楊 洋，謝黎卿，胡 沛，高麗旭，袁 祥，李 攀，彭遠義，李能章

(西南大學動物醫(yī)學院，重慶 400715)

多殺性巴氏桿菌是一種革蘭陰性短小桿菌，自1880年巴斯德首次從患病的禽體內分離鑒定以來，發(fā)現(xiàn)該菌能感染幾乎所有家禽、家畜及多種野生動物，引起如牛出血性敗血癥、豬肺疫、禽霍亂和兔巴氏桿菌病等多種動物疾病，每年給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。該菌也可感染人，主要通過犬貓抓咬的傷口感染，危害健康。多殺性巴氏桿菌可作為共生菌，常定植于動物口腔及鼻咽等部位，在各種應激或其他病原感染條件下大量增殖，進而侵染組織臟器引發(fā)各種疾病。

多殺性巴氏桿菌可分為5種莢膜血清型(A、B、D、E和F)和16種LPS血清型，不同血清型導致的疾病特點及病理變化差異顯著，各血清型間交叉免疫保護性差。當前，商品化多殺性巴氏桿菌疫苗主要針對的是牛出血性敗血癥、豬肺疫、禽霍亂及兔巴氏桿菌病等單一血清型感染類疾病，各疫苗間交叉保護性弱，缺乏針對多種血清型的通用型疫苗。目前，針對多殺性巴氏桿菌交叉免疫保護性疫苗的研究，主要集中在單一抗原篩選方面。

Homchampa等發(fā)現(xiàn)，基因缺失能增強部分A型多殺性巴氏桿菌菌株的交叉免疫保護性，Boyce和Adler也發(fā)現(xiàn)，與基因缺失，均可導致B型多殺性巴氏桿菌莢膜缺失，毒力減弱及相關免疫保護特性變化。以上研究表明，多殺性巴氏桿菌某些基因的缺失能賦予缺失株交叉免疫保護特性。莢膜是多殺性巴氏桿菌重要毒力因子，與多殺性巴氏桿菌的宿主特異性、致病性、免疫保護性及感染導致的發(fā)病類型密切相關。已報道多個基因參與調控多殺性巴氏桿菌莢膜產(chǎn)生，但不同基因調控的莢膜缺失賦予菌株的免疫特性有很大的差異。目前研究發(fā)現(xiàn)的基因缺失菌株，其交叉免疫保護性并不強。本研究選擇了與A型多殺性巴氏桿菌莢膜多糖合成有關的基因，通過構建缺失株及回補株，探討該基因對多殺性巴氏桿菌的莢膜產(chǎn)生、生物膜形成、生長繁殖及毒力的影響，以及該基因的缺失對菌株交叉免疫保護性的影響，以期進一步為多殺性巴氏桿菌致病機制及疫苗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、菌株及質粒

雌性昆明小鼠(6～8周齡，體重20～22 g)購自恩斯維爾實驗動物中心，飼養(yǎng)及試驗方式受西南大學實驗動物倫理審查委員會監(jiān)督(Permit Number: IACUC-20200803-01)。牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5)、牛源F型多殺性巴氏桿菌(PmF)、禽源A型多殺性巴氏桿菌(PmQ)及兔源A型多殺性巴氏桿菌(PmR)均由西南大學動物醫(yī)學院預防獸醫(yī)學實驗室分離并暫存；牛源B型多殺性巴氏桿菌(PmB，CVCC470)及豬源A型多殺性巴氏桿菌(PmP，CVCC1662)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；DH5α 和BL21(DE3) 感受態(tài)細胞購自北京博邁德生物技術有限公司。用于基因缺失的質粒pUC19oriKan為實驗室前期構建保藏，質粒pMc-Express由四川農(nóng)業(yè)大學曹三杰教授饋贈。

