可變剪接體WNT4-β對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖和激素分泌的影響

王 鵬，韓海銀，李文韜，劉子嶷，儲(chǔ)明星，劉玉芳*

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056021；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

低產(chǎn)羔數(shù)是制約肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因之一，影響產(chǎn)羔數(shù)的決定因素是排卵數(shù)和卵泡發(fā)育。顆粒細(xì)胞作為雌性動(dòng)物卵巢組織的主要功能細(xì)胞，在卵泡發(fā)育過(guò)程中起重要作用。顆粒細(xì)胞增殖可以促進(jìn)卵泡發(fā)育，凋亡則引發(fā)卵泡閉鎖。從原始卵泡的激活開(kāi)始，直至生長(zhǎng)發(fā)育成熟為優(yōu)勢(shì)卵泡或閉鎖的過(guò)程中，顆粒細(xì)胞通過(guò)分泌類固醇激素和生長(zhǎng)因子支持卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)這一過(guò)程的影響尤為重要。因此，顆粒細(xì)胞增殖影響卵泡發(fā)育和閉鎖的生物學(xué)機(jī)制一直備受研究人員的關(guān)注。近年來(lái)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在顆粒細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用成為人們研究的熱點(diǎn)。無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族(Wnt family member，WNT蛋白家族)是高度保守的信號(hào)分子，在真核生物中均有存在，通過(guò)編碼分泌的脂蛋白和糖蛋白在Wnt/β-catenin傳導(dǎo)途徑中起重要作用，其廣泛參與哺乳動(dòng)物原始卵泡的形成、卵泡成熟與閉鎖過(guò)程。無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員4(Wnt family member 4，WNT4)是研究最廣泛的WNT家族原型配體之一，可通過(guò)分泌細(xì)胞外信號(hào)因子在各種器官和細(xì)胞的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。在小鼠中，4參與卵巢發(fā)育，雌性小鼠4表達(dá)缺失導(dǎo)致XX性腺的雄性化，而雄性過(guò)表達(dá)4則破壞睪丸血管和睪丸丙酮的合成，4過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)睪丸系統(tǒng)和睪酮合成。在人體中，4調(diào)控女性卵巢發(fā)育并阻止睪丸的形成，影響性別分化。4在顆粒細(xì)胞中高度表達(dá)，并通過(guò)Wnt/β-catenin傳導(dǎo)途徑參與卵巢發(fā)育、顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞成熟的過(guò)程。此外，4 還通過(guò)Wnt/β-catenin傳導(dǎo)途徑參與了腎、腎上腺、乳腺和生殖系統(tǒng)的形成，從而影響哺乳動(dòng)物的器官生長(zhǎng)和細(xì)胞分化等。卵巢排卵是一個(gè)多步驟的過(guò)程，排卵數(shù)作為影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的重要指標(biāo)之一，受多種因素調(diào)控影響。顆粒細(xì)胞是卵泡發(fā)育的主要組成部分，也是卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的重要影響因素。本課題組在前期的云上黑山羊高、低產(chǎn)羔數(shù)卵巢組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)，4存在兩個(gè)可變剪接體4-α和4-β，4-α作為調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵巢組織和控制顆粒細(xì)胞生理作用的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，在卵巢排卵的過(guò)程中發(fā)揮作用，但可變剪接體4-β對(duì)山羊顆粒細(xì)胞的影響還未見(jiàn)報(bào)道，推測(cè)4-β可變剪接體可能通過(guò)影響顆粒細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響山羊排卵。

本研究以山羊顆粒細(xì)胞為試驗(yàn)材料，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)或干擾4-β后WNT信號(hào)通路中關(guān)鍵標(biāo)記因子及顆粒細(xì)胞增殖標(biāo)記基因的表達(dá)，并通過(guò)鑒定顆粒細(xì)胞增殖速率、類固醇激素分泌進(jìn)一步驗(yàn)證4-β可變剪接體在山羊顆粒細(xì)胞中的功能及調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)

