小柴胡湯對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的虎龍雜交石斑魚肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

鄒翠云，陳小晶，鄔穎欣，黃錦雄，譚小紅，胡心月，甘松永，吳錦輝

1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動物科技學(xué)院/廣東省水環(huán)境與水產(chǎn)品安全工程技術(shù)研究中心/廣州市水產(chǎn)病害與水禽養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225

2. 廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 惠州 516081

目前，在集約化養(yǎng)殖條件下，養(yǎng)殖密度不斷增大，致使水產(chǎn)動物疾病頻繁發(fā)生。為了控制疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中會頻繁使用抗生素和化學(xué)藥物[1-2]。濫用化學(xué)藥物常會導(dǎo)致魚類肝臟疾病的發(fā)生，使其細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)體積增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、囊泡化，發(fā)生脂質(zhì)過氧化從而導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷[3]。還會使魚類血清中總膽固醇 (TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST) 顯著升高，肝臟中總抗氧化能力 (T-AOC)、過氧化氫酶 (CAT) 和還原型谷胱甘肽 (GSH) 顯著降低，肝臟和鰓中丙二醛 (MDA) 顯著升高，引起魚類氧化應(yīng)激，損傷其抗氧化防御系統(tǒng)[4-5]。此外，水體中重金屬及微量營養(yǎng)元素過量也會損壞魚類肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶活性，使肝臟組織發(fā)生病理性變化，給魚類帶來一系列不良影響，對漁業(yè)造成嚴(yán)重的危害[6-9]。

目前，有很多藥物可以誘導(dǎo)建立動物肝損傷模型，但是一些重復(fù)性高、模擬性好的藥物，毒性一般較大，建模結(jié)果多不穩(wěn)定。用D-氨基半乳糖建模具有毒性小、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，但用于誘導(dǎo)動物肝損傷模型用量較大，且建立的模型不穩(wěn)定[10]。D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖 (D-GalN/LPS) 誘導(dǎo)的肝損傷與臨床病毒性肝炎非常相似，會引發(fā)大量的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡[11]。因此，這一模型被廣泛應(yīng)用于肝損傷病理生理學(xué)機(jī)制研究，評估保肝護(hù)肝藥物的生物學(xué)活性。

魚類飼料中添加不同濃度的復(fù)方中草藥，可以顯著增強(qiáng)免疫功能[12-13]。小柴胡湯是我國重要的復(fù)方中草藥，由柴胡 (Bupleurum chinense)、黃芩(Scutellaria baicalensis)、甘草 (Glycyrrhiza uralensis)、人參 (Panax ginseng)、半夏 (Pinellia ternate)、生姜(Zingiber ofcinale) 和大棗 (Ziziphus jujube) 等 7味藥組成，其中柴胡和黃芩是配伍中的君藥，在小柴胡湯原方中，柴胡含量最高，占了將近2/3的量，其次為黃芩[14]。小柴胡湯因?qū)β愿窝子携熜铱捎行ьA(yù)防肝硬化患者向肝癌發(fā)展而引起了極大的關(guān)注[15]。此外，多項(xiàng)動物模型或細(xì)胞模型的研究表明，小柴胡湯及其成分對實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有細(xì)胞保護(hù)效果，對慢性肝炎有抗炎作用，通過抑制肝星狀細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化具有預(yù)防和治療效果，可改善肝細(xì)胞中的脂質(zhì)過氧化[16]。小柴胡湯有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化及提高免疫功能等多種生物效應(yīng)，因此作為保肝護(hù)肝的中草藥在國內(nèi)外廣泛使用[17]。先前養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)研究表明，小柴胡湯對DGalN/LPS誘導(dǎo)的石斑魚化學(xué)性肝損傷有明顯的保護(hù)作用[18]，但尚未有細(xì)胞水平機(jī)制的報(bào)道。本文主要在細(xì)胞水平上探討了小柴胡湯對D-GalN/LPS引起的肝損傷和氧化損傷的保護(hù)作用，以為魚類保肝藥物研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎龍雜交石斑魚 (Epinephelus lanceolatus♂×E. fuscoguttatus♀) 健康個(gè)體由廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量約30～50 g，平均體長12～15 cm，室溫下，在循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)15 d，再用于實(shí)驗(yàn)。MEM培養(yǎng)基 (HyClone)、PBS、鏈霉素/青霉素 (Streptomycin/Penicillin)、0.25%胰蛋白酶和0.5%臺盼藍(lán)購于SIGMA公司 (美國)；新鮮胎牛血清 (FBS) 購于GIBCO公司 (美國)；CCK-8購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞處理