1.2 主要試劑

馬丁氏肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；抗生素(卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素)、Stains all粉末(7423-31-6)、結晶紫(548-62-9)及吐溫20均購自上海生工生物工程股份有限公司；細菌基因組提取試劑盒(DP302-02)及反轉錄試劑盒(KR118-02)購自天根生物科技有限公司；限制性核酸內切酶(I、I、H I 及d III)購自TaKaRa；In-FusionHD Cloning Kit (PT5162-1)購自Clontech；弗氏完全及不完全佐劑購自Sigma公司；羊抗鼠IgG-HRP、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A ELISA檢測試劑盒購自Thermo Scientific公司；0.4%臺盼藍染液、TritonX-100購自Solarbio；15 A VG礦物油乳化劑為重慶澳龍生物制品有限公司贈送；TMB顯色液(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)購自Beyotime公司；細胞RNA提取試劑盒(RE-03111)購自福際生物技術有限公司；細菌RNA提取試劑盒(TR214-50)購自天漠生物。

1.3 基因缺失株及其回補株的構建

本研究選擇野生株PmCQ2進行基因缺失株的構建。缺失株構建采用同源重組方法，具體方法參考Tatum等的研究。同源重組質粒采用實驗室前期構建的多殺性巴氏桿菌基因缺失溫敏型載體pUC19oriKan，通過溫度篩選陽性克隆，最終構建無抗性Marker缺失株。構建缺失株及回補株所用引物見表1。取-80 ℃ 保藏的PmCQ2劃線接種馬丁固體平板，37 ℃ 倒置培養(yǎng)24 h，挑取3～4個菌落接種5 mL馬丁液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min震蕩培養(yǎng)8 h，離心收集菌體，提取基因組DNA備用。以基因組DNA為模板，分別以上、下游同源臂5′ARM-F/5′ARM-R和3′ARM-F/3′ARM-R引物擴增上、下游同源臂DNA片段。以純化的上、下游同源臂DNA片段為模板，采用5′ARM-F和3′ARM-R引物繼續(xù)進行PCR擴增，獲取上下游同源臂融合DNA片段，與經(jīng)H I和d III雙酶切線性化的pUC19oriKan載體連接，連接產(chǎn)物轉化DH5α 感受態(tài)細胞，涂布含抗生素的LB平板(Kanamycin, 50 μg·mL)過夜培養(yǎng)，篩選獲得同源臂融合DNA片段重組載體。重組質粒經(jīng)電轉PmCQ2后，涂布含100 μg·mLKan馬丁氏肉湯培養(yǎng)基上，PCR初步篩選基因缺失菌株 Δ，進而采用qPCR及Western blot 方法，從轉錄和蛋白水平檢測 Δ中有無基因的轉錄表達，對驗證正確的缺失菌株，連續(xù)在無抗生素的馬丁肉湯培養(yǎng)基中傳代30次，保證Kan抗性消除和遺傳穩(wěn)定性。構建回補株時以pMc-Express質粒為模板，采用引物-F/R擴增出基因表達盒，與H I和d III雙酶切線性化的pUC19oriKan載體連接，獲得重組質粒pUC19oriKan-，經(jīng)I和I雙酶切回收骨架載體，獲不含基因的線性載體pUC19oriKan-d備用。以PmCQ2基因組DNA為模板，采用com-F/R引物擴增出完整基因片段，純化后連接到pUC19oriKan-d，轉化DH5α 感受態(tài)細胞，篩選獲得重組質粒pUC19oriKan-com，其后電轉化 Δ感受態(tài)細胞，篩選獲回補菌株C-，qPCR及Western blot方法檢測基因的轉錄表達。連續(xù)傳代30次保證其遺傳穩(wěn)定性。

表1 基因缺失株和回補株構建所需引物Table 1 Primers used for the construction of mutant and complementary strains

1.4 Anti-HyaD多克隆抗體的制備

制備HyaD多克隆抗體，通過Western blot方法，以此驗證基因缺失株及回補株中有無HyaD表達。制備方法簡單來說，以PmCQ2基因組DNA為模板，采用wb-F/R引物擴增基因缺失部分的一個片段，擴增產(chǎn)物連接到pET32a(+)，轉化DH5α感受態(tài)細胞，篩選獲得的重組質粒繼續(xù)轉化.BL21(DE3) 感受態(tài)細胞，陽性克隆按照實驗室前期方法進行蛋白誘導表達和純化。純化的重組蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1比例充分乳化混合，重組蛋白終濃度為0.5 μg·μL。小鼠背部皮下多點免疫(100 μL乳化液·只)，首免后14 d加強免疫1次，重組蛋白免疫量與首免一致，但佐劑為弗氏不完全佐劑；二免后14 d 尾靜脈采血，分離血清備用。

