細菌附屬敏感性：優(yōu)化藥物治療的新思路

黃穎然，葉欣晴，劉 娟，于 洋

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，國家獸醫(yī)微生物耐藥性風險評估實驗室，廣州 510642)

一項關于碳青霉烯類抗生素敏感性值對醫(yī)院病人死亡率影響的研究表明，MIC(minimum inhibitory concentration)值每增加2倍，病人死亡率也相應提高2倍，數(shù)據(jù)提示，隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐藥細菌不斷涌現(xiàn)并迅速擴散傳播，嚴重弱化其療效，威脅著人類健康及公共衛(wèi)生安全。如何有效抗擊抗生素的耐藥性，成為全球科學家們當前最為關注的問題之一，新型抗菌策略的開發(fā)迫在眉睫。然而新藥的研發(fā)速度遠不及細菌耐藥性進化的快速變遷，因此急需尋找其他途徑來延緩耐藥細菌所帶來的后抗生素時代的危機。通過聯(lián)合用藥于病原菌，并利用細菌的耐藥性進化缺陷，如附屬敏感性(collateral sensitivity)來優(yōu)化耐藥細菌及癌細胞的治療方案，以更大程度地發(fā)揮藥物療效，延長現(xiàn)有藥物的使用壽命是一種有效且被廣泛認可的治療思路。附屬敏感性(collateral sensitivity)又稱交互敏感性、協(xié)同敏感性、側(cè)枝敏感性，由Szybalski和Bryso等于1952年首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)并提出，即細菌對某一藥物敏感性下降時反而對另一藥物敏感性提高的現(xiàn)象。但可能由于以前細菌所展現(xiàn)的附屬敏感性未能引起人們的注意、其產(chǎn)生機制較為復雜，以及多數(shù)附屬敏感性的研究主要集中于腫瘤領域等原因，闡明細菌附屬敏感性現(xiàn)象或機制的相關研究并不多見。直到2013年，Imamovic和Sommer所繪制的大腸桿菌與各種藥物間的附屬敏感性關系圖以及 Lázár等于分子層面上解釋大腸桿菌對氨基糖苷類藥物所產(chǎn)生的附屬敏感性機制,為附屬敏感性的研究帶來了重大的突破，細菌附屬敏感性于近年又重新引起了科學家們的重視。后續(xù)多項關于附屬敏感性廣泛存在于細菌和癌細胞以及利用附屬敏感性來優(yōu)化藥物療效方案的研究報道亦指示了其樂觀的治療前景。

由于細菌基因表達調(diào)控、代謝以及表型改變之間的互作較為復雜，細菌在耐藥性進化過程中既可產(chǎn)生交叉耐藥性(cross resistance)，也可產(chǎn)生附屬敏感性。隨著對細菌附屬敏感性的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)其發(fā)生概率并不穩(wěn)定且規(guī)律性不強。因此，需要提升對細菌附屬敏感性發(fā)生機制的認識，以更準確地預測細菌耐藥性基因的出現(xiàn)、突變和傳播的方法，從而更有針對性地利用附屬敏感性制定新型治療方案。本文對附屬敏感性的產(chǎn)生規(guī)律及影響細菌附屬敏感性的關鍵因素進行綜述，并以此提出目前研究的不足以及未來發(fā)展的可能方向。

1 細菌耐藥性進化與附屬敏感性

1.1 附屬敏感性體現(xiàn)了細菌耐藥性進化路線選擇的多樣性

細菌耐藥性進化是極為復雜的過程，在特定抗生素存在的情況下，細菌可通過改變其結構、生理生化活動以適應抗生素給予的生存壓力，進化出耐藥性。從遺傳學的角度而言，多種染色體的突變、耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)導、抗性基因的獲得等均是細菌常見的耐藥性進化方式，而這些遺傳物質(zhì)改變后往往具有多效作用。因此，在細菌耐藥性進化過程中，其對單一藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，也可能會對其他藥物產(chǎn)生耐藥性，即交叉耐藥性；相反地，如果對其他藥物的敏感性提高，則產(chǎn)生了附屬敏感性。附屬敏感性和交叉耐藥性均是細菌耐藥性進化過程中的存在形式，且交錯存在于細菌耐藥性進化過程中,是細菌耐藥性進化路線選擇多樣性的一種體現(xiàn)。

