miR-138靶向PGC-1α調(diào)控牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖及分化

冉宏標(biāo)，王 會(huì) *，柴志欣，王嘉博，張 明，蔡 欣，鐘金城*

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省/教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041)

牦牛()是我國(guó)青藏高原地區(qū)重要的牛種，具備抗逆性強(qiáng)、耐低氧和高壓、抗強(qiáng)紫外線特點(diǎn)等。牦牛肉極低的肌內(nèi)脂肪含量嚴(yán)重影響牦牛肉口感、嫩度、肉色及風(fēng)味，制約了牦牛肉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。肌內(nèi)脂肪沉積的影響因素有品種、年齡、營(yíng)養(yǎng)、管理等，研究表明其遺傳力為0.36～0.54，屬于中高遺傳力性狀；且營(yíng)養(yǎng)與管理等因素也是通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)及蛋白修飾等方式影響肌內(nèi)脂肪含量。因此，闡明牦牛肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制對(duì)于牦牛優(yōu)良品種選育和牦牛肉品質(zhì)改善及牦牛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。

miR-138作為一種腫瘤抑制因子，在疾病的發(fā)生與干預(yù)過(guò)程中得到了廣泛研究。研究表明，miR-138表達(dá)水平在肥胖患者結(jié)腸和血清中都呈顯著下調(diào)，對(duì)肥胖及正常孕婦羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p在肥胖孕婦羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常孕婦，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-138靶基因的KEGG pathway富集于脂肪細(xì)胞分化、脂肪沉積和脂肪代謝等通路。miR-138在人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hAD-MSCs)成脂分化過(guò)程中被顯著下調(diào)，當(dāng)miR-138過(guò)表達(dá)時(shí)可靶向負(fù)調(diào)控E1A樣分化抑制因子1(-1)的表達(dá)，從而抑制hAD-MSCs成脂分化，減少脂滴沉積。這些研究表明，miR-138在動(dòng)物脂肪生成過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。且在黃牛上的研究結(jié)果表明，不同品種間肌內(nèi)脂肪差異表達(dá)基因也存在較大差異，提示不同品種對(duì)肌內(nèi)脂肪代謝調(diào)控存在特異性。因此，研究miR-138對(duì)牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響對(duì)揭示牦牛肉低肌內(nèi)脂肪含量形成的機(jī)制具有重要意義。

本研究旨在利用過(guò)表達(dá)和干擾技術(shù)探究miR-138對(duì)牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖、分化及脂質(zhì)沉積的影響；利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-138在牦牛脂肪生成過(guò)程中的潛在靶基因，初步篩選miR-138在脂質(zhì)沉積中的下游調(diào)控靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證，為闡明miR-138在牦牛肌內(nèi)脂肪沉積過(guò)程中的遺傳調(diào)控機(jī)制、構(gòu)建相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)和提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DMEM/F12(1∶1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；HBSS緩沖液購(gòu)自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶和青霉素/鏈霉素(雙抗)購(gòu)自博士德(北京)公司；I型膠原酶、II型膠原酶、油紅O染料和油酸試劑均購(gòu)自Sigma公司；4%多聚甲醛購(gòu)自Biosharp生物科技公司；DEPC水、PBS溶液、胎牛血清和Lipofectamine3000購(gòu)自賽默飛(Thermo Fisher Scientific)公司；反轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；PI試劑購(gòu)自索萊寶科技公司；CCK-8試劑盒和TRIzol試劑購(gòu)自天根生物；miR-138 mimics、inhibitor及引物均由擎科生物公司合成。

1.2 主要儀器

倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自蔡司(Zeiss)公司；水浴鍋(HWS-240)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific Varioskan LUX)；熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific QuantStudio 3.0)；流式細(xì)胞儀(SYSMEX CyFlow Cube 8)。