從河北省廊坊市周邊屠宰場(chǎng)獲得山羊新鮮卵巢組織，置于37 ℃生理鹽水(含2%雙抗)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。75%酒精潤(rùn)洗消毒后，預(yù)熱生理鹽水(含1%雙抗)清洗3次。10 mL注射器抽取直徑2～6 mm卵泡的卵泡液，1 800 r·min離心5 min去上清，加入含有10% 胎牛血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)基重懸后1 500 r·min離心5 min去上清，重復(fù)2次。接種在5 cm培養(yǎng)皿中于CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37 ℃、5% CO、飽和濕度)。顆粒細(xì)胞密度達(dá)70%后轉(zhuǎn)入10 cm培養(yǎng)皿相同條件培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

細(xì)胞RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基、含EDTA 的胰酶、PBS 緩沖液、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素、Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、Opti-MEM試劑購(gòu)自Gibco；PrimeScriptRTReagent Kit 試劑購(gòu)自TaKaRa；多聚賴氨酸、無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；Trizol、山羊血清、4%多聚甲醛、全蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCA)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(中國(guó))；SYBR Green qPCR Mix 購(gòu)自Thermo；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒(CCK8)購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；熒光IgG購(gòu)自長(zhǎng)春賽信生物公司；山羊雌二醇(E)檢測(cè)和山羊孕酮(P)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；SDS-PAGE電泳液、Western轉(zhuǎn)膜液、Western 洗滌液、QuickBlockWestern封閉液、10%的SDS-PAGE凝膠、QuickBlockWestern抗體稀釋液、PVDF 膜和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)公司；WNT4-β抗體購(gòu)自Santa；β-catenin抗體購(gòu)自Abmart；GAPDH、Cyclin-D2、CDK4 和IgG抗體均購(gòu)自Proteintech；其他均為常規(guī)化學(xué)試劑。

1.3 細(xì)胞免疫熒光染色

山羊卵泡顆粒細(xì)胞以1×10個(gè)·孔的密度接種于6孔板，每組3個(gè)重復(fù)。多聚賴氨酸處理爬片，置入6孔板中，36 h后取出。4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，每次3 min， 10%山羊血清孵育30 min，適量WNT4-β抗體4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min，適量熒光IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI避光加入染細(xì)胞核5 min，PBS洗滌4次，每次5 min。熒光淬滅劑處理，樹(shù)脂膠密封載玻片，熒光倒置顯微鏡(Olympus)(萊卡，德國(guó))觀察采集圖像。

1.4 表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的山羊4-β CDS區(qū)序列，設(shè)計(jì)相關(guān)引物以擴(kuò)增CDS區(qū)序列的基因片段，使用載體為pIRES2-EGFP，同時(shí)合成pIRES2-EGFP-4-β、pIRES2-EGFP-4-β NC；si-4-β、si-4-β NC由RNAi軟件設(shè)計(jì)。載體均由上海生工生物科技有限公司(中國(guó))合成。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前將山羊卵泡顆粒細(xì)胞以1×10個(gè)·孔的密度接種于6孔板(每組3個(gè)重復(fù))，每孔2 mL DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%的CO飽和濕度條件下培養(yǎng)。取230 μL Opti-MEM與濃度為200 nmol·L的pIRES2-EGFP-4-β(過(guò)表達(dá)組)、pIRES2-EGFP-4-β NC(過(guò)表達(dá)對(duì)照組)、si-4-β(干擾組)、si-4-β NC(干擾對(duì)照組)各20 μL低速旋渦混勻。加入244 μL Opti-MEM和6 μL Lipofectamine2000組成脂質(zhì)體，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。室溫孵育20 min；轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞，每孔加入1.5 mL Opti-MEM，置于37 ℃，5% CO飽和濕度條件下培養(yǎng)，6 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞與上清。