1.2 附屬敏感是細菌耐藥性進化過程中的一種“進化代價”

細菌耐藥程度的變化及由此產(chǎn)生的適應性代價(fitness cost)是決定其耐藥性進化是否成功的因素之一。細菌對某種藥物進化出耐藥性利于其生存和傳播的同時，也可能會因此導致其遺傳負荷增加、細胞生理生化活動減弱等不利變化，即產(chǎn)生適應性代價。細菌在耐藥性進化中的適應性代價普遍表現(xiàn)為發(fā)生耐藥性進化的細菌在去除相應藥物后，其生長速率依然下降。適應性代價決定了細菌能否維持及傳播其獲得的耐藥性。

在生物進化過程中，一種性狀上有益變化的積累常與其他性狀的有害變化相關聯(lián)。在細菌對抗生素耐藥性進化過程中，研究者也常能觀察到由突變基因介導的一系列影響細胞滲透性、酸性、營養(yǎng)、膜和氧化應激等的防御反應。這些反應常導致許多細菌在無藥情況下提高其適應性代價，或擾亂基因組表達，從而產(chǎn)生附屬敏感性。細菌附屬敏感性機制可能涉及：1)細胞膜通透性的改變，如大腸桿菌減少對氨基糖苷類藥物吸收以產(chǎn)生耐藥性的同時也會相應減少對其他藥物的排出而產(chǎn)生附屬敏感現(xiàn)象。2)耐藥性進化提高胞內(nèi)特殊活性蛋白(如酶)的表達，激活另一種前體藥物提高有效藥物量而產(chǎn)生附屬敏感現(xiàn)象，如耐甲亞胺青霉素的大腸桿菌對呋喃妥因敏感性增強。3)細胞耐藥性進化致代謝通路改變，其他抗生素對細胞的毒性效應增強而產(chǎn)生附屬敏感現(xiàn)象，如耐替加環(huán)素大腸桿菌的突變體對呋喃妥因敏感性大幅度增加。4)耐藥性進化令其他藥物對作用靶點的親和力增加而產(chǎn)生附屬敏感現(xiàn)象，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a蛋白上E246G突變使其在克拉維酸存在的情況下對青霉素的敏感性提高。另外，不同菌株對某些藥物的附屬敏感性可能涉及一個或多個不同的作用機制。

綜上所述，細菌的附屬敏感性以及適應性代價是耐藥性進化過程中的一種取舍(trade-off)，即“進化代價”。

1.3 細菌進化的適應性代價與附屬敏感性之間的關系

基于細菌附屬敏感性設計藥物治療方案時，細菌的適應性代價能在一定程度上提高療效，抑制細菌耐藥性的發(fā)展；近期，也有研究人員利用數(shù)學模型，通過耐藥細菌的適應性的變化來預測其附屬敏感效應，但適應性代價與附屬敏感性之間并無必然聯(lián)系。換而言之，細菌耐藥性進化過程中所產(chǎn)生的適應性代價不一定會引起細菌的附屬敏感性，且細菌附屬敏感性的產(chǎn)生不一定伴隨著適應性代價。主要原因是部分細菌可通過代償突變來改善耐藥性進化所產(chǎn)生的適應性代價。此外，一些利于提高耐藥菌適應性的突變在相應野生株中反而是有害的，另外，一項對假單胞菌的研究顯示，50%的常見突變所引起的適應性變化取決于其所在菌株的遺傳背景。不僅如此，特定的耐藥突變在不同基因背景下，往往會因遺傳上位效應而導致細菌不同的適應性變化結果。

2 附屬敏感性發(fā)生的影響因素

2.1 細菌附屬敏感性機制存在不穩(wěn)定性

Barbosa等在試驗中觀察到，不同耐頭孢磺啶銅綠假單胞桿菌PA14的平行樣本對其他抗生素(如慶大霉素和鏈霉素)的敏感性呈現(xiàn)相反的變化。這是因為細菌發(fā)生耐藥性進化的機制具有多樣性，且細菌耐藥性進化軌跡具有一定隨機性，而細菌附屬敏感性取決于細菌耐藥性進化所選擇的軌跡，因此細菌與藥物間的附屬敏感反應具有不確定性。這意味著同一株細菌，即使每次都用相同的處理條件，也可能會產(chǎn)生不一致的附屬敏感性和交叉敏感性。Wright的經(jīng)典適應度景觀圖模型很好地解釋了何為進化路線的多樣性。

