胡家勇 周陶鴻 姚曉帆 袁敏文 柳 迪

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075；2. 國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430075；3. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075；4. 黃石市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，湖北 黃石 435000)

保健酒是指具有特定保健功能的酒，即適宜于特定人群飲用，具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能，不以治療為目的的酒[1]。保健酒主要以保健、養(yǎng)生、健體為目的，但為增加保健酒的壯陽效果，不法商販會在酒中非法添加了西地那非(俗稱“偉哥”藥品成分)等化學(xué)成分。那非類藥物具有一定毒副作用，若長期飲用添加“偉哥”的“保健酒”，會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)分泌失調(diào)、頭痛、昏厥、狂躁，引起心血管功能紊亂和呼吸功能衰竭，甚至導(dǎo)致死亡[2]。目前對于保健酒中那非類藥物的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3-5]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[6-9]、HPLC-MS/MS[10-11]和薄層色譜法[12]等，此外，免疫法[13]、 紅外[14-15]及離子遷移譜法[16]等都被嘗試用于保健食品中西地那非類藥物的測定。目前國標(biāo)檢驗(yàn)方法[17-18]采用的是HPLC-MS，該方法在檢測的靈敏度、選擇性和高通量方面優(yōu)勢顯著，但是存在檢測周期長、儀器昂貴、檢驗(yàn)費(fèi)用高等缺點(diǎn)。目前關(guān)于保健食品中那非類藥物的檢驗(yàn)(無論是色譜法、質(zhì)譜法，還是拉曼光譜法[19-21])都是針對已知目標(biāo)物的靶向檢測(HPLC-MS方法亦屬于靶向檢驗(yàn))。鑒于食品中非法添加的那非類藥物種類高達(dá)90種，并且還在不斷更新，亟需建立一種非靶向檢測技術(shù)以實(shí)現(xiàn)保健食品中非法添加那非類藥物的快速篩查。

研究擬利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)建立那非類藥物譜圖庫以及配套的數(shù)據(jù)庫檢索方式，將采集的光譜圖導(dǎo)入到非靶向篩查數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)非法添加物的快速初步篩查，以期為食品非法添加物檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金納米溶膠：普拉瑞思科學(xué)儀器(蘇州)有限公司；

乙酸乙酯、氯金酸、檸檬酸三鈉、硫酸、氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

西地那非、他達(dá)那非、脫硫伐地那非、慶地那非、那非乙酰酸、苯酰胺那非等78種那非類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(見表1)：純度≥98%，中國藥品生物制品研究所；

拉曼光譜儀：inVia型，英國Renishaw公司；

紫外分光光度計：UH5300型，日立公司；

掃描電鏡：Quanta650 FEG，美國FEI公司。

表1 78種那非類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

續(xù)表1

1.2 方法

1.2.1 SERS基底制備 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[22]。根據(jù)氯金酸和檸檬酸三鈉溶液的不同配比(見表2)，制備不同粒徑的膠體金粒子。制備完成后膠體金粒子在200～800 nm波段進(jìn)行紫外光譜掃描。

表2 膠體金制備

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 用甲醇分別將78種那非類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18 ℃下避光保存。使用前需恢復(fù)至室溫。

1.2.3 樣品前處理 吸取1 mL試樣于15 mL離心管中，向離心管中加入4 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min 離心5 min，收集上層有機(jī)相并定容至5 mL，上層有機(jī)相為提取液A。吸取1 mL提取液A于10 mL離心管中，加入4 mL 0.3 mol/L硫酸溶液，振蕩渦旋5 min 后3 000 r/min離心5 min，收集下層溶液并定容至5 mL，下層溶液為提取液B。依次向檢測瓶中加入500 μL 納米金溶膠，100 μL提取液B，100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測。

1.2.4 拉曼光譜儀測定條件 曝光時間1 s，激光功率100 mW，掃描次數(shù)1次，物鏡倍數(shù)50 L，激光波長785 nm，光柵1 200 L/mm，掃描范圍650～1 700 cm-1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用OMIC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，用Python軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金表征

