張雪嬌

（鐵嶺市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證服務(wù)中心，遼寧 鐵嶺 112000）

鹽酸克倫特羅是一種β受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物[1]，臨床上多用于治療哮喘病，因其兼具促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、改善畜禽瘦肉比例等[2-3]功能而應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。鹽酸克倫特羅在畜禽體內(nèi)殘留，人食用畜禽產(chǎn)品后會(huì)引起心悸、惡心、高血壓、心律失常等癥狀，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡[4]。因此，我國(guó)規(guī)定嚴(yán)禁在飼料中添加鹽酸克倫特羅。

劉文光[5]建立了包括克倫特羅在內(nèi)的16種β-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物在豬、牛、羊毛發(fā)及尿液中的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的多殘留檢測(cè)方法。周小清等[6]建立了中空纖維膜三相液相微萃取富集濃縮豬尿及牛奶中的痕量鹽酸克倫特羅，后續(xù)采用高效液相色譜/紫外對(duì)其進(jìn)行定量分析。周珊珊等[7]驗(yàn)證了ELISA方法檢測(cè)豬尿中克倫特羅殘留量的可行性，結(jié)果顯示，此方法的定性檢出限為0.147 μg/L，定量檢出限為0.490 μg/L；添加0.5、1.0、5.0 μg/L的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液的變異系數(shù)分別為2.29%、6.97%、2.73%，平均回收率分別為91.8%、102.4%、99.7%。王麗娜等[8]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法并對(duì)克倫特羅在絨山羊體內(nèi)殘留消除規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，停藥40 d后，兩試驗(yàn)組殘留量均降至10 μg/L以下，肝臟含量約33 μg/kg，腎臟約5 μg/kg，其余組織均未檢出。本試驗(yàn)研究了不同給藥濃度的鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液和主要組織中的殘留規(guī)律，以期為相關(guān)研究及畜產(chǎn)品安全監(jiān)管工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)從300只健康的遼寧絨山羊群中隨機(jī)選取66只體重約30 kg、發(fā)育正常、中等體況的絨山羊，在遼寧省內(nèi)某縣絨山羊場(chǎng)內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)材料

鹽酸克倫特羅粉劑（執(zhí)法部門(mén)辦案罰沒(méi)）。

主要儀器：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（waters Quattro premier XE）、高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher公司）、固相萃取儀（J.T baker公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI公司）、超純水器（Millipore公司）、渦旋儀（北京昊諾斯科技有限公司）；恒溫振蕩器（金壇市中大儀器廠）；分析天平（感量分別為0.01、0.000 1 g）、OA-SYS氮吹儀、PRO250均質(zhì)器等。

主要試劑：甲醇、甲酸、氨水、高氯酸、MCX固相萃取小柱等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

66只試驗(yàn)絨山羊中隨機(jī)抽取6只作為對(duì)照組，其余60只隨機(jī)分為A組和B組，每組設(shè)10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3只。每個(gè)重復(fù)編號(hào)與絨山羊的耳標(biāo)號(hào)相對(duì)應(yīng)。

各組均為常規(guī)方式圈養(yǎng),飼喂配合日糧，自由飲水。對(duì)照組飼喂不含鹽酸克倫特羅的日糧，自由采食；A組每日15：00飼喂添加150 μg/kg·BW鹽酸克倫特羅的日糧，B組飼喂添加300 μg/kg·BW鹽酸克倫特羅的日糧，兩試驗(yàn)組均在飼喂添加鹽酸克倫特羅日糧前停食3 h，保證絨山羊?qū)⒑幦占Z全部吃下，連續(xù)給藥25 d后停藥。停藥后飼喂正常日糧。

試驗(yàn)共60 d，分為兩階段：第一階段為給藥期25 d，第二階段為停藥期35 d。

1.4 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)中尿液及各組織樣本中鹽酸克倫特羅含量的檢測(cè)，均采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]。