假設將細菌的基因型當成一個二維平面(圖1)，適應性表示為基因型平面上的高度。細菌的耐藥性進化常有多個適應峰，我們可把細菌的耐藥性進化看作是其隨機朝著不同方向“上坡”的過程，而在不同的適應峰之間會有一個進化分支點(evolutionary branching point)，當細菌在進化過程中的基因型在此進化分支點時，它未來的進化路線就有了多種可能。因此，對于僅由突變產(chǎn)生耐藥性的細菌來說，其最終耐藥性進化結果的顯著差異與突變的隨機性相關。也正由于基因突變的隨機性，細菌在耐藥性進化過程中衍生附屬敏感性的概率并不穩(wěn)定。同時，細菌產(chǎn)生附屬敏感的可重復性還會受到藥物直接作用的影響，某些種類的藥物確實能誘導出較為穩(wěn)定和固定的細菌附屬敏感性。

圖1 適應度景觀圖[14]Fig.1 Fitness landscape[14]

此外，Imamovic等在一項縱向研究中發(fā)現(xiàn)，不同時間點從同一患者體內(nèi)分離出來的同種菌株，其耐藥特性也有較大差異。其中，最主要的原因是隨著時間的推移，細菌在抗生素壓力下產(chǎn)生并積累了多種突變。這些突變的逐步獲得與積累，以及基因的上位效應等所帶來的影響，造成細菌耐藥性進化中交叉耐藥性和附屬敏感性的動態(tài)變化，增加了細菌附屬敏感性的不穩(wěn)定性。

綜上所述，細菌附屬敏感性的不穩(wěn)定性體現(xiàn)在其進化方向的不確定性，以及在時間維度上積累的不同突變而導致的動態(tài)變化。

2.2 細菌的遺傳背景影響其附屬敏感性發(fā)生

研究者們常在細菌附屬敏感性的研究中觀察到，同一基因位點的突變可在不同種群造成一定的耐藥性差異，即使兩個種群對同種藥物的耐藥性進化方向相同，其耐藥性變化程度及附屬敏感性也常呈現(xiàn)一定的差異。這些差異由兩個細菌種群中目標突變位點所在的基因內(nèi)部以及基因與基因間的遺傳背景差異所影響。通常，遺傳背景差異越大，細菌種群間的附屬敏感性、交叉耐藥性、適應性代價及耐藥程度等的差異越明顯。

例如，大腸桿菌與沙門菌兩者基因的相似度約為97.5%。基因主要編碼鉀離子轉(zhuǎn)運體蛋白，而大腸桿菌攝取氨基糖苷類藥物需通過呼吸作用和質(zhì)子驅(qū)動力(proton motive force，PMF)的介導，350突變基因可減少質(zhì)子驅(qū)動力，導致大腸桿菌中依賴PMF介導的主要外排系統(tǒng)AcrAB-To1C的活性下降，從而導致細菌攝取氨基糖苷類藥物減少，產(chǎn)生相應耐藥性，與此同時也會因此減弱對其他藥物的外排作用，對其他類藥物產(chǎn)生附屬敏感性。將大腸桿菌和沙門菌的基因做相同突變后，大腸桿菌與沙門菌對氨芐西林和紅霉素的耐藥性變化方向并不一致。并且，導入350突變基因片段后的大腸桿菌與沙門菌對不同種類藥物所表現(xiàn)的附屬敏感性也并不完全一致：導入突變基因片段的大腸桿菌對9種藥物(氨芐青霉素、頭孢西丁、強力霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、萘啶酮酸、呋喃妥英、環(huán)丙沙星)產(chǎn)生附屬敏感性，然而導入突變基因的沙門菌僅對4種藥物產(chǎn)生附屬敏感性(頭孢西丁、強力霉素、四環(huán)素、萘啶酮酸)。這種不同由兩種細菌的基因內(nèi)上位效應(intragenic epistasis)以及細菌基因間上位效應所引起，后者為主要的影響。這些上位效應的相互作用妨礙了人們預測附屬敏感性出現(xiàn)的準確率。