1.3 試劑配制

稱取0.1 g油紅O染色液溶于100 mL異丙醇制成油紅O染色原液，于4 ℃冰箱避光保存，染色前按(原液)∶(滅菌水)=3∶2配制并過(guò)濾；稱取0.1 g Ⅰ型膠原酶和0.1 g Ⅱ型膠原酶分別溶于100 mL HBSS緩沖溶液，過(guò)0.22 μm除菌過(guò)濾器后，按(0.1% Ⅰ型膠原酶)∶(0.1% Ⅱ型膠原酶)=2∶1比例配制組織消化液；完全培養(yǎng)基(10%血清+1% 雙抗的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基)；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(10% 血清+1% 雙抗+50 μmol·L油酸的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 牦牛前體脂肪細(xì)胞分離 于都江堰(成都)輝潤(rùn)屠宰場(chǎng)采集新鮮屠宰的，年齡約2歲的健康麥洼牦牛的背最長(zhǎng)肌，使用含3%雙抗冰PBS緩沖液清洗樣本數(shù)次至無(wú)血漬，轉(zhuǎn)移至含3%雙抗基礎(chǔ)培養(yǎng)基中于冰上帶回實(shí)驗(yàn)室，使用含2%雙抗的PBS緩沖液清洗采回的組織樣本，在PBS濕潤(rùn)環(huán)境下使用無(wú)菌剪刀剔除肉眼可見(jiàn)筋膜、血管，將剩余組織剪碎至1 mm大小肉糜；按(組織)∶(消化液)約為2∶1加入消化液，于37 ℃水浴消化4 h，期間每5 min混勻1次；消化結(jié)束后依次過(guò)70 μm和40 μm細(xì)胞篩，取濾液2 000 r·min離心5 min，使用無(wú)血清DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀，并依次1 800、1 500 r·min梯度離心5 min，沉淀加入完全培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(50 mL·LCO)貼壁1.5 h后更換新鮮培養(yǎng)基，之后每2 d更換培養(yǎng)基培養(yǎng)至傳代及凍存。

1.4.2 Mimics、inhibitor設(shè)計(jì)合成及轉(zhuǎn)染濃度篩選 參照bta-miR-138成熟序列(MIMAT 0003813)設(shè)計(jì)mimics和inhibitor，交由擎科(北京)生物公司合成。設(shè)置30、50、100和150 nmol·L共4個(gè)濃度，待肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)至第三代(F3)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。細(xì)胞按參考接種量接種至12孔板，設(shè)置mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC 組，每組3個(gè)重復(fù)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)參照Lipofectamine3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC轉(zhuǎn)染。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)染6 h后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化48 h，收集細(xì)胞并提取總RNA用于測(cè)定miR-138表達(dá)情況，篩選轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.3 MiR-138靶基因預(yù)測(cè)及功能分析 利用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和miRDB(http://www.mirdb.org/)對(duì)bta-miR-138靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果取交集；利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行KEGG和GO富集分析，篩選脂質(zhì)代謝過(guò)程相關(guān)的潛在靶基因。

1.4.4 總RNA提取及cDNA合成 按TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，具體方法參照說(shuō)明書(shū)。miR-138 定量用cDNA合成參照PrimerScriptRT reagent kit with gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)(TaKaRa RR047A)進(jìn)行，miR-138反轉(zhuǎn)錄引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT-TGAGCGGCCTGA-3′；內(nèi)參6引物參照前人研究。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR) 使用TB GreenPremix EX TaqII試劑盒(TaKaRa RR820A)進(jìn)行qPCR試驗(yàn)，定量引物序列信息見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s，60 ℃(引物退火溫度詳見(jiàn)表1)退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。分別以6和作為miR-138及目的mRNA內(nèi)參，采用2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物信息Table 1 qPCR primer information

1.4.6 油紅O染色 細(xì)胞誘導(dǎo)分化后進(jìn)行油紅O染色測(cè)定細(xì)胞脂滴積累情況：吸去培養(yǎng)基后使用PBS輕柔沖洗細(xì)胞，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛，室溫固定1 h；使用無(wú)菌ddHO輕柔沖洗細(xì)胞3次，加入油紅O染液室溫染色30 min；無(wú)菌ddHO沖洗細(xì)胞5次，每次1 min，至無(wú)明顯紅色背景，鏡檢拍照。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞參照正常細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)間點(diǎn)和染色步驟進(jìn)行油紅O染色，用于檢測(cè)miR-138對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響。鏡檢完成后每孔加入200 μL異丙醇萃取細(xì)胞中油紅O染色液，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定萃取液OD值。

1.4.7 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種至96孔板，加入新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)分別在12、24、36和48 h后進(jìn)行CCK-8測(cè)定：向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，恢復(fù)室溫后于480 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。劃痕試驗(yàn)待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行：使用無(wú)菌槍頭沿貼壁細(xì)胞中軸勻速劃出劃痕，分別培養(yǎng)12、24和36 h后觀察細(xì)胞增殖情況并拍照。