虎龍雜交石斑魚原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)后進(jìn)行傳代，將細(xì)胞置于25 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù))二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中，用含10% (體積分?jǐn)?shù)) 血清和1% (體積分?jǐn)?shù)) 雙抗的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長到 80%～90% 時(shí)，加入 20 mmol·L—1的 D-氨基半乳糖 (D-GalN，上海源葉) 和 1 μg·mL—1的脂多糖(LPS，美國Sigma)，或是不同質(zhì)量濃度的小柴胡湯(0、100、200和 400 μg·mL—1) 孵育 24 h。實(shí)驗(yàn)分為5組：對照組 (肝細(xì)胞培養(yǎng)基中既不加小柴胡湯也不加D-GalN/LPS)，模型組 (肝細(xì)胞培養(yǎng)基中只加入D-GalN/LPS孵育24 h)，以及小柴胡湯前處理組(細(xì)胞培養(yǎng)基中先加入 100、200和 400 μg·mL—1小柴胡湯孵育24 h，再加入D-GalN/LPS孵育24 h，分別標(biāo)為100-XD、200-XD、400-XD組)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞沉淀，進(jìn)行生化指標(biāo)檢測和總RNA提取。

1.3 樣本檢測

1.3.1 CCK-8法檢測肝細(xì)胞的增殖

將細(xì)胞重懸后接種于96孔板，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)，置于5% CO2、25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。用CCK-8試劑進(jìn)行肝細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測，按照試劑盒上的步驟進(jìn)行。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度 (A450)，細(xì)胞增殖計(jì)算公式：細(xì)胞成活率 = 實(shí)驗(yàn)組A450/對照組A450×100%。

1.3.2 肝細(xì)胞形態(tài)

將 500 μL 細(xì)胞懸液 (約 2×104個(gè)細(xì)胞) 滴種在6孔板爬片上，約4 h細(xì)胞貼壁后，輕輕補(bǔ)加1.5 mL培養(yǎng)基，置于25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，讓細(xì)胞貼在爬片上良好生長。加小柴胡湯處理后進(jìn)行固定，將細(xì)胞進(jìn)行HE染色，用中性樹脂封片，用倒置顯微鏡 (MshOt MS60) 觀察細(xì)胞形態(tài)(200×)，每組3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 細(xì)胞炎癥因子檢測

加入不同濃度小柴胡湯和D-GalN/LPS處理后，收集細(xì)胞上清液。用南京建成的ELISA試劑盒進(jìn)行INF-γ、COX-2和PGE2細(xì)胞因子的檢測。檢測方法按照試劑盒的步驟進(jìn)行。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)肝功能指標(biāo)檢測

將肝細(xì)胞與小柴胡湯 (100、200或 400 μg·mL—1)或D-GalN/LPS孵育24 h，收集細(xì)胞沉淀，進(jìn)行低溫超聲波破碎儀處理，然后用4 ℃低溫離心機(jī)12 000 r·min—1離心5 min。取上清液按試劑盒步驟檢測細(xì)胞內(nèi)AST、ALT和乳酸脫氫酶 (LDH) 活性。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

將肝細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，然后加入不同質(zhì)量濃度的小柴胡湯或D-GalN/LPS孵育24 h后。用VAPC/7AAD凋亡試劑盒 (MULTI SCIENCES，上海)檢測肝細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞加入藥物處理結(jié)束后，收集細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷PBS離心洗 3次，棄上清。細(xì)胞在28 ℃下共染色15 min，置于冰上孵育15 min。細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞儀 (BD, FACSCalibur, NY, USA) 檢測，數(shù)據(jù)通過CELLQUESTPRO軟件 (BD) 進(jìn)行分析。

