呂 葉，英葉霞，楊文靜，厚玉瑾，袁春秀，曹相玫

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，寧夏 銀川 750002；

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，寧夏 銀川 750002

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因［1］。外泌體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的信息交流，促進(jìn)細(xì)胞因子、生長因子和血管生成因子的分泌，誘導(dǎo)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移［2］。外泌體是由多囊泡體與細(xì)胞中的質(zhì)膜融合后釋放的直徑為40～140 nm的雙層膜納米囊泡［3］。釋放到微環(huán)境中的外泌體，通過參與細(xì)胞間的通信而發(fā)揮功能［4］。例如，胃癌源性外泌體攜帶的蛋白質(zhì)和miRNA在腫瘤增殖和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］；腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）分泌的外泌體對腫瘤細(xì)胞有重新編程的作用，CSC微環(huán)境中的其他細(xì)胞同樣可以通過外泌體使腫瘤細(xì)胞向CSC轉(zhuǎn)化［6］。我們的前期研究［7］發(fā)現(xiàn)，DZNep能夠抑制癌細(xì)胞生長和侵襲，但其對乳腺癌外泌體形成的影響還尚不清楚。

DZNep作為1個(gè)全新的靶向癌癥表觀遺傳學(xué)過程的染色質(zhì)修飾藥物，通過組蛋白修飾和miRNA等多種途徑抑制腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其抗腫瘤作用日益受到關(guān)注［8］。DZNep是一種S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑［8］，作為首次發(fā)現(xiàn)的EZH2酶活性抑制劑，它能夠降低EZH2的蛋白表達(dá)水平，阻斷EZH2介導(dǎo)的甲基化作用［9］。EZH2常作為惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移抑制研究中的重要靶點(diǎn)，其是多梳抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）最關(guān)鍵的核心成員［10］，為靶向組蛋白H3在H3K27甲基化中的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶［10］，在前列腺癌、乳腺癌和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）等腫瘤中呈高表達(dá)［11］，參與調(diào)節(jié)控制細(xì)胞周期、DNA修復(fù)和細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄，在組織特異性干細(xì)胞維持和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］，能夠減弱腫瘤抑制基因的表達(dá)，導(dǎo)致惡性信號通路被激活，包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和Wnt/β-catenin通路［11-12］。DZNep對癌細(xì)胞的作用相對特定于EZH2［13］，可能通過抑制EZH2發(fā)揮抗腫瘤作用［13-15］，因此從乳腺癌外泌體形成的角度分析其影響腫瘤演進(jìn)的潛在機(jī)制具有重要意義。本研究首先觀察DZNep對乳腺癌源性外泌體的影響，并深入探討DZNep改變?nèi)橄侔┪h(huán)境的作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、EZH2小分子抑制劑DZNep NSC617989購自美國Selleck Chemicals公司，anti-CD9抗體ab92726、anti-CD63抗體ab216136和anti-TSG101抗體ab125011購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin G，IgG）（H+L）A0208、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）A0216、Western及IP細(xì)胞裂解液P0013、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）ST505購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Pierce二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）protein assay kit 23225、PageRulerTM prestained protein ladder 26617購自美國Thermo Fisher Scientific公司，LumiBest卓越型電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）液SB-WB011購自上海圣爾生物科技有限公司，多功能酶標(biāo)儀Spark10M購自瑞士Tecan公司，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀EPS-600、微型垂直電泳槽VE-180和轉(zhuǎn)移電泳槽VE-186購自上海天能科技有限公司，超凈臺SW-CI-1F購自蘇州凈化科技有限公司，普通碳支持膜BZ11022A購自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司，低速離心機(jī)Cence購自湘潭湘儀儀器有限公司，超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子型號為P50AT2（Himac CP80WX，日本Hitachi公司），透射電子顯微鏡G2spititi（Tecnai Spirit 120 kV）購自美國FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫在線分析

通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫和在線分析軟件GEPIA2分析EZH2在乳腺癌中的表達(dá)，使用腫瘤免疫估計(jì)資源（Tumor Immunity Estimation Resources，TIMER）分析EZH2與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系。

1.2.2 納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）檢測

采用差速超速離心法提取外泌體，采用NTA技術(shù)追蹤和分析外泌體的布朗運(yùn)動：用0.025%的TEA和0.004 g/mL的NaOH混合溶液作為溶劑，稀釋樣本濃度為1/200，監(jiān)測樣本顆粒運(yùn)動情況，每個(gè)樣品監(jiān)測60 s，重復(fù)3次。結(jié)合Stokes-Einstein方程式計(jì)算出外泌體顆粒的流體力學(xué)直徑和濃度［16］。