1.4.8 流式細(xì)胞周期檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至12孔板，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；48 h后使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞沉淀并加入70%乙醇于4 ℃過(guò)夜固定細(xì)胞；加入濃度為100 μg·mL的PI染料室溫避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.9 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn) 根據(jù)TargetScan7.2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，參考-1序列設(shè)計(jì)3′ UTR擴(kuò)增引物(F：5′-AACCATTCTTTTCCTTTCTC-3′，R：5′-ATACCTGCATTTAACCTACA-3′)，用于擴(kuò)增包含結(jié)合位點(diǎn)3′ UTR序列，連接pmD-19T載體后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)并測(cè)序驗(yàn)證。設(shè)計(jì)突變引物Fm：5′-GCATTCATTTATAGCATATTGTGTTC-AGAGTGAATCCACTGTCTGTCCTGTCGG-3′；Rm：5′-AACACAATATGCTATAAATGA-ATGCAGCTTTCAAAATTAGCTGCATTGGCC-3′(粗體為突變位點(diǎn))。采用overlap PCR完成結(jié)合位點(diǎn)突變，回收片段并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒用于測(cè)序驗(yàn)證。使用I和II雙酶切構(gòu)建野生型表達(dá)載體(-1-Wt-PGL3-basic)和突變型表達(dá)載體(-1-Mut-PGL3-basic)。利用Lipofectamine3000將miR-138 mimics或mimics NC與雙熒光素酶表達(dá)載體分別共轉(zhuǎn)入牦牛前體脂肪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后參照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega E1910)說(shuō)明書(shū)測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.4.10 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)均用“Mean±SD”表示，試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組樣本采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，使用GraphPad Prism 8完成數(shù)據(jù)可視化作圖。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離鑒定

原代肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離后貼壁1.5 h可觀察到前體脂肪細(xì)胞呈梭型貼壁生長(zhǎng)；培養(yǎng)24 h后細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)呈梭形或橢圓形；72 h細(xì)胞開(kāi)始融合；培養(yǎng)至第8天，細(xì)胞密度達(dá)到90%左右，呈梭形、螺旋狀排列，此時(shí)開(kāi)始傳代培養(yǎng)。對(duì)F3代細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定，油紅O染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化第8天時(shí)，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量脂滴積累，形成較大脂滴(圖1)。獲得細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定獲得的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞特征相符，表明成功獲得具有分化潛能的牦牛背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。

A. 培養(yǎng)1.5 h，箭頭所示為梭形貼壁細(xì)胞(100×)；B. 分離培養(yǎng)72 h，細(xì)胞開(kāi)始融合(100×)；C. 誘導(dǎo)分化第8天油紅O染色(100×)；D. 誘導(dǎo)第8天脂滴形成情況(400×)A. Cell culture for 1.5 h, the arrowheads indicates fusiform adherent cell (100×); B. Cell culture for 72 h, cells begin to fusion (100×); C. The Oil red O staining after induced differentiation for 8 days (100×); D. Lipid droplet formation after induced 8 days (400×)圖1 前體脂肪細(xì)胞分離鑒定Fig.1 Preadipocyte isolation and identification

2.2 miR-138 mimics及inhibitor轉(zhuǎn)染效率

利用RT-qPCR技術(shù)分別測(cè)定4個(gè)不同轉(zhuǎn)染濃度下miR-138相對(duì)表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖2)，相較NC組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-138 mimics后miR-138表達(dá)量極顯著上調(diào)(<0.01)，轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitor后miR-138表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)，且mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol·L時(shí)過(guò)表達(dá)及干擾效率分別為570%和63%，因此選擇100 nmol·L作為后續(xù)試驗(yàn)轉(zhuǎn)染濃度。

A. miR-138 mimics 轉(zhuǎn)染結(jié)果；B. miR-138 inhibitor 轉(zhuǎn)染結(jié)果。*表示P <0.05，**表示P <0.01，下同A. Transfection result of miR-138 mimics; A. Transfection result of miR-138 inhibitor. *indicate P <0.05, **indicate P <0.01, the same as below圖2 轉(zhuǎn)染濃度篩選Fig.2 Transfection concentration screening

