDA 培養(yǎng)基加熱融化，先將多菌靈稀釋液加入平皿，再將培養(yǎng)基加入，混勻制成1、2、4、6、8、10 μg·mL-1的20 mL 多菌靈藥基。待多菌靈藥基冷卻，切取菌餅接入藥基，方法同上。

1.2.6 復(fù)方中藥與農(nóng)藥復(fù)配的抑菌試驗(yàn)

以1 g·mL-1的中藥配方藥液與0.1 g·mL-1的多菌靈藥液為原液，按照1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的比例制成25 組不同比例的藥基，置于超凈工作臺(tái)中，將中藥液按照每個(gè)藥基所需要的量加入試管，取出進(jìn)行水浴加熱保溫。在平皿上加入不同量的農(nóng)藥溶液，取出滅菌的培養(yǎng)基，水浴保溫，同時(shí)取出中藥液和培養(yǎng)基加入含有農(nóng)藥的培養(yǎng)皿，混勻，藥基制作完成。接入菌餅培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)其菌落直徑進(jìn)行測(cè)量、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單味中藥及復(fù)方中藥對(duì)黑斑病真菌的抑制效果

2.1.1 單味中藥的抑菌率

由表1可見，千年健、白頭翁、貓爪草在0.3 g·mL-1濃度下，黑斑病真菌菌絲不再生長，抑菌率達(dá)到100%；五指毛桃、蟬花在0.5 g·mL-1濃度下抑菌率達(dá)到100%；蛇床子、穿心蓮在0.5 g·mL-1濃度下抑菌率最大，在80%～90%；寬筋藤、豨薟草、鴨腳艾在0.5 g·mL-1濃度下抑菌率最大，在70%～80%；柚核、麻黃、燈心草在0.5 g·mL-1濃度下抑菌率最大，但低于60%。在李鵬祥的研究中，發(fā)現(xiàn)藿香的水提物、醇提物對(duì)人參黑斑病菌的抑制效果相差極大，在濃度0.01 g·mL-1時(shí)抑菌率分別為34.9%、88.2%[22]。提取方式不同，同一種藥材提取物的抑菌效果也不相同[23]，所以試驗(yàn)可能存在部分藥材因提取方式不恰當(dāng)導(dǎo)致的抑菌效果不佳[24]。

表1 單味中藥對(duì)莖瘤芥黑斑病菌的抑制率 單位：%

2.1.2 復(fù)方中藥的抑菌率

由表2可見，復(fù)方中藥濃度達(dá)0.2 g·mL-1時(shí)，對(duì)莖瘤芥黑斑病菌的抑制率已達(dá)100%；隨著復(fù)方藥濃度的降低，抑菌率也在下降，在0.2 g·mL-1濃度及以上的抑菌率均為100%。

表2 復(fù)方中藥對(duì)莖瘤芥黑斑病菌的抑制率

2.2 農(nóng)藥對(duì)黑斑病真菌的抑制

25%多菌靈濃度為2 μg·mL-1時(shí)，其抑菌率為100%，表明多菌靈對(duì)莖瘤芥黑斑病真菌具有極強(qiáng)的抑菌效果；多菌靈濃度為1 μg·mL-1時(shí)，抑菌率為93.1%。在馬榮等關(guān)于紅棗黑斑病菌的殺菌劑研究中，發(fā)現(xiàn)75%百菌清等殺菌劑的EC50均高于1 μg·mL-1，其中40%氟硅唑、50%喹啉銅的EC50值低于1 μg·mL-1，其濃度達(dá)到1 μg·mL-1時(shí)抑菌效果遠(yuǎn)低于90%[25]。25%多菌靈制成培養(yǎng)基對(duì)莖瘤芥黑斑病菌的抑制效果極強(qiáng)，需要稀釋濃度，應(yīng)遠(yuǎn)低于說明書上的濃度，可能是室內(nèi)毒力與大田防治的差別，也可能是初次使用多菌靈，菌種對(duì)多菌靈的抗性極低的原因。