2.1.1 不同粒徑膠體金目測評價及紫外光譜表征 當(dāng)1%檸檬酸三鈉加入量為2.0 mL(1號)和1.5 mL(2號)時，所得到的膠體金呈酒紅色，此時的膠體金粒徑較小，視覺良好透明度高，無懸浮顆粒出現(xiàn)；當(dāng)加入量為1.0 mL(3號)和0.7 mL(4號)時，膠體金呈現(xiàn)深紅色；當(dāng)加入量為0.5 mL(5號)和0.4 mL(6號)時，呈磚紅色，且膠體金透明度較低，有明顯肉眼可見的顆粒懸浮物。其中5號、6號放置一段時間出現(xiàn)了聚沉現(xiàn)象，穩(wěn)定性差，而1號、2號、3號、4號金納米溶膠未出現(xiàn)此現(xiàn)象，溶膠穩(wěn)定性較好。

由圖1可知，6組納米金溶膠均有明顯的吸收峰，每組的最大吸光值不同，1～3號納米金膠體的最大吸光度逐漸增大，4～6號的最大吸光度逐漸減小。隨著檸檬酸三鈉添加量逐漸減少，最大吸收峰發(fā)生了明顯的紅移現(xiàn)象，因此，納米金的最大吸收峰隨其粒徑的增大而發(fā)生紅移，與文獻(xiàn)[23]研究結(jié)果一致。

圖1 不同粒徑膠體金紫外吸收光譜

2.1.2 金納米溶膠靈敏度性能評價 基底的靈敏度是評估基底是否合適的關(guān)鍵指標(biāo)，其中，基底的靈敏度通常由增強(qiáng)因子[24](EF)表示，增強(qiáng)因子數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

(1)

式中：

Eλ——增強(qiáng)因子；

ISERS——分析物的SERS光譜中選定的特征峰的強(qiáng)度；

IR——分析物的常規(guī)Raman光譜中選定的特征峰的強(qiáng)度；

NSERS——SERS光譜采集的被分析物分子的相應(yīng)數(shù)量；

NR——常規(guī)Raman光譜采集的被分析物分子的相應(yīng)數(shù)量。

選取西地那非作為目標(biāo)物進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

對于金溶膠溶液拉曼增強(qiáng)基底，SERS探測和普通拉曼探測時的有效散射體積可認(rèn)為相同，此時SERS增強(qiáng)因子按式(2)[25]計算：

(2)

式中

Eλ——增強(qiáng)因子；

ISERS——分析物的SERS光譜中選定的特征峰的強(qiáng)度；

IR——分析物的常規(guī)Raman光譜中選定的特征峰的強(qiáng)度；

CR——普通拉曼光譜探測時溶液質(zhì)量濃度，mg/L；

CSERS——SERS光譜探測時溶液質(zhì)量濃度,mg/L。

1～6號金納米溶膠增強(qiáng)因子分別為2×103，6×103，8×105，1.2×106，1.5×105，4×103，其中4號金納米溶膠增強(qiáng)因子最高。結(jié)合目測評價、紫外光譜表征以及靈敏度性能評價對1～6號不同金納米溶膠進(jìn)行綜合評價，最終結(jié)果顯示4號金納米溶膠性能最佳，因此膠體金制備方式為：在98.3 mL超純水中加入1.0 mL 1%氯金酸和0.7 mL 1%檸檬酸三鈉。

2.1.3 金納米溶膠SEM表征 圖2是4號金納米溶膠的SEM圖。由圖2可知，4號金納米溶膠粒子分布均勻，形狀較為規(guī)則，粒徑范圍為70～114 nm。

2.2 光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理

在拉曼光譜測試中，熒光是影響拉曼光譜分析的主要因素之一。利用WIRE 5.0拉曼光譜分析軟件并使用熒光校正+基線校正+一階導(dǎo)數(shù)的方法對光譜進(jìn)行預(yù)處理。

圖2 金納米溶膠的SEM圖

2.3 自建數(shù)據(jù)庫

按照拉曼光譜儀的測定方式測定78種那非類藥物，獲取拉曼光譜圖，并將SPC格式的文件導(dǎo)入OMIC軟件中，同時備注化學(xué)藥物的名稱、CAS號，構(gòu)建非靶向篩查數(shù)據(jù)庫。

2.4 數(shù)據(jù)庫的檢索

樣品經(jīng)1.2.3的前處理方式處理后在650～1 700 cm-1掃描范圍的模式下采集光譜，將采集的光譜圖導(dǎo)入到非靶向篩查數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索篩查，檢索結(jié)果中匹配度高于70%的樣品被認(rèn)為是疑似添加了那非類藥物[26]。