1.6 RNA提取及RT-qPCR

收集轉(zhuǎn)染48 h后的顆粒細(xì)胞，根據(jù)組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR。RT-qPCR在20 μL的體積中進(jìn)行，包含0.8 μL濃度為10 μmol·μL的引物，10 μL SYBR Green qPCR，2.0 μL 50 ng·μL的cDNA，其余部分為ddHO。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。山羊19被用作參考基因進(jìn)行校正。結(jié)果采用相對(duì)模板量算法(2-ΔΔ法)處理，基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔ表示。RT-qPCR引物的序列見(jiàn)表1，所用引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 RT-qPCR的引物信息Table 1 Primer information for RT-qPCR

1.7 蛋白提取及Western blot檢測(cè)

使用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞的總蛋白，收集轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-4-β(過(guò)表達(dá)組)、pIRES2-EGFP-4-β NC(過(guò)表達(dá)對(duì)照組)、si-4-β(干擾組)、si-4-β NC(干擾對(duì)照組)的顆粒細(xì)胞，在4 ℃條件下1 500 r·min離心5 min，棄上清，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，勻漿后裂解30 min，每15 min震蕩1次，在4 ℃條件下12 000 r·min離心30 min，收集上清。根據(jù)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCA)說(shuō)明書(shū)測(cè)定BCA曲線。按照1∶4加入5×SDS Loading Buffer，混勻后金屬水浴鍋100 ℃煮10 min，蛋白分裝后保存于-80 ℃。

蛋白質(zhì)變性后，取30 μg蛋白上樣于10%的SDS-PAGE凝膠上，電泳，80 V 15 min，120 V 60 min。電泳結(jié)束后將10%的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，150 mA 60 min，抗體(WNT4-β、GAPDH、cyclin-D2和CDK4均按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌5次，每次5 min。二抗(1∶1 000)室 溫孵育1 h，特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Odyssey CLX成像系統(tǒng)(Li-COR)曝光，拍照并保存。使用Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與GAPDH灰度值的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 顆粒細(xì)胞增殖檢測(cè)

以每孔2×10/100 μL的密度將轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-4-β(過(guò)表達(dá)組)、pIRES2-EGFP-4-β NC(過(guò)表達(dá)對(duì)照組)、si-4-β(干擾組)、si-4-β NC(干擾對(duì)照組)的顆粒細(xì)胞接種到96孔板中，每組3個(gè)重復(fù)，在37 ℃、5% CO飽和濕度條件下預(yù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)說(shuō)明書(shū)，分別在細(xì)胞生長(zhǎng)0、6、12、24、48和72 h時(shí)每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm的吸光度，觀察顆粒細(xì)胞增殖情況。

1.9 激素水平檢測(cè)

按照雌二醇(E)和孕酮(P)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后的細(xì)胞培養(yǎng)液中雌二醇(E)和孕酮(P)濃度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)制造商協(xié)議，在酶標(biāo)板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔各3個(gè)。加入40 μL轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-4-β(過(guò)表達(dá)組)、pIRES2-EGFP-4-β NC(過(guò)表達(dá)對(duì)照組)、si-4-β(干擾組)、si-4-β NC(干擾對(duì)照組)后的細(xì)胞上清液，每組3個(gè)重復(fù)。然后加入10 μL的待測(cè)樣品。棄去液體，搖干，用洗滌液注入每個(gè)孔，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。除空白孔外，每孔加入50 μL的酶標(biāo)試劑。用密封膜密封平板，37 ℃ 孵育30 min。棄去液體，搖干，向每孔注入洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。在每孔中加入50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，輕輕搖動(dòng)混合，37 ℃避光顯影15 min。向每個(gè)孔中加入50 μL終止液以終止反應(yīng)。在450 nm處依次測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，使用SPSS 18.0 (SPSS INC. Chicago，IL，USA) 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。**<0.01和*<0.05代表組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 WNT4-β在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)