2.3 中藥配方與農(nóng)藥復(fù)配對(duì)黑斑病真菌的抑制

在參考高小寬等關(guān)于農(nóng)藥與三七復(fù)配的研究基礎(chǔ)上[26]，這里我們將多菌靈濃度0.0005 mg·mL-1與復(fù)方中藥濃度50 mg·mL-1分別為定義為最大濃度1∶1，復(fù)配比例如表3。結(jié)果表明，配比為3∶1 時(shí)，抑菌率最大為88.24%；配比為1∶3 時(shí)，抑菌率最大為85.29%；配比為2∶1 時(shí)，抑菌率最大為79.41%；配比為1∶2時(shí)，抑菌率最大為73.53%；配比為1∶1 時(shí)，抑菌率最大為65.88%；5 組配比中抑菌效果最好的是3∶1，最差的是1∶1，抑菌率隨著多菌靈濃度降低而下降得更快，復(fù)方中藥與農(nóng)藥復(fù)配的抑菌效果下降。

表3 復(fù)方中藥與多菌靈不同復(fù)配比例下的抑菌率

3 小結(jié)與討論

通過單味中藥的抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑菌效果最好的有千年健、白頭翁、貓爪草3種，在0.3 g·mL-1濃度時(shí)對(duì)莖瘤芥黑斑病真菌的抑菌率已達(dá)到100%；五指毛桃稍差，濃度0.3 g·mL-1時(shí)的抑菌率為88%，五指毛桃與蟬花在濃度0.5 g·mL-1時(shí)達(dá)到了100%的抑菌率；蛇床子、穿心蓮次之，在濃度0.5 g·mL-1時(shí)對(duì)黑斑病真菌同樣有很強(qiáng)的抑制效果，抑菌率達(dá)到80%以上；鴨腳艾、豨薟草、寬筋藤對(duì)莖瘤芥黑斑病真菌有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌率在70%～80%；燈心草、麻黃、柚核，抑菌效果最差，在藥物濃度0.5 g·mL-1時(shí)的抑菌率不足50%。單獨(dú)使用貓爪草、白頭翁時(shí)，藥劑濃度從0.1 g·mL-1升到0.3 g·mL-1，其抑菌率出現(xiàn)跳躍式增長，可能與朱華旭等研究一樣，在用水煎和濃縮過程中出現(xiàn)沉淀，制作藥基時(shí)吸取上層清液，未搖晃混勻，且藥物濃度低，藥液中抑菌活性物質(zhì)減少，使得抑菌效果不佳[27]。用25%多菌靈可濕性粉劑制作的藥物培養(yǎng)基對(duì)莖瘤芥黑斑病真菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制效果，在濃度為1 μg·mL-1時(shí)抑菌率達(dá)93.1%，藥物濃度比之中藥要低很多，但就如石志琦等認(rèn)為的一樣，多菌靈作用的靶標(biāo)真菌容易產(chǎn)生抗藥性，從而導(dǎo)致防治失敗[28]。復(fù)方中藥的抑菌效果比單味中藥效果要好，可能是各種中藥之間存在相互增益，使得抑菌效果增強(qiáng)很多，在藥物濃度為0.1 g·mL-1時(shí)抑菌率就高達(dá)96%。復(fù)方中藥和多菌靈復(fù)配所得的抑菌率比預(yù)期要差，復(fù)配的抑菌率還不如相同濃度下單獨(dú)使用時(shí)的抑菌率。

綜上所述，針對(duì)本試驗(yàn)所選的中藥，可繼續(xù)進(jìn)行單味中藥抑菌制劑的研究，也可從中藥毒性和降低農(nóng)藥殘留兩個(gè)方面考慮，通過降低藥物濃度，研究復(fù)方中藥和農(nóng)藥的復(fù)配比例，達(dá)到減毒增效復(fù)配農(nóng)藥的效果。試驗(yàn)結(jié)果可對(duì)莖瘤芥黑斑病復(fù)配中藥農(nóng)藥、降低化學(xué)農(nóng)藥殘留與污染的研究提供依據(jù)，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。