1.2.3 透射電鏡檢測

將15 μL的外泌體樣本于銅網(wǎng)上靜置1 min，用濾紙將外泌體樣本吸干，取15 μL 2%的醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min，然后于燈下烤10 min，用透射電鏡觀察拍攝。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

應(yīng)用BCA工作液進(jìn)行蛋白濃度測定，用多功能酶標(biāo)儀測定A562的吸光度（D），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品的蛋白濃度。

試驗(yàn)分組為外泌體上清組和DZNep處理組，將等量蛋白（40 μg/10 μL）上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（8%），濕轉(zhuǎn)電泳轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜（0.45 μm孔徑）上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用含有3%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和0.02%的疊氮化鈉的1×含有吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（tris-buffered saline Tween，TBST）稀釋一抗（PCL2 1∶200，GADPH 1∶1 000），4 ℃溫育過夜，二抗（山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG 1∶2 000）室溫溫育1 h，ECL試劑顯色1 min，曝光并進(jìn)行灰度測量［17］。

2 結(jié)果

2.1 DZNep改變?nèi)橄侔┰葱酝饷隗w顆粒的濃度和直徑

外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63和TSG101的相對分子質(zhì)量分別為25×103、26×103和44×103，NC組和DZNep組細(xì)胞的培養(yǎng)基上清顆粒均可檢出上述蛋白表達(dá)，提示該培養(yǎng)基上清顆粒為外泌體。應(yīng)用納米顆粒追蹤分析外泌體粒徑、分布表征，結(jié)果顯示，外泌體顆粒基本處于30～200 nm的分布范圍，NC組檢測濃度為2.7×107個(gè)/ mL，粒徑峰值為180.5 nm，實(shí)測平均粒徑大小為185.8 nm；DZNep組外泌體顆粒檢測濃度為3.3×107個(gè)/mL，粒徑峰值為161.4 nm，實(shí)測平均粒徑大小為162.6 nm，提示DZNep干預(yù)后外泌體濃度降低、體積變小。透射電鏡觀察顯示，外泌體是具有獨(dú)特性質(zhì)的小囊泡，直徑50～100 nm，雙脂質(zhì)層的密度為1.12～1.19 g/mL。觀察可見，與對照組相比，DZNep組外泌體數(shù)量減少、體積變?。▓D1）。

圖1 DZNep處理前后乳腺癌源性外泌體的變化Fig.1 Changes of Exosomes in Breast Cancer before and after DZNep Treatment

2.2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析EZH2的表達(dá)及與乳腺癌腫瘤微環(huán)境和EMT的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫檢測分析發(fā)現(xiàn)，EZH2在乳腺癌中表達(dá)可見，EZH2在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織（圖2A）。韋恩圖顯示腫瘤微環(huán)境成分，當(dāng)EZH2上調(diào)表達(dá)時(shí)，UP顯示是免疫細(xì)胞（藍(lán)色）在Luminal B型乳腺癌（BRCA-Luminal B）、GBM等腫瘤中含量增多，基質(zhì)細(xì)胞（橙色）在結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）等腫瘤中增多，其中交集表示免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均增多的腫瘤類型，包括Luminal A型乳腺癌（BRCA-Luminal A）；同樣，DOWN顯示各腫瘤類型免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞減少的分組。該結(jié)果提示EZH2高表達(dá)與免疫細(xì)胞上調(diào)呈正相關(guān)，與BRCA-Luminal A免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞上調(diào)均呈正相關(guān)，EZH2高表達(dá)會改變?nèi)橄侔┙M織的腫瘤微環(huán)境（圖2B）。與EMT相關(guān)的分子表達(dá)關(guān)系顯示，EZH2高表達(dá)與乳腺癌E-cadherin、N-cadherin、vimentin表達(dá)呈正相關(guān)，與BRCA-Luminal B型E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)、N-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與BRCA-Luminal A型N-cadherin表達(dá)、vimentin表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05，圖2C）。

圖2 EZH2在多種腫瘤中的表達(dá)分析與比較Fig.2 Analysis and comparison of EZH2 expression in various tumors

