陳泰宇,唐學貴,蔣小東,唐詩宇,陳思敏,李敏
(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結合肛腸科,四川 南充 637001;2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科,四川 南充 637001;3. 川北醫(yī)學院,四川 南充 637100)
潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種炎癥性慢性腸病,臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等,具有長期遷延、反復發(fā)作的特點[1]。UC 發(fā)病機制復雜多樣,研究表明,免疫功能紊亂及炎癥反應是UC 發(fā)生發(fā)展關鍵因素之一。臨床主要采取對癥治療緩解UC 癥狀,且需長期服藥,目前臨床尚缺乏特異性治療措施[2]。硫氫化鈉(NaHS)是外源性氣體信號分子硫化氫(H2S)的供體,吸收入血后能迅速轉化成H2S,研究表明NaHS、H2S 具有抗炎、抗氧化應激作用[3]。梁慧潔等[4]、赫曼等[5]研究顯示,NaHS 可抑制UC 小鼠腸黏膜損傷,對腸組織有保護作用,但具體作用機制尚未明確。核因子E2 相關因子2/抗氧化反應元件(Nrf2/ARE)是一條與炎癥反應有關的信號通路,陳力等[6]研究顯示,促進Nrf2/ARE 信號通路活化能夠抑制炎癥反應,進而對UC 小鼠發(fā)揮保護作用。目前有關NaHS 對UC 的保護作用是否與調(diào)控Nrf2/ARE 信號通路有關少見報道,因此本研究基于Nrf2/ARE 信號通路探究NaHS 對UC 大鼠腸黏膜損傷的保護作用,以期為臨床探尋治療UC 的特異性方式提供一定理論依據(jù)。
SPF 級SD 雄性大鼠45 只,9 周 齡,體重180~210 g,平均(195±15)g,購自北京唯尚立德生物科技有限公司,實驗動物使用許可證號:SYXK(京)2021-0056,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2021-0010。
NaHS(純度≥98%)購自美國Sigma 公司,柳氮磺胺吡啶(SASP)(國藥準字H31020450)購自上海中西三維藥業(yè)有限公司,2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(純度≥98%,規(guī)格20 mg)購自成都普菲德生物技術有限公司,蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海一研生物科技有限公司,白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自滁州仕諾達生物科技有限公司,兔抗鼠Nrf2、ARE、β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體及山羊抗兔HRP 二抗均購自北京百普賽斯生物科技股份有限公司。Optima?XPN 超速離心機購自美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司,TENLIN-A型組織勻漿機購自江蘇天祥儀器有限公司。
1.3.1 UC 大鼠模型復制隨機選取10 只正常大鼠為對照組,另35 只大鼠進行模型復制[7]。TNBS 誘導的UC 大鼠模型復制方法:每日給予大鼠番瀉葉、腺嘌呤分階段灌胃,連續(xù)28 d,于第29 天禁食不禁水24 h,用5%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射大鼠,麻醉后將其固定,在液狀石蠟油潤滑作用下用16 號灌胃針頭從大鼠肛門經(jīng)腸道逆行輕柔插入距肛門約8 cm 處,按體重100 mg/kg 的TNBS 加入等體積的50%乙醇制成混合液,充分混勻后注入大鼠結腸內(nèi),10 只對照組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液灌腸,后推入3 mL 空氣;將大鼠提尾倒置3 min 后,使之平躺至自然清醒。模型復制期間觀察大鼠一般情況,模型復制結束后從模型大鼠中隨機選取5 只,從對照組大鼠中隨機選取2 只麻醉處死,取結腸組織進行形態(tài)及病理學觀察。模型復制成功大鼠可見皮毛稀疏無光澤,精神萎靡、慵懶,飲食減少,小便清長,大便溏泄且/或伴有黏液膿血便;結腸組織可見局部潰瘍灶、糜爛、充血、水腫等;光學顯微鏡下可見結腸組織炎癥細胞浸潤、黏膜層缺損、腺體減少、排列紊亂等病理改變。
1.3.2 實驗動物分組及處理模型復制過程中,3 只大鼠死亡,將剩余27 只模型復制成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組,每組9 只。陽性對照組于模型復制成功后第3 天給予柳氮磺胺吡啶(SASP)混懸溶液0.5 g/(kg·d)灌胃給藥[8];硫氫化鈉組大鼠于同時間腹腔注射1 mL 硫氫化鈉溶液(100 μmol/L,1 次/d,連續(xù)7 d)[9];模型組和對照組于同時間腹腔注射等量生理鹽水。模型復制期間觀察大鼠一般情況。