2.3 環(huán)境因素影響細菌附屬敏感性

大量現(xiàn)有研究報道了影響細菌附屬敏感性的重要遺傳因素，除此以外，許多研究表明，環(huán)境因素也對細菌附屬敏感性有重大影響。這些環(huán)境因素體現(xiàn)在細菌所生存環(huán)境中的抗生素壓力強度、抗生素環(huán)境變化速率、不同的適應性進化方法、宿主內(nèi)環(huán)境等方面。了解影響細菌附屬敏感性的環(huán)境因素可令人們對其保守性有更深入的理解，從而在臨床上更好地預測以及應用細菌附屬敏感性。

2.3.1 抗生素壓力強度影響細菌附屬敏感性 Oz等通過高/低強度抗生素持續(xù)誘導大腸桿菌的耐藥性進化試驗證明(圖2)，抗生素的選擇強度是導致抗生素耐藥性問題復雜化的一個隱藏的重要參數(shù)，高強度的抗生素壓力更利于細菌的直接耐藥性、交叉耐藥性以及附屬敏感性的進化。在溫和的抗生素壓力下，部分細菌亞群仍能繼續(xù)生長，此時，細菌基因突變的目的往往是增強其在這一條件下的生長適應性，如通過對多藥耐藥基因或者轉(zhuǎn)錄子的改變來適應環(huán)境的變化。而在高強度抗生素壓力下，細菌的首要任務為生存，因此它們不惜采取具高適應性成本的基因突變，如以重要細胞器(核糖體)或者必須酶(RNA聚合酶)為目標的基因突變來提高生存概率。不僅如此，細菌在較高強度抗生素壓力下會比其在溫和的抗生素壓力下積累更多類型的基因突變。這些突變常影響不同細胞通路(相應藥物作用抑制的或者非相應藥物作用抑制的特殊通路)或提高耐藥性進化過程的適應性，導致細菌出現(xiàn)更多交叉耐藥或附屬敏感反應。

細菌在不同的藥物濃度，且藥物濃度梯度的跨度大于預期MIC的試管中生長。于高強度抗生素梯度以及溫和強度的抗生素梯度壓力下誘導培養(yǎng)細菌群體22 h，將能在最高藥物濃度下存活的細菌群體轉(zhuǎn)移到新的具有更高藥物濃度的試管中培養(yǎng)，持續(xù)22 dBacterial populations were grown in several tubes with increased drug concentrations that span the expected MIC of the population. Populations were grown for approximately 22 h and the populations surviving in the highest drug concentration were transferred to new culture vials with higher drug concentration, lasting for 22 days圖2 強、弱選擇條件下液體培養(yǎng)細菌進化試驗示意圖[46]Fig.2 Schematic illustration of bacterial evolution experiments in liquid culture under strong and mild selection[46]

2.3.2 抗生素環(huán)境變化速率影響細菌附屬敏感性 除了抗生素強度，環(huán)境變化速率(rate of environmental change)也會影響細菌的耐藥性進化。以抗生素濃度變化速率為例，Lindsey等通過使用3種不同濃度增量速率(快速、適中、平緩)的利福平來誘導大腸桿菌的耐藥性進化(后續(xù)將簡稱為抗生素增量法)，并檢測大腸桿菌對利福平耐藥的相關基因(編碼RNA聚合酶β亞基的基因)序列。試驗結果顯示，誘導過程中大腸桿菌產(chǎn)生的所有類型的基因突變都是非同義的，平緩、適中的抗生素增量法誘導的細菌的核苷酸多樣性顯著高于快速抗生素增量法誘導的細菌，這可能是由于平緩和適中的藥物濃度增量速率給細菌種群提供更多發(fā)生和傳播耐藥性突變的機會。除此以外，研究人員還發(fā)現(xiàn)由于受到基因符號上位效應(sign genetic epistasis)和環(huán)境上位效應(environmental epistasis)，以及后一耐藥突變的發(fā)生與否常取決于前一個關鍵的耐藥突變是否發(fā)生等因素的影響，在快速抗生素增量法下誘導的細菌無法獲得在平緩和適中藥物濃度增量速率下所取得的耐藥性進化路線，以至細菌最終無法獲得可適應最高藥物濃度的突變基因型，這表明循序漸進的低水平耐藥突變更利于細菌的耐藥性發(fā)展。除抗生素濃度的增量速率以外，溫度以及CO等環(huán)境因素的變化速率不同，也可能會影響生物基因型的進化路線，導致細菌附屬敏感性差異。