1.3.6 總 RNA 的提取和基因的表達(dá)分析

肝細(xì)胞總RNA 提取采用TRIzol裂解法。RNA完整性采用1.5%變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，RNA濃度和純度采用核酸分析儀測定OD260/OD280的比值進(jìn)行確定。合成cDNA后于—20 ℃保存?zhèn)溆?。通過熒光定量PCR方法測定相對mRNA表達(dá)水平。內(nèi)參引物及基因特異引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海杰瑞生物技術(shù)有限公司合成(表1)[19]。

表1 本研究所用相關(guān)的引物序列Table 1 Primer sequence of related genes in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 小柴胡湯對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞增殖測定結(jié)果見圖1。D-GalN/LPS損傷后，肝細(xì)胞成活率顯著下降 (P＜0.05)，為(82.54±3.67)%；而小柴胡湯干預(yù)組的肝細(xì)胞成活率明顯上升，100-XD、200-XD和400-XD前處理組肝細(xì)胞的成活率分別為 (91.35±2.02)%、(96.38±4.67)% 和(89.18±4.39)%，與模型組相比，肝細(xì)胞的成活率有不同程度的提高 (P＜0.05)。

圖1 小柴胡湯改善D-GalN/LPS誘導(dǎo)的虎龍雜交石斑魚肝細(xì)胞損傷的成活率注：不同小寫字母表示差異顯著 (P＜0.05)；圖 3、圖 4、圖 5-f、圖 6 同此。Fig. 1 Hepatocyte viability of D-GalN/LPS-induced hepatocyte injury in hybrid grouper by Xiaochaihu DecoctionNote: Different small letters indicate significant difference (P＜0.05); the same case in Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5-f and Fig. 6.

2.2 小柴胡湯對肝細(xì)胞形態(tài)的保護(hù)作用

經(jīng)小柴胡湯處理后，肝細(xì)胞HE染色結(jié)果見圖2。對照組肝細(xì)胞形成致密的單層，細(xì)胞形態(tài)為長梭形，細(xì)胞核呈橢圓形，細(xì)胞排列整齊、界限清晰；模型組肝細(xì)胞有明顯的損傷，細(xì)胞腫脹，邊界模糊，排列不規(guī)則，部分細(xì)胞破裂；100-XD和200-XD組肝細(xì)胞生長態(tài)勢好，細(xì)胞生長致密，排列規(guī)則，細(xì)胞核清晰可見；而400-XD前處理組肝細(xì)胞又呈現(xiàn)明顯的損傷現(xiàn)象，細(xì)胞破裂，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙增大且疏松。

圖2 小柴胡湯對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞形態(tài)的影響注：a. 對照組；b. 模型組；c. 100-XD；d. 200-XD；e. 400-XD；圖5-a—5-e同此。Fig. 2 Effect of Xiaochaihu Decoction on morphology of D-GalN/LPS-treated hepatocytesNote: a. Control; b. Model; c. 100-XD; d. 200-XD; e. 400-XD; the same case in Fig. 5-a-5-e.

2.3 小柴胡湯對細(xì)胞上清液中INF-γ、COX-2和PGE2的影響

圖3結(jié)果顯示，D-GalN/LPS會導(dǎo)致肝細(xì)胞產(chǎn)生炎癥。與對照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中干擾素-γ (INF-γ)、環(huán)氧合酶-2 (COX-2)和前列腺素E2 (PGE2) 質(zhì)量濃度顯著上升，分別為原來的1.7、1.6和1.5倍；與模型組相比，小柴胡湯前處理各濃度組對肝細(xì)胞均有保護(hù)作用，INF-γ、COX-2和PGE2質(zhì)量濃度顯著下降。

圖3 小柴胡湯對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的上清液中細(xì)胞因子的炎癥反應(yīng)Fig. 3 Effect of Xiaochaihu Decoction on D-GalN/LPS-induced inflammatory responses in hepatocytes