1.3.3 標本采集于末次給藥結束后,大鼠禁食12 h,麻醉,腹主動脈取血,離心10 min(3 000 r/min,離心半徑8 cm)取上清液,置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩H⊙Y束后將大鼠麻醉處死,距肛門8 cm 處取結腸組織, 進行結腸黏膜損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index, CMDI)評 分[10]:0 分(黏膜無損傷)、1 分(黏膜充血、水腫、無潰瘍)、2 分(黏膜充血、水腫、輕度糜爛及無潰瘍);3 分(黏膜充血、水腫、中度糜爛及有單個潰瘍);4 分(黏膜充血、水腫、高度糜爛及有多處潰瘍);5 分(黏膜充血、水腫、重度糜爛及有>1 cm 潰瘍);沿腸系膜緣剪開腸腔,用冰生理鹽水清洗腸內(nèi)容物,濾紙吸干,剪成兩部分,一部分于4%多聚甲醛中固定,乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜,連續(xù)切片(6 μm 厚),用于HE 染色,另一部分置于-80℃冰箱冷凍保存,用于Western blotting 檢測。
1.3.4 ELISA 法檢測各組大鼠血清炎癥因子水平取各組大鼠血清,分別采用ELISA 試劑盒檢測大鼠血清IL-8、TNF-α 水平。在酶標板上加入稀釋后的標準品50 μL+待測樣品50 μL+生物素標記的抗體50 μL。蓋上模板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1 h。甩去酶標板孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30 s,甩去洗滌液,用吸水紙拍干(共洗滌3 次)。每孔加入80 μL 的鏈霉親和素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30 s,甩去洗滌液,用吸水紙拍干(共洗滌3 次)。每孔加入底物A、B 各50 μL,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10 min(避光操作)。取出酶標板,迅速加入50 μL 終止液,立即在450 nm 波長處測定各孔的光密度值[11]。
1.3.5 HE 染色觀察大鼠結腸組織病理學變化取各組大鼠結腸組織切片,二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min 進行脫蠟處理,用梯度濃度乙醇100%、90%、80%、70%各處理5 min,自來水沖洗5 min,重復沖洗3 次。用蘇木精染色5 min(根據(jù)染色情況可以適當延長或縮短染色時間),結束后用流水沖洗。用伊紅染色1 min(根據(jù)染色情況可以適當延長或縮短染色時間),結束后用流水沖洗。用梯度濃度乙醇70%、80%、90%、100%各處理10 s,二甲苯處理1 min,自然晾干再封后滴上中性樹膠封片(用吸管滴上1 滴即可,盡量少滴,但壓片后要將組織全部覆蓋完,避免中間有氣泡)。光學顯微鏡觀察并采集圖片,使用Image-Pro Plus 6.0 軟件觀察大鼠結腸組織病理學變化[12]。
1.3.6 Western blotting 檢測大鼠結腸組織中Nrf2/ARE 信號通路蛋白水平的變化取各組大鼠結腸組織并制備勻漿,裂解,孵育20 min,離心10 min(3 000 r/min,離心半徑8 cm)取上清液,測定蛋白總量并取20 μg 與等量上樣緩沖液混勻,沸水浴變性,電泳、轉膜,以5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST 清洗,加入Nrf2、ARE 及內(nèi)參β-actin 作為一抗(1∶500),4℃孵育過夜,TBST 洗滌,加入山羊抗兔二抗(1∶1 000),37℃1.5 h,顯影、定影,以蛋白條帶灰度值計算目標基因蛋白相對表達量[13]。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較用方差分析,兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
對照組大鼠飲食、活動正常,精神狀態(tài)良好,皮毛光亮,大便成形,肛周未見異常分泌物;模型組大鼠飲食減少,出現(xiàn)神態(tài)萎靡、精神慵懶,皮毛暗黃,弓背蜷縮喜扎堆,小便清長,大便質軟,甚者稀溏,肛周見黏液膿血分泌物,部分大鼠出現(xiàn)腹部脹滿;與模型組大鼠比較,硫氫化鈉組及陽性對照組大鼠上述癥狀、體征有所改善。
對照組、模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組大鼠血清IL-8、TNF-α 水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與對照組比較,模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組IL-8、TNF-α 水平均升高(P<0.05),與模型組比較,陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠血清IL-8、TNF-α 水平均降低(P<0.05)。見表1。
表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 (±s)
表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 (±s)
注:①與對照組比較,P <0.05;②與模型組比較,P <0.05。
組別對照組模型組陽性對照組硫氫化鈉組F 值P 值TNF-α/(μg/L)86.73±13.09 135.77±20.37①106.50±15.98①②105.23±15.79①②12.802 0.000 n 8 9 9 9 IL-8/(ng/L)2.16±0.33 6.56±0.98①4.50±0.68①②4.53±0.69①②53.116 0.000