2.3.3 不同適應性進化方法影響細菌附屬敏感性 Jahn等用不同的抗生素適應性進化方法(adaptive laboratory evolution，ALE)，如梯度法和每日25%、50%、100%濃度增量法(后續(xù)將簡稱為增量法)，來誘導大腸桿菌的耐藥性(圖3)。結果表明，除了每日100%增量法，其他方法誘導后細菌耐藥性均超過臨床折點。在不同適應性進化方法誘導下，處于臨床折點附近的大腸桿菌對其他藥物的交叉耐藥性及附屬敏感性大部分相似。對比梯度法和25%增量法，梯度進化譜系生長速度較慢，25%增量法誘導的細菌增長速度最快；在25%增量法以及梯度法誘導后細菌基因型很相似，但是相對而言，25%增量法所誘導的細菌基因型更豐富且?guī)缀鯏y帶了所有梯度法誘導的細菌所發(fā)生的突變，因此，推測在梯度法誘導后細菌所發(fā)生的突變可能是最重要的抗性表型。此項研究所展現(xiàn)的“較低濃度抗生素壓力下細菌基因型更豐富”的結論與Oz等所提出的“細菌在高濃度抗生素壓力下會比其在低濃度抗生素壓力下積累更多類型的基因突變”的結論不一致，原因尚不明確?？梢源_定的是細菌一旦有存活的機會，往往會朝著更利于生存的方向進化。因此適當?shù)沫h(huán)境刺激及適應性代價反而常促進細菌的進化，讓其得以不斷自我完善。而附屬敏感效應正是細菌不斷進化以適應抗生素壓力過程中的所產(chǎn)生的缺陷，人們利用此缺陷來延緩其耐藥性進化速度以達到“減抗增效”的目的。

使用4種不同的適應性實驗室進化法誘導大腸桿菌對不同藥物的耐藥性。這4種不同的方法分別為梯度法、100%濃度增量法、50%濃度增量法和25%濃度增量法。梯度法是將細菌接種到10個等藥物濃度梯度，且每個梯度為2倍的96孔板中，第2天將生長在最高濃度的細胞接種到新的梯度中，持續(xù)14 d。在增量方法中，每轉(zhuǎn)移一次，藥物濃度提高100%、50%或25%。所有方法體系均在試驗的第4天達到野生型菌株的最低抑菌濃度(MIC)Adaptation of E. coli K12 to three antibiotics following four adaptation protocols with different selection strengths. The four selection systems are named “gradient” “100% increment” “50% increment” and “25% increment”. In the gradient approach, cells were inoculated into a 2-fold, 10-step drug gradient and cells growing in the highest concentration were used for inoculation of a fresh gradient. In the increment approaches the drug concentration was raised with every transfer either by 100%, 50%, or 25%. The wild type minimal inhibitory concentration (MIC) was reached on the fourth day of the experiment for all increment lineages圖3 不同抗生素適應性實驗室進化方法[57]Fig.3 Different adaptive laboratory evolution experimental design of the study[57]

此項研究表明，不同的環(huán)境因素對細菌的耐藥性進化有決定性影響。其中，抗生素的增量速率常決定細菌的最大耐藥水平，間接影響細菌的附屬敏感性。而一旦細菌種群達到指定的耐藥水平，無論其所采用的實驗室進化方式如何，細菌種群間的基因型與表型都有一定的相似性。這是由于進化的本質(zhì)是自然選擇，雖然細菌耐藥性進化具有一定的隨機性從而豐富了其耐藥性進化路線的多樣性，但是細菌在適應一定選擇壓力的過程中可獲得的變化數(shù)量有限且進化傾向于此類突變，細菌的進化具有一定的方向性，因此暴露在類似環(huán)境中的細菌所發(fā)生的變化具有一定的相似性。而在25%濃度增量法以及梯度法誘導下，細菌種群間基因型的差異提示，不同的適應性進化方法也可能會造成其基因型有細微的不同，至于這些細微的不同是否會進一步地影響細菌后續(xù)的進化軌跡及附屬敏感效應，仍需通過更深入的高通量試驗研究解答。