2.3 miR-138抑制前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積

F3代牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染后，誘導(dǎo)分化至第8天，油紅O染色檢測(cè)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況，結(jié)果如圖3所示，過(guò)表達(dá)miR-138后，細(xì)胞內(nèi)脂滴累積顯著降低，而抑制miR-138后，細(xì)胞脂滴積累顯著增多；油紅O染液吸光值與染色結(jié)果一致(圖3A)，表明過(guò)表達(dá)miR-138可抑制牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積，抑制miR-138可促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)沉積。

A. 油紅O染色結(jié)果(100×)； B. 脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)水平A. Oil red O staining result (100×); B. The expression level of adipose differentiation marker genes圖3 miR-138對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.3 Effects of miR-138 on adipocyte differentiation

利用qPCR測(cè)定miR-138過(guò)表達(dá)及干擾后脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因和表達(dá)水平(圖3B)，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-138顯著降低了和的表達(dá)(<0.01)，干擾miR-138表達(dá)可顯著上調(diào)和的表達(dá)(<0.05)，表明miR-138可能通過(guò)抑制肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化水平，從而減少胞內(nèi)脂滴積累。

2.4 miR-138對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖活性的影響

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種至96孔板，12 h后細(xì)胞密度可恢復(fù)至80%～90%，此時(shí)開(kāi)始劃痕試驗(yàn)。結(jié)果顯示，與mimics NC相比，過(guò)表達(dá)miR-138后36 h后細(xì)胞仍存在明顯空隙，而NC組轉(zhuǎn)染36 h后細(xì)胞空隙完全消失；抑制miR-138組細(xì)胞同樣在36 h時(shí)空隙完全消失，而對(duì)照組劃痕恢復(fù)速度明顯低于inhibitor組細(xì)胞(圖4A)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果(圖4B)表明，轉(zhuǎn)染miR-138 mimics 24 h后細(xì)胞活性顯著低于NC組(<0.01)，并在36 h極顯著低于NC組；與inhibitor NC相比，轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitor后細(xì)胞增殖活力表現(xiàn)為相反趨勢(shì)；該結(jié)果與劃痕試驗(yàn)結(jié)果相符，表明過(guò)表達(dá)miR-138可顯著降低牦牛前體脂肪細(xì)胞增殖活性，抑制miR-138表達(dá)則可增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性。

A. 劃痕試驗(yàn)結(jié)果(50×)；B. CCK-8檢測(cè)結(jié)果A. Scratch test results (50×); B. CCK-8 test results圖4 miR-138對(duì)脂肪細(xì)胞增殖活性的影響Fig.4 Effects of miR-138 on adipocyte proliferation

進(jìn)一步通過(guò)流式檢測(cè)分析細(xì)胞周期變化情況，結(jié)果(圖5A)顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-138后細(xì)胞主要停滯在G0期；抑制miR-138后G1期細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而G2-M期細(xì)胞明顯增多。結(jié)果表明miR-138可能通過(guò)阻滯細(xì)胞由G1向S期的進(jìn)程影響細(xì)胞增殖。通過(guò)RT-qPCR分析細(xì)胞增殖相關(guān)基因的mRNA表達(dá)變化(圖5)，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-138后細(xì)胞周期相關(guān)基因1、1和增殖標(biāo)記基因67 mRNA表達(dá)受到顯著抑制，而抑制miR-138則增強(qiáng)了上述基因的表達(dá)，且67和1表達(dá)量顯著上升(<005)。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-138可通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)基因1和1以及增殖標(biāo)志基因67的表達(dá)，阻滯細(xì)胞G1-S進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。

A. 流式周期分析；B. 增殖標(biāo)志基因表達(dá)變化A. Flow analysis; B. Expression level of proliferation marker genes圖5 miR-138對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effects of miR-138 on cell cycle

2.5 miR-138靶基因預(yù)測(cè)與功能分析

利用TargetScan、miRWalk和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)到672、14 020和657個(gè)潛在靶基因，其中263個(gè)靶基因?yàn)楣灿邪谢?圖6A)，包括-1、1、1、11等與脂肪代謝相關(guān)基因。對(duì)潛在靶基因進(jìn)行KEGG和GO富集分析，GO結(jié)果(圖6C)顯示主要富集在RNA聚合酶II啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正/負(fù)調(diào)控、I型肺細(xì)胞分化、蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴蛋白分解代謝過(guò)程、Wnt信號(hào)通路和磷脂酰肌醇磷酸化等生物學(xué)過(guò)程(BP)；核染色質(zhì)、胞質(zhì)mRNA處理體、細(xì)胞核等細(xì)胞定位(CC)過(guò)程；染色質(zhì)DNA結(jié)合、RNA聚合酶II啟動(dòng)子核心區(qū)特異性DNA結(jié)合和鋅離子結(jié)合等分子功能(MF)過(guò)程。KEGG通路富集分析結(jié)果(圖6B)顯示，相關(guān)靶基因參與軸突導(dǎo)引、胰島素抵抗、RNA降解和胰島素分泌等通路。由于胰島素抵抗與脂肪酸代謝過(guò)程密切相關(guān)，故從胰島素相關(guān)通路篩選出6個(gè)參與脂肪生成調(diào)控的潛在靶基因(表2)，進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