2.3 DZNep下調(diào)EZH2，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

DZNep是EZH2抑制劑，本研究顯示，5 μmol DZNep處理24 h能夠明顯抑制EZH2表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)錄因子ZEB1/ZEB2和N-cadherin的表達(dá)。DZNep處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后，EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)增加，vimentin表達(dá)降低，提示DZNep能夠調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)（圖3）。

圖3 EZH2與EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Expression of EZH2 and EMT-related proteins

2.4 DZNep改變細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá)

細(xì)胞間連接是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分之一，細(xì)胞間連接蛋白表達(dá)異常與腫瘤EMT過程相關(guān)。本研究顯示，DZNep干預(yù)后，閉合蛋白（occludin）及閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、層粘連蛋白（laminin）、水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）、連接子蛋白43（connexin 43）的表達(dá)均明顯降低；封閉蛋白5（claudin 5，CLDN5）和Ⅵ型膠原蛋白（collagen Ⅵ）表達(dá)明顯增加（圖4）。

圖4 DZNep作用下，細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Expression of intercellular junction proteins in response to DZNep

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球乳腺癌新發(fā)病例約210萬例，死亡約63萬例，其危害在女性惡性腫瘤中居首位［1］。外科手術(shù)、放療、化療及靶向治療等是乳腺癌臨床治療的主要方式，采用乳腺X射線、乳腺磁共振成像、乳腺超聲及生物標(biāo)志物等篩查方式有助于乳腺癌的早期診斷［18］。但迄今為止，乳腺癌患者的預(yù)后并不樂觀，仍需探索新的治療策略。

腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)含有與細(xì)胞來源相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)，可以傳遞mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA及蛋白質(zhì)等進(jìn)入受體細(xì)胞，參與細(xì)胞間通訊、腫瘤微環(huán)境的調(diào)控，這些研究將為腫瘤的診斷和治療提供新的思路［19］。腫瘤外泌體是腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境信息交流最重要的工具。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞能夠分泌出更多的外泌體，招募和馴化其周圍的基質(zhì)細(xì)胞，引起相應(yīng)基質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，隨后產(chǎn)生大量的生長因子、細(xì)胞趨化因子和基質(zhì)降解酶，引起腫瘤微環(huán)境發(fā)生基質(zhì)重組、免疫抑制及腫瘤血管生成等變化［20］。本研究首先提取乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的外泌體，結(jié)果顯示，經(jīng)DZNep處理后外泌體粒徑明顯減小且數(shù)量下降，推測DZNep能夠減少乳腺癌源性外泌體生成，調(diào)控腫瘤微環(huán)境。

DZNep是3-去氮腺苷的環(huán)戊醇類似物，可抑制甲硫氨酸循環(huán)的成員S-腺苷高半胱氨酸水解酶的活性，逆轉(zhuǎn)S-腺苷高半胱氨酸水解為腺苷和高半胱氨酸［6］，引起細(xì)胞內(nèi)S-腺苷高半胱氨酸的積聚，抑制S-腺苷蛋氨酸依賴的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的活化［7］。在肺癌細(xì)胞的死亡過程中，DZNep靶向調(diào)節(jié)多個(gè)HMTases從而抑制肺癌細(xì)胞的生長［21］，通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的生長和存活［22］。

作為EZH2的抑制劑，DZNep通過降低EZH2蛋白的表達(dá)水平，激活PRC2靶基因，靶向調(diào)控H3K27me3組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的降解，并特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制食管鱗癌、結(jié)直腸癌和肺癌的增殖［7］，并通過抑制EZH2的表達(dá)從而使絲氨酸高度磷酸化，減少結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移［22］。臨床研究顯示，評價(jià)EZH2靶向藥物（包括DZNep）的臨床試驗(yàn)應(yīng)考慮根據(jù)TP53基因組的狀態(tài)對腫瘤患者進(jìn)行分層［23］。EZH2基因定位于7號染色體長臂3區(qū)5帶，含有20個(gè)表達(dá)序列，具有組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性［24］。EZH2蛋白功能區(qū)主要集中在N端和C端，包括H1、H2、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（cysteine-rich domain，CRD）及SET結(jié)構(gòu)域復(fù)合體，CRD和SET結(jié)構(gòu)域在酶的催化反應(yīng)中有重要作用［25］。在EZH2的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了與缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α相互作用的保守HRE序列，HIF-1α與該HRE區(qū)域結(jié)合以激活EZH2轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)乳腺癌生長［26］。最近有研究［27］顯示，EZH2可促進(jìn)腫瘤來源外泌體miRNA表達(dá)量的升高，誘導(dǎo)EMT促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移。本研究應(yīng)用數(shù)據(jù)庫資料分析可知，EZH2在乳腺癌癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，與乳腺癌免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞上調(diào)相關(guān)，與乳腺癌EMT現(xiàn)象相關(guān)。