1.4.1 尿液采集

于飼喂鹽酸克倫特羅24 h后，A組、B組各隨機(jī)選取6只絨山羊，整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)每天采集尿液進(jìn)行鹽酸克倫特羅檢測(cè)；對(duì)照組6只絨山羊全部采集尿液，進(jìn)行鹽酸克倫特羅檢測(cè)，不足6只時(shí)全部采集。

1.4.2 組織樣品采集

分別在停藥的第1、3、5、7、10、15、20、25、30、35 d，于A組和B組中各隨機(jī)選取3只絨山羊宰殺，取肝臟、肺臟、腎臟、肌肉等4種組織樣品，每種組織采樣量250 g左右，對(duì)肝臟、肺臟、腎臟、肌肉中鹽酸克侖特羅殘留進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 給藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液中的殘留濃度（見(jiàn)表1）

給藥階段同時(shí)檢測(cè)對(duì)照組絨山羊，結(jié)果顯示，對(duì)照組絨山羊尿液均未檢出鹽酸克倫特羅殘留。

由表1可知，A組和B組均在飼喂24 h內(nèi)于尿液中檢測(cè)到鹽酸克倫特羅。隨著飼喂天數(shù)增加，鹽酸克倫特羅在絨山羊體內(nèi)的不斷地吸收和代謝，絨山羊體內(nèi)鹽酸克倫特羅殘留量隨之增加，鹽酸克倫特羅在尿液中的檢出濃度呈逐漸上升的趨勢(shì)。

表1 飼喂階段鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液中的殘留濃度Tab.1 Residual concentration of clenbuterol hydrochloride in cashmere goat urine during administration 單位：μg/L

A組在飼喂藥物后第10 d，尿液中鹽酸克倫特羅濃度達(dá)到第一次峰值為5 324 μg/L，之后呈較平穩(wěn)的態(tài)勢(shì)；在飼喂后第21 d出現(xiàn)第二次峰值，為3 868 μg/L。B組在給藥24 h內(nèi)尿液中鹽酸克倫特羅濃度即達(dá)到1 332 μg/L；飼喂后第9 d，尿液中濃度達(dá)到第一次峰值，為1 1487 μg/L；之后尿液中鹽酸克倫特羅濃度也呈較平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，于飼喂后第22 d出現(xiàn)第二次峰值6 889 μg/L，之后尿液中鹽酸克倫特羅的濃度逐漸降低。

2.2 停藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液中的殘留濃度（見(jiàn)表2）

停藥后35 d內(nèi)每天檢測(cè)對(duì)照組絨山羊尿液中鹽酸克倫特羅殘留的濃度，結(jié)果顯示仍未檢出。

由表2可知，停藥后，兩試驗(yàn)組絨山羊尿液中殘留的鹽酸克倫特羅濃度持續(xù)降低，至第35 d后，A組殘留濃度約6 μg/L，B組殘留濃度約9 μg/L。同一時(shí)間點(diǎn)A組中出現(xiàn)個(gè)別鹽酸克倫特羅殘留濃度大于B組,應(yīng)由絨山羊個(gè)體差異和采食不均導(dǎo)致。

表2 停藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液中的殘留濃度Tab.2 Residual concentration of clenbuterol in cashmere goat urine during drug withdrawal 單位：μg/L

2.3 停藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊不同組織中的殘留濃度（見(jiàn)表3）

停藥后第1、35 d，對(duì)照組各宰殺3只絨山羊，采集肝臟、肺臟、腎臟、肌肉4種組織，進(jìn)行鹽酸克倫特羅殘留檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)照組絨山羊的4種組織中均未檢出鹽酸克倫特羅。

由表3可知，停藥后第30 d，兩試驗(yàn)組絨山羊肝臟中仍可檢出鹽酸克倫特羅殘留，B組肌肉中檢出量為2 μg/kg；停藥后第35 d，兩試驗(yàn)組絨山羊除肝臟中仍可檢出鹽酸克倫特羅殘留外，其他組織殘留濃度均為0。