模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組大鼠結腸組織CMDI 評分分別為(4.87±0.73)分、(2.15±0.32)分、(2.08±0.35)分,3 組比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=90.186,P=0.000),與模型組比較,陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠結腸黏膜組織CMDI 評分降低(P<0.05)。
對照組大鼠結腸組織結構完整,腺體排列整齊,無炎癥細胞浸潤,未見水腫、充血、糜爛、潰瘍等情況;模型組大鼠結腸黏膜上皮缺損,腺體排列紊亂且減少,明顯可見黏膜水腫、充血,有大量炎癥細胞浸潤,有潰瘍灶形成;陽性對照組、硫氫化鈉組大鼠結腸組織黏膜上皮部分缺損,腺體排列尚規(guī)則,充血、水腫較輕,伴有少量炎癥細胞浸潤。見圖1。
圖1 各組大鼠結腸組織病理學變化 (HE×200)
對照組、模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組大鼠結腸組織Nrf2、ARE 蛋白相對表達量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與對照組比較,模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組Nrf2、ARE 蛋白相對表達量均降低(P<0.05),與模型組比較,陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠結腸組織Nrf2、ARE 蛋白相對表達量均升高(P<0.05)。見表2 和圖2。
圖2 各組大鼠結腸組織Nrf2/ARE信號通路蛋白表達
表2 各組大鼠結腸組織Nrf2/ARE信號通路蛋白相對表達量比較 (±s)
表2 各組大鼠結腸組織Nrf2/ARE信號通路蛋白相對表達量比較 (±s)
注:①與對照組比較,P <0.05;②與模型組比較,P <0.05。
組別對照組模型組陽性對照組硫氫化鈉組F 值P 值ARE蛋白1.09±0.16 0.30±0.06①0.75±0.12①②0.73±0.11①②66.078 0.000 n 8 9 9 9 Nrf2蛋白1.15±0.18 0.23±0.03①0.66±0.09①②0.68±0.11①②93.695 0.000
UC 是一種病因不明的炎癥性慢性腸病,具有慢性過程和反復發(fā)作的特征,發(fā)病機制尚未明確,目前臨床仍缺乏特異性治療手段。BERCIER 等[14]研究顯示,NaHS 能夠抑制炎癥反應進而抑制慢性結腸炎腸壁纖維化進展。本文探究NaHS 對UC 結腸損傷的影響,并分析其可能的機制,以期為臨床探尋有效治療UC 的特異性方法提供一定依據(jù)。
IL-8、TNF-α 是炎癥因子,參與機體的炎癥反應,與UC 密切相關[15]。本研究成功復制UC 大鼠模型,結果顯示,模型組大鼠飲食減少,出現(xiàn)神態(tài)萎靡、精神慵懶、皮毛暗黃、大便質軟、肛周見黏液膿血分泌物等癥狀,部分大鼠出現(xiàn)腹部脹滿等UC 典型癥狀。當以NaHS 干預后,上述癥狀有所改善,與對照組比較,模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組IL-8、TNF-α 水平均升高,與模型組比較,陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠血清IL-8、TNF-α 水平均降低,說明NaHS 可能減輕UC 大鼠炎癥反應,對結腸黏膜組織損傷發(fā)揮保護作用。CMDI 評分可用于評價腸黏膜損傷程度,評分越高,腸黏膜損傷越嚴重[16]。本研究結果顯示,NaHS 干預后,陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠結腸黏膜組織CMDI 評分較模型組降低,說明NaHS 可能減輕UC 大鼠炎癥反應,進而對大鼠結腸黏膜損傷發(fā)揮保護作用。
Nrf2/ARE 是一條與炎癥反應相關的信號通路,正常生理情況下,Nrf2 與受Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)結合形成異源二聚體,Nrf2 表達處于基礎水平,當受到氧化應激等各種刺激后,Nrf2 與Keap1 結合部位發(fā)生解離,進而使Nrf2 進入細胞核,與ARE 結合,抑制核內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生,最終抑制氧化應激炎癥損傷[17-18]。馬旭冉等[19]研究顯示,促進Nrf2 通路活化能夠有效抑制UC 大鼠結腸組織氧化應激反應進而抑制炎癥反應,對UC 大鼠結腸組織損傷發(fā)揮保護作用。本研究結果顯示,與對照組比較,模型組、陽性對照組及硫氫化鈉組Nrf2、ARE 蛋白相對表達量均降低,與模型組比較,陽性對照組和硫氫化鈉組大鼠結腸組織Nrf2、ARE 蛋白相對表達量均升高。說明NaHS 可能通過促進Nrf2/ARE 信號通路活化抑制炎癥反應,進而對UC 大鼠結腸黏膜損傷發(fā)揮保護作用。
綜上所述,NaHS 對UC 大鼠結腸黏膜損傷發(fā)揮保護作用,可能是通過促進Nrf2/ARE 信號通路活化抑制炎癥反應實現(xiàn)的,可為臨床探尋有效治療UC 的特異性方法提供一定參考。本研究并未能明確NaHS 對Nrf2/ARE 信號通路的具體調(diào)控作用,后期應進行深入闡述。