2.4 小柴胡湯對肝細(xì)胞中LDH、ALT和AST的影響

圖4顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞裂解后上清液中LDH、ALT和AST活性顯著上升，分別為原來的2.0、1.9和1.8倍，表明建模成功。相對于D-GalN/LPS組，小柴胡湯前處理組明顯抑制了LDH、ALT和AST活性升高，且呈劑量依賴性。

圖4 小柴胡湯對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)肝功能指標(biāo)的影響Fig. 4 Effect of Xiaochaihu Decoction on D-GalN/LPS-induced liver function index in hepatocytes

2.5 小柴胡湯對肝細(xì)胞凋亡的影響

對細(xì)胞進(jìn)行雙染，然后用流式細(xì)胞儀檢測原代肝細(xì)胞凋亡率 (圖5)。結(jié)果顯示，模型組中細(xì)胞凋亡率 (UR+LR：晚期凋亡及壞死細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞) 為 (24.10±0.96)%，顯著高于對照組 [(4.37±0.35)%,P＜0.05)]。然而，與模型組相比，100-XD、200-XD和400-XD前處理組的細(xì)胞凋亡率顯著下降 (P＜0.05)，分別為 (16.60±0.23)%、(10.65±0.17)%和 (17.85±1.20)%。

圖5 小柴胡湯降低D-GalN/LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡注：f. 細(xì)胞凋亡率 (UR+LR)：將肝細(xì)胞進(jìn)行 Annexin V-APC/7AAD 雙染后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。Fig. 5 D-GalN/LPS-induced apoptosis reduced by Xiaochaihu DecoctionNote: f. Apoptotic cell ratio (Percentage of cells in quadrants UR and LR): The cells were double stained with Annexin V-APC/7AAD, and the apoptosis rate was determined using fow cytometry.

2.6 免疫和凋亡相關(guān)基因表達(dá)

小柴胡湯對虎龍雜交石斑魚原代培養(yǎng)肝細(xì)胞免疫和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響見圖6。D-GalN/LPS處理使得模型組肝細(xì)胞抑制蛋白κBα (IKKα) mRNA的表達(dá)量顯著升高，為對照組的2.6倍 (P＜0.05)；較低濃度小柴胡湯處理對IKKα的表達(dá)均有抑制作用，根據(jù)圖6，與對照組相比，小柴胡湯濃度升高刺激了IKKα mRNA表達(dá)量上升；與模型組相比，100-XD和200-XD組IKKα的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，而400-XD組則無顯著差異 (P＞0.05)。小柴胡添加組中的Toll 樣受體 3 (TLR3) mRNA表達(dá)量與模型組差異顯著 (P＜0.05)。谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx) 在所有組中均無顯著差異 (P＞0.05)。與對照組相比，D-GalN/LPS處理使得模型組caspase-3、caspase-9和P53 mRNA的表達(dá)量顯著上升，分別為原來的4.1、3.3和3.9倍 (P＜0.05)；不同濃度的小柴胡湯對caspase-3、caspase-9和P53的表達(dá)量有不同的作用，隨小柴胡湯濃度的升高而上升，盡管100-XD和200-XD組間無顯著差異，但與模型組相比，100-XD和200-XD組的表達(dá)量顯著降低，而400-XD組則顯著升高 (P＜0.05)。

圖6 小柴胡湯對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞免疫和凋亡相關(guān)基因的影響Fig. 6 Effect of Xiaochaihu Decoction on D-GalN/LPS-induced hepatocytes mRNA expression of immune and apoptosis genes

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，包括呋喃唑酮、氯霉素和鏈霉素等抗生素、孔雀石綠和磺胺類藥物等化學(xué)藥物，是導(dǎo)致水產(chǎn)動物肝臟疾病發(fā)生的一個(gè)重要因素[20-22]。魚類的肝臟疾病已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。近年來，小柴胡湯在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，并被應(yīng)用于多個(gè)新領(lǐng)域且取得一定進(jìn)展[23-24]。然而，有關(guān)小柴胡湯對水產(chǎn)動物抗肝損傷方面的研究報(bào)道卻很少。本文通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討了小柴胡湯對虎龍雜交石斑魚由D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明，通過小柴胡湯對石斑魚肝細(xì)胞的預(yù)處理，可減輕D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝毒性，在生化和病理特征上也有顯著改善。