為了驗(yàn)證4-β的表達(dá)位置，對(duì)采集到的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示(圖1)，在卵母細(xì)胞中未檢測(cè)到4-β的表達(dá)(圖1A, B, C)；在顆粒細(xì)胞中，檢測(cè)到4-β的表達(dá)，且大部分在細(xì)胞膜上表達(dá)，4-β定位染色包圍DAPI細(xì)胞核定位染色(圖1D, E, F)。表明WNT4-β的蛋白表達(dá)位置在顆粒細(xì)胞。所以在之后的研究過(guò)程中選擇顆粒細(xì)胞進(jìn)行4-β功能的驗(yàn)證。

圖1 WNT4-β在山羊卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的定位(200×)Fig.1 Localization of WNT4-β in goat oocytes and granulosa cells (200×)

2.2 過(guò)表達(dá)或干擾WNT4-β對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響

為探究4-β對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響，對(duì)顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)和干擾4-β載體，檢測(cè)4-β和顆粒細(xì)胞增殖標(biāo)記基因cyclin-D2與CDK4的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)4-β后，4-β和顆粒細(xì)胞增殖標(biāo)記因子-D2與4基因mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著上調(diào)(<0.01，圖2A, C)。WNT4-β、cyclin-D2與CDK4的蛋白水平顯著升高(<0.05，圖2E, G)。干擾4-后，WNT4-β和顆粒細(xì)胞增殖標(biāo)記因子cyclin-D2與CDK4基因mRNA表達(dá)量與蛋白表達(dá)相比均顯著降低(<0.05，圖2B, D, F, H)。使用CCK-8檢測(cè)顆粒細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)4-β后，顆粒細(xì)胞增殖速率顯著上調(diào)(<0.05，圖2I)。干擾4-β后，顆粒細(xì)胞增殖速率顯著下調(diào)(<0.05，圖2I)。表明4-β基因能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)顆粒細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用。

A.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-WNT4-β后， WNT4-β mRNA表達(dá)量；B. 轉(zhuǎn)染si-WNT4-β后，WNT4-β mRNA表達(dá)量；C、E、G.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-WNT4-β后， cyclin-D2和CDK4 mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平；D、F、H.轉(zhuǎn)染si-WNT4-β后， cyclin-D2和CDK4 mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平；I. CCK-8檢測(cè)顆粒細(xì)胞增殖。**.P<0.01；*.P<0.05，下同A. WNT4-β mRNA expression after transfection with pIRES2-EGFP-WNT4-β; B.WNT4-β mRNA expression after transfection with si-WNT4-β; C,E,G. cyclin-D2 and CDK4 mRNA and protein expression levels after transfection with pIRES2-EGFP-WNT4-β; D,F,H.cyclin-D2 and CDK4 mRNA and protein expression levels after transfection with si-WNT4-β; I.CCK-8 assay of granulocyte proliferation. **.P<0.01; *. P < 0.05,the same as below圖2 過(guò)表達(dá)或干擾WNT4-β對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of overexpression or interference of WNT4-β on the proliferation of granulosa cells

2.3 過(guò)表達(dá)或干擾WNT4-β對(duì)顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌的影響

通過(guò)ELISA檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾4-β后的顆粒細(xì)胞中雌二醇(E)和孕酮(P)的水平來(lái)觀察顆粒細(xì)胞的類固醇激素分泌。結(jié)果表明(圖3)，過(guò)表達(dá)4-β后，與對(duì)照組相比，雌二醇(E)的含量顯著升高(<0.05，圖3A)，孕酮(P)的含量也升高，但是不顯著(圖3C)；干擾4-β后，與對(duì)照組相比，雌二醇(E)和孕酮(P)的水平均顯著降低(<0.05，圖3B, D)。結(jié)果說(shuō)明，4-β對(duì)山羊顆粒細(xì)胞激素分泌具有促進(jìn)作用。