A. 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果；B. GO富集分析；C. KEGG pathway 富集分析A. Target gene predict result; B. Analysis of GO enrichment; C. Analysis of KEGG pathway enrichment圖6 miR-138生物信息學(xué)分析Fig.6 Bioinformatics analysis of miR-138

表2 靶基因篩選結(jié)果Table 2 Results of target genes screening

2.6 過(guò)表達(dá)及抑制miR-138對(duì)靶基因的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics及inhibitor并誘導(dǎo)分化48 h后，利用RT-qPCR測(cè)定靶基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-138后，靶基因11、1和11的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(<0.05)，-1α和25 mRNA表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)，的mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(>0.05,圖7A)；抑制miR-138的表達(dá)后，和25的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(<0.05)，11和-1α的mRNA表達(dá)水平極顯著上調(diào)(<0.01)，而1和11的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異(>0.05，圖7B)。

A. 過(guò)表達(dá)miR-138對(duì)靶基因的影響；B. 抑制miR-138表達(dá)對(duì)靶基因的影響A. Effects of miR-138 overexpression on target genes; B. Effects of miR-138 suppression on target genes圖7 miR-138對(duì)靶基因的影響Fig.7 Effects of miR-138 on target genes

2.7 miR-138靶向PGC-1α 3′ UTR序列

RT-qPCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)和抑制miR-138都可極顯著影響-1的mRNA表達(dá)水平，暗示miR-138可能通過(guò)靶向-1影響前體脂肪細(xì)胞增殖分化過(guò)程。利用雙熒光素酶試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-138與-1的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-138 mimics和-1-Wt-PGL3-basic后，對(duì)比其他組熒光強(qiáng)度顯著降低(<0.01)，且轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitor和-1-Wt-PGL3-basic后熒光強(qiáng)度最高(圖8)。結(jié)果表明-1是miR-138的下游直接作用靶標(biāo)，miR-138可特異性結(jié)合-1mRNA的3′ UTR序列，降低mRNA表達(dá)水平。

A. 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)； B. 位點(diǎn)突變驗(yàn)證; C.雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果A. Predicted binding site; B. Site mutation verification; C. The result of dual-luciferase reporter assay圖8 雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Results of dual-luciferase reporter assay

3 討 論

動(dòng)物脂肪生成是一個(gè)復(fù)雜的協(xié)作體系，受到脂肪細(xì)胞的分化、脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程的影響，miRNAs在該過(guò)程中發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞脂質(zhì)代謝過(guò)程中miR-138可以靶向1基因，激活A(yù)MPK通路，進(jìn)而抑制1表達(dá)，從而降低癌細(xì)胞甘油三酯(TG)和膽固醇含量，抑制前列腺癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝。在脂肪肝細(xì)胞中miR-138還可作為1上游調(diào)控因子，當(dāng)抑制miR-138-5p表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)1表達(dá)，加速脂肪酸β-氧化，降低脂肪含量，進(jìn)而改變肝脂肪變性進(jìn)程。此外，miR-138可以靶向調(diào)控脂肪生成關(guān)鍵酶(lipoprotein lipase)的活性，抑制脂肪源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化；還可靶向-1影響人間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程，進(jìn)而減少細(xì)胞脂滴沉積。本研究發(fā)現(xiàn)，在牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，過(guò)表達(dá)miR-138可顯著下調(diào)脂肪分化標(biāo)志基因和的表達(dá)(<0.01)，抑制脂肪細(xì)胞分化過(guò)程，進(jìn)而減少細(xì)胞脂質(zhì)沉積；抑制miR-138表達(dá)則可顯著上調(diào)、的表達(dá)水平(<0.05)，促進(jìn)細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積，此結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