表3 停藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊不同組織中的殘留濃度Tab.3 Residual concentrations of clenbuterol in different tissues of cashmere goats during drug withdrawal 單位：μg/kg

3 討論

3.1 尿液中鹽酸克倫特羅消長(zhǎng)規(guī)律

本研究中，飼喂鹽酸克倫特羅后24 h后，A組、B組絨山羊尿液中均即可檢出鹽酸克倫特羅殘留。在給藥階段，兩組絨山羊尿液中鹽酸克倫特羅濃度始終保持在較高水平；停藥后鹽酸克倫特羅殘留濃度隨時(shí)間推移呈逐漸下降趨勢(shì)，但消除速度緩慢，停藥35 d后尿液中仍可檢出。結(jié)果表明，活體采集尿液監(jiān)測(cè)是一種有效的監(jiān)管手段。

本研究在絨山羊尿液中檢測(cè)到高濃度的鹽酸克倫特羅殘留，表明尿液是鹽酸克倫特羅排泄的主要途徑[11]，絨山羊體內(nèi)吸收的鹽酸克倫特羅濃度越高，尿液中排出的鹽酸克倫特羅殘留量越高。飼喂開(kāi)始后，鹽酸克倫特羅在體內(nèi)開(kāi)始吸收、分布、代謝、排泄。第一個(gè)峰值出現(xiàn)是由于鹽酸克倫特羅吸收出現(xiàn)飽和，大量鹽酸克倫特羅排泄到尿液中；隨后β-受體數(shù)量和結(jié)合位點(diǎn)增多，產(chǎn)生應(yīng)激現(xiàn)象，使尿液中鹽酸克倫特羅濃度降低。第二個(gè)峰值出現(xiàn)是由于組織中鹽酸克倫特羅開(kāi)始排泄，大量鹽酸克倫特羅直接排泄到尿液中。此外，重復(fù)多次飼喂鹽酸克倫特羅可在絨山羊體內(nèi)造成蓄積，導(dǎo)致給藥第25 d后，尿液中鹽酸克倫特羅的殘留量高于喂藥后第1 d的殘留量。

3.2 鹽酸克倫特羅在組織中消除規(guī)律

本試驗(yàn)結(jié)果表明，肝臟是絨山羊鹽酸克倫特羅殘留濃度最高的組織，其殘留量顯著高于腎臟、肺臟和肌肉組織。在停藥階段，4種組織中的鹽酸克倫特羅殘留濃度均呈下降趨勢(shì)，其中腎臟、肺臟和肌肉的殘留濃度下降很快，肝臟中鹽酸克倫特羅代謝較慢，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍可檢出。受試驗(yàn)條件限制，本研究未能測(cè)試出停飼鹽酸克倫特羅后什么時(shí)間可在絨山羊體內(nèi)代謝完全，仍有待進(jìn)一步研究。此外，有研究表明，鹽酸克倫特羅在眼睛中蓄積量最大[12]，但在實(shí)際工作中，監(jiān)管采樣環(huán)節(jié)采集眼睛樣本比較困難，故主要將肝臟作為監(jiān)管檢測(cè)的靶組織。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂含不同濃度鹽酸克倫特羅的日糧1 d后均可在尿液中檢測(cè)到鹽酸克倫特羅殘留；飼喂25 d及停藥后1 d，在肝臟、腎臟、肺臟、肌肉4種組織中均可檢出鹽酸克倫特羅殘留。各組織中鹽酸克倫特羅殘留量差異顯著，以肝臟中含量最高，肌肉中含量最低。

鹽酸克倫特羅在4種組織中消除的速度各不相同，在停藥第30 d后，兩試驗(yàn)組腎臟、肺臟和肌肉中鹽酸克倫特羅殘留濃度基本降至0，肝臟中仍有較高濃度殘留。4種組織中，鹽酸克倫特羅在肝臟中消除最慢。因此，肝臟可作為監(jiān)管監(jiān)測(cè)的靶組織。