2.3.4 細菌寄生環(huán)境的理化性質(zhì)影響附屬敏感性 除了上述常見于體外試驗的環(huán)境因素，細菌寄生環(huán)境的理化性質(zhì)對細菌的附屬敏感性也有重大影響。例如：膽汁可上調(diào)細菌外排泵；鋅可降低氨基糖苷類降解酶的活性；高溫可改變無藥條件下耐利福平細菌突變?nèi)后w的生長狀況；細菌可因不同的pH、溫度、膽鹽濃度等環(huán)境條件而更傾向于某種耐藥性進化。這意味著，宿主的某些生理條件也可能會影響細菌在有藥以及無藥環(huán)境下的進化路線，從而影響其附屬敏感性。例如，耐慶大霉素大腸桿菌的基因突變?nèi)后w在培養(yǎng)條件為37 ℃時對頭孢呋辛表現(xiàn)出交叉耐藥性，然而卻在培養(yǎng)條件為42 ℃時表現(xiàn)出對頭孢呋辛的附屬敏感性；42 ℃，甲氧芐氨嘧啶存在條件下，大腸桿菌更傾向于進化成具有突變的耐藥群體，此群體在42 ℃培養(yǎng)條件下對呋喃妥因表現(xiàn)出交叉耐藥性，但卻在37 ℃培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出相應的附屬敏感性。這提示細菌可因其所寄生環(huán)境的理化性質(zhì)不同而表現(xiàn)出不同的附屬敏感性。因此，應用附屬敏感性設計臨床治療方案時，也需要充分考慮細菌寄生環(huán)境的理化性質(zhì)對其附屬敏感性的影響。

3 細菌附屬敏感性的潛在應用前景

3.1 高度保守的附屬敏感效應及其預測準確性是附屬敏感性應用的前提

慢性感染的特性決定其需要特定的治療方案，因此附屬敏感性在臨床慢性感染的治療上具有較大的發(fā)展前景。然而，多項研究表明，細菌耐藥性進化過程中附屬敏感以及交叉耐藥效應普遍是交替出現(xiàn)的，這意味著若要將附屬敏感性應用到臨床治療，需保證治療過程中細菌總是或者大概率對某些藥物對進化出穩(wěn)定且固定的附屬敏感性，即高度保守的附屬敏感效應(conserved collateral sensitivity effects)。近期有多項研究報道了細菌與藥物間高度保守的附屬敏感反應，為細菌附屬敏感性的應用前景帶來曙光。例如，大腸桿菌對環(huán)丙沙星耐藥的同時，對慶大霉素、磷霉素有較高保守程度的附屬敏感性，而影響細菌外排泵系統(tǒng)的突變是引起其附屬敏感性發(fā)生的重要因素。無獨有偶，Imamovic等也在不同囊性纖維病患者體內(nèi)分離出具有不同遺傳背景的銅綠假單胞桿菌，并發(fā)現(xiàn)這些臨床樣本對環(huán)丙沙星耐藥的同時，對慶大霉素、黏菌素具有較高保守程度的附屬敏感性，這種附屬敏感的產(chǎn)生與基因突變有關?；?qū)е翸exC轉(zhuǎn)運體的過度表達，影響細菌的多重耐藥外排系統(tǒng)，從而引起試驗株的附屬敏感效應。因此，基因突變或MexC蛋白的豐度可能是一種潛在的、可預測附屬敏感效應的標志物。這些研究結果啟示，在不同遺傳背景的細菌種群中，附屬敏感效應機制的相似性及可預測性是將細菌的附屬敏感效應運用于臨床的前提，而這種相似性與可預測性取決于由細菌種群的耐藥機制所造成細菌生理變化的相似程度?；蛟S，未來可通過檢測細菌附屬敏感效應的基因組或蛋白質(zhì)組生物標志物來預測耐藥細菌的附屬反應，從而更科學地設計藥物治療方案，提高慢性感染治療的成功率。