A、B.顆粒細(xì)胞中雌二醇(E2)水平；C、D.顆粒細(xì)胞中孕酮(P4)水平A,B. Estradiol (E2) level in granulosa cells; C,D. Progesterone (P4) level in granulosa cells圖3 過(guò)表達(dá)或干擾WNT4-β對(duì)顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌的影響Fig.3 Effect of overexpression or interference of WNT4-β on steroid hormone secretion in granulosa cells

2.4 過(guò)表達(dá)或干擾WNT4-β對(duì)WNT信號(hào)通路的影響

為探究顆粒細(xì)胞增殖過(guò)程中4-β對(duì)WNT信號(hào)通路的影響，在顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)和干擾4-β載體，檢測(cè)WNT信號(hào)通路標(biāo)記基因1與的mRNA表達(dá)及關(guān)鍵信號(hào)因子β-catenin的蛋白水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)4-β后，WNT信號(hào)通路相關(guān)的1與基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(<0.05，圖4A)。WNT信號(hào)通路關(guān)鍵因子β-catenin蛋白水平顯著升高(<0.05，圖4C,E)。而干擾4-β后，1與的mRNA相對(duì)表達(dá)量及β-catenin的蛋白水平與過(guò)表達(dá)4-β的顆粒細(xì)胞結(jié)果完全相反，與對(duì)照組相比，均顯著下調(diào)(<0.05，圖4B、D,F)。表明4-β能夠影響WNT信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)因子的表達(dá)，進(jìn)而造成WNT信號(hào)通路的調(diào)控發(fā)生改變。并且說(shuō)明4-β可以通過(guò)正向調(diào)控WNT信號(hào)通路，引起顆粒細(xì)胞增殖。

A、B. WNT信號(hào)通路關(guān)鍵基因ROA1和RHOA mRNA相對(duì)表達(dá)量；C、D. Western blot檢測(cè)WNT信號(hào)通路關(guān)鍵因子β-catenin的蛋白表達(dá)水平；E、F. β-catenin的蛋白表達(dá)水平灰度值分析A，B. Relative expression of ROA1 and RHOA mRNA, key genes in WNT signaling pathway; C，D. Protein expression levels of β-catenin, a key factor in WNT signaling pathway detected by Western blot; E,F. Gray scale analysis of protein expression levels of β-catenin圖4 過(guò)表達(dá)或干擾WNT4-β對(duì)WNT信號(hào)通路的影響Fig.4 Effect of overexpression or interference of WNT4-β on WNT signaling pathway

3 討 論

山羊產(chǎn)羔數(shù)是低遺傳力繁殖性狀，受繁殖周期、排卵、激素分泌、受精等多重因素影響。近年來(lái)，WNT信號(hào)通路相關(guān)基因?qū)Σ溉閯?dòng)物繁殖力的調(diào)控作用逐漸引起了人們的關(guān)注。有研究報(bào)道，2a和11在小鼠卵巢中可通過(guò)誘導(dǎo)WNT信號(hào)促進(jìn)卵泡發(fā)育及顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)。4和G蛋白偶聯(lián)受體主要在顆粒細(xì)胞中結(jié)合，在卵巢排卵過(guò)程中起重要作用。在子宮內(nèi)膜異位癥女性的顆粒細(xì)胞周期研究中，發(fā)現(xiàn)4和5a的轉(zhuǎn)錄水平嚴(yán)重影響著β-catenin的總量，進(jìn)而影響卵泡成熟。在小鼠中，發(fā)現(xiàn)4在卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖和分化中起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)前期對(duì)高、低產(chǎn)云上黑山羊全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，4-β可變剪接體可能對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，這一結(jié)果與其他WNT家族基因在卵巢中作用的研究結(jié)果相似，但具體影響機(jī)制還值得探究。