小柴胡湯被成功用于治療各種因素誘導(dǎo)的肝臟疾病。但其包括肝毒性等副作用，是限制其治療肝損傷功效的主要因素。因此，采取安全有效的治療措施減輕化學(xué)藥物誘導(dǎo)的肝損傷非常有益。前期研究表明，適量的小柴胡湯對肝細(xì)胞沒有毒性[18]，但長期過量服用小柴胡湯或其他中草藥制劑會增加肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)[25]。研究表明，中草藥未超劑量使用無毒副作用，但長期大劑量服用，則會對肝臟、腎臟和血液系統(tǒng)產(chǎn)生毒性[26-27]。因此應(yīng)慎重選擇劑量范圍。本研究使用虎龍雜交石斑魚原代肝細(xì)胞證明了小柴胡湯對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著小柴胡湯濃度的增加，經(jīng)D-GalN/LPS 誘導(dǎo)損傷的肝細(xì)胞成活率升高，但繼續(xù)提高小柴胡湯的濃度會對肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致細(xì)胞成活率顯著下降，說明適量的小柴胡湯才對肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。通過肝細(xì)胞形態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)D-GalN/LPS誘導(dǎo)后，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病理變化，包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、大量的空泡和細(xì)胞核消失等，而經(jīng)小柴胡湯前處理，細(xì)胞損傷有明顯改善。

D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝炎是人類和其他哺乳動物肝臟損傷的公認(rèn)模型[28]。該模型已廣泛應(yīng)用于肝損傷病理生理的分子機(jī)制研究，評價(jià)保肝護(hù)肝藥物的生物學(xué)活性[29]。D-GalN是一種肝臟特異性毒素，可選擇性地消耗尿苷核苷酸，然后抑制肝細(xì)胞中的 mRNA 和蛋白質(zhì)合成，使LPS的毒性作用增強(qiáng)，并在幾小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致爆發(fā)性肝衰竭[11]。INF-γ可活化免疫細(xì)胞，具有抗病毒、抗腫瘤以及提高免疫功能等特性。COX-2的高表達(dá)也與炎性疾病的病理生理學(xué)有關(guān)[30]。在內(nèi)毒素、脂多糖、炎性細(xì)胞因子等刺激下，會誘導(dǎo)炎癥發(fā)生、細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致免疫抑制、腫瘤發(fā)生等。PGE2是人體中最豐富的前列腺素亞型，屬于前列腺素家族成員。當(dāng)細(xì)胞膜受到刺激時(shí)，在環(huán)氧合酶 (COX) 及前列腺素H2合酶的聯(lián)合作用下生成 PGE2，從而促進(jìn)炎癥發(fā)生。本研究中，對肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液分析顯示，小柴胡湯降低了D-GalN/LPS誘導(dǎo)的INF-γ、COX-2 和PGE2濃度，表明小柴胡湯顯著抑制了D-GalN/LPS誘導(dǎo)的虎龍雜交石斑魚肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。同時(shí)D-GalN/LPS 會誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜滲透性變化，使肝酶從細(xì)胞中滲漏出來。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)收集細(xì)胞沉淀后，D-GalN/LPS誘導(dǎo)導(dǎo)致肝細(xì)胞中LDH、ALT 和AST活性升高，表明肝細(xì)胞有損傷。經(jīng)小柴胡湯前處理，則抑制了D-GalN/LPS 誘導(dǎo)的AST和ALT活性升高，恢復(fù)了肝細(xì)胞的功能。

綜上所述，小柴胡湯對D-GalN/LPS 誘導(dǎo)的化學(xué)性肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，可能與其促進(jìn)抗氧化系統(tǒng)、抑制細(xì)胞外誘發(fā)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。這些結(jié)果有助于更好地了解化學(xué)性肝損傷的調(diào)控機(jī)制，為魚類保肝藥物研究提供了新思路。