上文提到，細菌遺傳背景的差異以及細菌耐藥突變路線的多樣性，是預測細菌種群形成高度保守的附屬敏感效應的最大的障礙。針對此問題，Ardell和Kryazhimskiy用聯(lián)合適應度效應分布(joint distribution of fitness effects，JDFE)來量化細菌耐藥突變的多效性所帶來的多種影響。JDFE是指細菌在產(chǎn)生一個新突變后，將在初始使用的抗生素(用以誘導產(chǎn)生耐藥性的抗生素)環(huán)境與之后使用的另一抗生素環(huán)境中表現(xiàn)出不同的適應性變化，將這兩種變化的可能性組合起來，并計算其發(fā)生概率，這種概率稱為JDFE。利用JDFE和數(shù)學模型模擬短時間內(nèi)細菌附屬敏感效應的動態(tài)變化，并優(yōu)化了先前用以預測附屬敏感反應發(fā)生率及估算預測準確性的計算模型。優(yōu)化后的計算模型減少了細菌遺傳背景差異及耐藥突變路線的多樣性，但強調(diào)了細菌耐藥突變種類對預測結果的影響。但由于缺乏高通量試驗數(shù)據(jù)的支持以及體內(nèi)試驗的驗證；計算模型僅局限于細菌多染色體的突變；且在設計模型時簡化了許多參數(shù)對細菌耐藥性進化路線的影響，該計算模型尚且不夠完善，后續(xù)仍需對此類數(shù)學模型做更深入的研究。

3.2 基于細菌附屬敏感性制定科學的用藥策略

基于細菌附屬敏感性所設計的給藥方案可在不降低療效的前提下減少抗生素用量，從而降低抗生素相關的毒性風險，擴大抗生素的應用范圍，并限制抗生素耐藥性發(fā)展。附屬敏感效應為提高藥物療效和延長現(xiàn)有藥物使用壽命的問題提供了新思路，但是細菌的耐藥性進化是復雜的，即使細菌對某些藥物存在附屬敏感性，不當?shù)挠盟幏桨敢部赡軙铀偌毦退幮缘倪M化。因此，更需充分考慮以下問題：如何基于特定細菌的附屬敏感效應制定科學而有效的藥物治療方案，在設計此方案的過程中需要重視哪些關鍵因素？

上文已強調(diào)各種環(huán)境因素對細菌附屬敏感性有重大影響，需在制定用藥方案時給予充分考慮。此外，另一項研究通過數(shù)學模型顯示：在細菌和藥物間存在附屬敏感效應的情況下，同時用藥和間隔1 d的輪換用藥治療法可顯著抑制細菌的耐藥性進化。對于間隔1 d的輪換用藥療法，開始使用時間依賴型的抗生素比最初使用濃度依賴型的抗生素更有效地抑制細菌耐藥性進化；當細菌對藥物的附屬敏感性是單向的或細菌對所計劃使用藥物存有耐藥性的情況下，需慎重考慮用藥的先后次序。這提示，基于細菌附屬敏感性設計藥物治療方案的效果，與用藥間隔時間、藥物類型、藥物濃度、用藥順序、細菌現(xiàn)有耐藥情況等多種因素密切相關。因此若要形成成熟的基于細菌附屬敏感性設計用藥方案，我們?nèi)孕枭钊胨伎既绮≡退幬锏奶禺愋?、藥物間附屬敏感效應的方向性、輪換用藥的最佳切換時間、藥物代謝動力學、藥物效應動力學、藥物間不同的相互作用等更多方面的因素對用藥方案的影響。

4 小 結

近年來，借用細菌的附屬敏感性來延長、優(yōu)化現(xiàn)有藥物的療效是治療耐藥細菌的新思路之一，但目前對于細菌附屬敏感性的研究尚處于初始階段，由于進化軌跡的隨機性所造成細菌附屬敏感效應的異質(zhì)性、較低重復性，以及細菌的表觀遺傳效應、基因缺失、基因水平轉(zhuǎn)移等因素均增加了實際情況下細菌耐藥性進化的復雜性及預測難度。為了打破體外試驗的多種限制因素，更接近自然演化的耐藥性進化情況，應著重收集臨床治療前后的菌株并對其進行藥敏試驗，分析其交叉耐藥性和附屬敏感性，并將分析結果與高通量實驗室數(shù)據(jù)和數(shù)學模型相結合，以更好地評估細菌附屬敏感性出現(xiàn)的保守程度，解釋進化的內(nèi)在隨機性以及保證細菌附屬敏感效應的高度保守性，從而更準確地解析且更好地應用細菌附屬敏感效應。后續(xù)仍需要結合更多的前瞻性研究，提高對細菌耐藥性進化以及附屬敏感性的認識，以更加準確地預測及利用附屬敏感效應突破由細菌耐藥性進化引起的難點問題。