顆粒細(xì)胞的發(fā)育先于卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞是影響原始卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素。在卵泡成熟過(guò)程中，F(xiàn)SH誘導(dǎo)cyclin-D2，并通過(guò)激活CDK4促進(jìn)卵母細(xì)胞G1分裂進(jìn)程，進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞增殖。過(guò)量氟化物誘導(dǎo)小鼠應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致2、4、和67表達(dá)水平顯著降低進(jìn)而抑制卵巢卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究中， 過(guò)表達(dá)4-β可以顯著上調(diào)-2與4的表達(dá)水平，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。干擾4-β則顯著下調(diào)了cyclin-D2與4的表達(dá)水平。推測(cè)4-β可能通過(guò)促進(jìn)cyclin-D2與4的表達(dá)，進(jìn)而加快顆粒細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。卵泡作為卵巢的基本單位，由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞等組成，周圍有眾多顆粒細(xì)胞和卵泡母細(xì)胞包裹。在卵泡成熟過(guò)程中，卵泡會(huì)經(jīng)歷不同的生理變化，這些變化導(dǎo)致顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)供給和細(xì)胞交流方面聯(lián)系更加密切。研究表明，雌二醇通過(guò)不同的代謝途徑進(jìn)行糖酸基化和甲基化作用，哺乳動(dòng)物產(chǎn)生雌二醇的濃度越高，則體內(nèi)的卵泡成熟數(shù)量則越多。將雙酚A注入多囊卵巢綜合征的患者體內(nèi)，會(huì)減少顆粒細(xì)胞中的芳香化酶表達(dá)，從而減少雌二醇分泌，影響卵泡發(fā)育。并且敲除雌二醇合成關(guān)鍵酶19后，小鼠的雌二醇分泌量顯著下降，從而導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻。此外，孕酮也是評(píng)價(jià)卵泡生長(zhǎng)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，其分泌量多少直接影響著排卵及卵子的質(zhì)量。在單側(cè)去除卵巢的大鼠中發(fā)現(xiàn)，卵巢血液中孕酮分泌量減少，排卵數(shù)減少。而在少數(shù)家養(yǎng)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，WNT信號(hào)通路在卵泡生長(zhǎng)和類固醇生成的過(guò)程中起重要作用。WNT信號(hào)通路利用WNT/β-catenin途徑的小分子拮抗作用，影響著類固醇激素的合成。本研究結(jié)果表明， 過(guò)表達(dá)4-β提高了顆粒細(xì)胞E和P的分泌，而干擾4-β則顯著抑制了E和P的分泌。這表明，4-β可以通過(guò)調(diào)控顆粒細(xì)胞合成類固醇激素，進(jìn)而影響卵泡細(xì)胞的發(fā)育。而4-β通過(guò)何種途徑造成顆粒細(xì)胞增殖并影響類固醇激素的合成還不得而知。研究表明，WNT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、分化等方面發(fā)揮著重要作用。在小鼠中，1通過(guò)激活Wnt /β-catenin信號(hào)通路來(lái)維持卵泡中顆粒細(xì)胞的早期存活；在豬的高通量測(cè)序中發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-31-5p靶向4卵泡生長(zhǎng)，通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和孕酮的合成。在顆粒細(xì)胞增殖過(guò)程中，β-catenin調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，與Dvl-ROHA軸和RAC1軸結(jié)合進(jìn)而實(shí)現(xiàn)各種功能。本研究證明，過(guò)表達(dá)4-β提高了和1 的mRNA表達(dá)量及β-catenin的蛋白表達(dá)水平，這表明4-β通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)與Dvl-ROHA軸和RAC1軸結(jié)合進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞增殖。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，4-β對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖有顯著影響。4-β可以通過(guò)調(diào)控WNT信號(hào)通路影響山羊顆粒細(xì)胞增殖及類固醇激素的分泌，表明4-β具有調(diào)控山羊顆粒細(xì)胞增殖的功能，為進(jìn)一步揭示4調(diào)控山羊顆粒細(xì)胞增殖的潛在分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。