miR-138常被視作為一種腫瘤抑制因子，可在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程抑制細(xì)胞的增殖能力；在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程中，miR-138可靶向結(jié)合6的3′UTR序列調(diào)節(jié)其mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖；還可通過(guò)抑制RhoC的表達(dá)抑制去分化軟骨細(xì)胞的分化和增殖。此外，miR-138也可作為circRNA的海綿(sponges)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附從而降低對(duì)牛成肌細(xì)胞的凋亡和分化的抑制作用，抑制細(xì)胞增殖；這些研究證明miR-138可對(duì)細(xì)胞增殖能力起到抑制調(diào)控。此外，miR-138還可對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)揮正向調(diào)控作用，如可靶向-1促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞線粒體去極化；在小鼠平滑肌細(xì)胞中，靶向1 3′ UTR促進(jìn)小鼠平滑肌細(xì)胞的增殖；這些研究成果證明，miR-138在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)和抑制miR-138可分別抑制和增強(qiáng)牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖活性(<0.05)，表明miR-138在抑制牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的同時(shí)，可抑制脂肪細(xì)胞增殖能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-138可使細(xì)胞阻滯于G1期，過(guò)表達(dá)miR-138后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白1、1，及細(xì)胞增殖標(biāo)志基因67顯著下調(diào)。而抑制miR-138后，1和67顯著上調(diào)。表明miR-138在前體脂肪細(xì)胞中可通過(guò)影響細(xì)胞周期和增殖相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞增殖，但其具體作用機(jī)制有待深入研究。

-1(過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α)是細(xì)胞線粒體生物合成與功能發(fā)揮的關(guān)鍵因子，可調(diào)控線粒體基因和線粒體蛋白的表達(dá)，參與調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝平衡和生物時(shí)鐘穩(wěn)態(tài)等多種生理進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-138可特異性結(jié)合-1的3′UTR序列，下調(diào)其mRNA表達(dá)水平，并抑制前體脂肪細(xì)胞脂滴積累，結(jié)果暗示，miR-138可能是通過(guò)靶向-1影響前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝過(guò)程，進(jìn)而降低細(xì)胞脂質(zhì)沉積。此外，-1作為脂肪分化標(biāo)志基因的共激活因子，上調(diào)-1的表達(dá)水平可增強(qiáng)的表達(dá)，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化；而下調(diào)-1的表達(dá)水平可抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化并降低膠原蛋白的釋放；有研究發(fā)現(xiàn)，-1還在骨骼干細(xì)胞向成骨或成脂細(xì)胞分化過(guò)程中扮演著調(diào)控開(kāi)關(guān)的角色；在小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化抑制改善后，細(xì)胞-1表達(dá)水平也顯著增加；這些研究結(jié)果表明-1的表達(dá)與細(xì)胞分化過(guò)程密切相關(guān)。本研究中過(guò)表達(dá)miR-138同時(shí)顯著降低了的表達(dá)水平，抑制miR-138的表達(dá)則相反的促進(jìn)的表達(dá)，因此推測(cè)，miR-138在前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，可能是通過(guò)特異性調(diào)控-1的表達(dá)，進(jìn)而影響的激活，從而抑制牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化和脂滴形成。

PTPN11是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族成員之一，被報(bào)道可作為胰島素作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與肥胖及糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、分化、遷移和黏附等生命過(guò)程；11編碼蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP-2)，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中可通過(guò)抑制AKT的磷酸化和Cyclin D1的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖分化水平。突觸體相關(guān)蛋白-25(SNAP25)屬于可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感的融合蛋白附著蛋白受體(SNARE)家族成員，對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及谷氨酰胺代謝過(guò)程具有調(diào)控作用，還可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的分化。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-138可影響11和25的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果暗示miR-138對(duì)牦牛前體脂肪細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控作用，可能與25和11的表達(dá)有關(guān)，這也為揭示miR-138在動(dòng)物脂肪生成過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供了研究方向。

4 結(jié) 論

本研究證明了miR-138可抑制牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化及增殖，減少胞內(nèi)脂滴沉積；進(jìn)一步試驗(yàn)表明miR-138可通過(guò)靶向-1參與肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的增殖分化調(diào)控。本研究為闡明miR-138對(duì)動(dòng)物脂肪生成的調(diào)控機(jī)制提供了數(shù)據(jù)參考，為牦牛肉品質(zhì)的改善奠定了基礎(chǔ)。