EMT與腫瘤的起始、腫瘤干性、腫瘤轉(zhuǎn)移及耐藥等多種惡性行為密切相關(guān)［28］。甲狀腺癌、胰腺癌等來源的CSC可以通過分泌外泌體作用于受體細(xì)胞，使受體細(xì)胞獲得EMT能力［6］。腫瘤微環(huán)境的改變是腫瘤轉(zhuǎn)移重要的背景因素，這個(gè)過程通常伴隨著EMT現(xiàn)象的發(fā)生［29］。EMT期間，上皮細(xì)胞間連接蛋白下調(diào)，從而分解黏附連接、橋粒和緊密連接，促使頂端-基底極性喪失，細(xì)胞間黏附被破壞，使得腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，為腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件［30］。發(fā)生EMT時(shí)，細(xì)胞通常會高表達(dá)參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解的相關(guān)蛋白，破壞原有組織學(xué)屏障，便于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移［30］。EZH2能夠通過調(diào)節(jié)E-cadherin改變膠質(zhì)瘤分化和侵襲等生物學(xué)行為［31］；DZNep可通過激活抑癌miRNA發(fā)揮多種抗癌作用，也可以抑制EZH2與miR-1246、miR-302a和miR-4448的啟動子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)一步抑制雙特異性酪氨酸（Y）磷酸化調(diào)控激酶1A［dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1A，DYRKLA］、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、B細(xì)胞特異性莫洛氏鼠白血病病毒插入位點(diǎn)1（B-cellspecific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI-1）和微絲附著梁蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和抑制細(xì)胞遷移［32］。本研究顯示，DZNep能夠通過抑制EZH2來抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的EMT現(xiàn)象。

抑制EZH2可改善腎小管細(xì)胞黏附和連接損傷［33］。乳腺瘤來源的外泌體含有的miR-105可以下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，直接影響內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接，增加腫瘤血管的通透性［34］。Occludin和ZO-1是緊密連接的主要組成成分，它們與腫瘤細(xì)胞的分化程度、浸潤深度、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及進(jìn)展情況明顯相關(guān)［35］。Laminin是基底膜所特有的非膠原糖蛋白，能夠在細(xì)胞表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并將細(xì)胞固定在基底膜上。AQP4在維持水和離子平衡中起關(guān)鍵作用，在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織［36］。Connexin 43是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最豐富的間隙連接蛋白，與腫瘤的惡性生物學(xué)行為及惡性程度呈正相關(guān)［37］。CLDN5是Claudin家族的重要成員，在細(xì)胞間緊密連接的構(gòu)成和維持中發(fā)揮著重要作用，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的EMT現(xiàn)象，其表達(dá)丟失是細(xì)胞與細(xì)胞之間黏附能力降低的重要原因，低表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移［37］。本研究中DZNep干預(yù)后occludin、ZO-1、laminin、AQP4、connexin 43表達(dá)降低，CLDN5表達(dá)增加，提示DZNep能夠阻止細(xì)胞間黏附的破壞或降解，并改變其結(jié)構(gòu)。Collagen Ⅵ是細(xì)胞外基質(zhì)中主要的成分之一，癌細(xì)胞團(tuán)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）降解Collagen Ⅵ變成膠原肽，隨后在間質(zhì)中重新沉積形成線性膠原，增加癌巢周圍間質(zhì)張力，進(jìn)一步激活整聯(lián)蛋白，驅(qū)動黏著斑形成并增加黏著斑激酶活性，促進(jìn)癌細(xì)胞增生、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成［37］。當(dāng)癌細(xì)胞生長抑制時(shí)，MMP降解減少導(dǎo)致collagenⅥ累積增多［37］。本研究中DZNep干預(yù)后collagenⅥ表達(dá)增加。上述結(jié)果提示DZNep能夠改變?nèi)橄侔┘?xì)胞微環(huán)境，抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移。

綜上所述，DZNep通過抑制EZH2減少乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的外泌體生成，進(jìn)一步改變腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，從而影響EMT現(xiàn)象，具有成為乳腺癌靶點(diǎn)治療新藥物的潛能。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。