2.5 非法添加物歸屬分析

為了能夠確定檢索出來的疑似物的類別歸屬及母核結(jié)構(gòu)，研究基于78種那非類藥物的拉曼光譜信息數(shù)據(jù)，通過Python軟件對78種那非類藥物進(jìn)行聚類分析，將78種那非類藥物分為了4種，定義為西地那非類、他達(dá)那非類、硫代西地那非類、伐地那非類。結(jié)合2.3的自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行那非類疑似藥物的篩查及疑似物的母核結(jié)構(gòu)預(yù)測。具體分類歸屬見表3。

表3 78種那非類藥物分類

2.6 篩查方法最低檢出質(zhì)量濃度

選取4類那非類藥物中具有代表性(結(jié)構(gòu)與母核結(jié)構(gòu)最接近)的化合物進(jìn)行方法的最低檢出質(zhì)量濃度研究，選取的化合物分別為西地那非、他達(dá)那非、硫代西地那非、乙酰伐地那非，其對應(yīng)的最低檢出質(zhì)量濃度見表4。

表4 代表化合物最低檢出質(zhì)量濃度

選取西地那非進(jìn)行最低檢出質(zhì)量濃度確定，結(jié)果見圖3。空白僅有試劑的SERS峰出現(xiàn)，而0.05，0.1，0.2 mg/L均出現(xiàn)了西地那非SERS特征光譜圖，由此確定其最低檢出質(zhì)量濃度為0.05 mg/L。其他化合物的最低檢出質(zhì)量濃度同法確定。

圖3 最低檢出質(zhì)量濃度光譜圖

2.7 方法特異性考察

選取40個保健酒陰性樣品，其中10個樣品添加78種那非類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，10個樣品添加建庫之外的那非類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(那莫西地那非、羥基豪莫西地那非、羥基硫代豪莫西地那非、去乙基巴地那非、伐地那非乙?；愃莆铩⒈醣交惗』啬欠?、他達(dá)那非二氯代雜質(zhì)、二硫代去乙基卡巴地那非)，構(gòu)建20個質(zhì)量濃度為50 mg/L的模擬陽性樣本。另外20個作為陰性樣品，隨機(jī)編號為1#～40#，按照1.2中樣品前處理方法對40批次樣品進(jìn)行前處理后上機(jī)檢測。由表5可知，樣品未出現(xiàn)假陽性及假陰性結(jié)果，根據(jù)匹配度定性類別歸屬即能判定其母核結(jié)構(gòu)。

表5 模擬陽性樣品中那非類藥物篩查

續(xù)表5

3 結(jié)論

(1) 基于SERS技術(shù)構(gòu)建了保健酒中可能非法添加那非類藥物的拉曼光譜譜圖庫以及配套的數(shù)據(jù)庫檢索方式，建立了保健酒中非法添加那非類藥物非靶向篩查技術(shù)。

(3) 對于SERS基底的性能評價采取目測評價、紫外光譜表征以及靈敏度測試。結(jié)果表明，那非類藥物膠體金SERS基底最佳制備方式為98.3 mL超純水中加入1.0 mL 1%氯金酸和0.7 mL 1%檸檬酸三鈉。關(guān)于那非類藥物數(shù)據(jù)庫的建立及檢索是基于OMIC軟件，以匹配度是否高于70%作為評判是否疑似添加那非類化學(xué)藥品的依據(jù)。

(3) 為了更深層次地弄清非法添加那非類藥物的歸屬，試驗(yàn)基于Python軟件對78種那非類藥物進(jìn)行了聚類分析，最后選取4類那非類藥物中具有代表性的化合物進(jìn)行方法的最低檢出質(zhì)量濃度研究，結(jié)果：西地那非0.05 mg/L、他達(dá)那非0.5 mg/L、硫代西地那非0.05 mg/L、乙酰伐地那非0.1 mg/L。通過模擬實(shí)際樣品對方法進(jìn)行特異性考察試驗(yàn)，結(jié)果未出現(xiàn)假陽性及假陰性，說明建立的非靶向篩查技術(shù)能有效的篩查出保健酒中的那非類非法添加物。