1.5 生長曲線測定

取-80 ℃ 保藏的PmCQ2、Δ、C-分別劃線接種馬丁固體平板，37 ℃ 倒置培養(yǎng)24 h，挑取3～4個菌落接種5 mL馬丁液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min震蕩培養(yǎng)10 h。菌液稀釋平板計數(shù)后，采用馬丁氏肉湯培養(yǎng)基稀釋各菌株培養(yǎng)液含菌量至2×10CFU·mL，其后按1∶100接種量轉接5 mL新鮮馬丁氏肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min震蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測定OD值，取8個時間點，繪制生長曲線。試驗每次設3個生物重復，重復3次。

1.6 莢膜多糖含量測定

莢膜多糖測定方法參照Chung等的研究。分別取1 mL PmCQ2、Δ及C-對數(shù)生長期培養(yǎng)液，13 000 r·min離心10 min，去上清，菌體用PBS 洗滌2次，其后用1 mL PBS重懸菌體，42 ℃處理1 h(處理前后分別取5 μL進行平板計數(shù))，菌懸液13 000 r·min離心10 min，取100 μL上清液，加入900 μL莢膜染色液(0.2 mg·mL的stains all粉末、50%甲酰胺和0.6%冰醋酸)振蕩混勻，同時配制透明質酸標準曲線溶液樣品(0、0.5、1、2、3、4、5 μg·(100 μL)透明質酸分別加入900 μL莢膜染色液)，采用酶標儀測定OD值，根據(jù)標準曲線計算各菌株細胞莢膜含量。試驗每次設5個生物重復，重復3次。

1.7 生物膜測定

生物膜測定參考Jin等的研究方法。取平板計數(shù)后的PmCQ2、Δ及C-對數(shù)生長期培養(yǎng)液，用腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基稀釋至菌含量為1×10CFU·mL，取稀釋菌液至48孔細胞培養(yǎng)板(400 μL·孔)，陰性對照為400 μL BHI肉湯培養(yǎng)基，混勻置37 ℃ 恒溫培養(yǎng)48 h。去培養(yǎng)液，PBS(200 μL·孔)輕柔清洗2次，室溫干燥，每孔加入200 μL甲醇室溫固定1 h，PBS輕柔清洗3次，室溫干燥，加入1 %結晶紫(200 μL·孔)，37 ℃ 染色30 min，PBS輕柔清洗3次，室溫晾干，最后加入33% 冰醋酸溶液(200 μL·孔)，37 ℃ 溶解30 min，采用酶標儀測定OD值。試驗每次設5個生物重復，重復3次。

1.8 半數(shù)致死量(LD50)測定

取馬丁肉湯培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Δ和C-平板計數(shù)后，按Δ(1.7×10、1.7×10、1.7×10、1.7×10、1.7×10CFU)和C-(3.4×10、3.4×10、3.4×10、3.4×10、3.4×10CFU)各5個梯度的菌，分別采用肌肉途徑攻毒小鼠(=10)，連續(xù)觀察1周。當小鼠瀕臨死亡時(精神沉郁、閉眼、食欲斷絕、外界刺激反應弱等)，實施安樂死，統(tǒng)計小鼠死亡數(shù)，采用bliss法計算半數(shù)致死量。

1.9 臟器細菌定殖和病理分析

分別取2.0×10CFU對數(shù)生長期PmCQ2、Δ及C-，左后腿肌肉途徑感染小鼠(=6)。攻毒后8、24 h分別取6只小鼠安樂死，采集肺、肝和脾稱量、勻漿、稀釋涂馬丁固體平板，檢測其含菌量。采集小鼠感染24 h肺，多聚甲醛固定后送里來佳諾生物科技有限公司做病理切片，HE染色分析。

1.10 細胞感染試驗

本細胞試驗主要分析野生株PmCQ2、Δ及 C-對小鼠腹腔巨噬細胞的黏附、抗吞噬及促炎能力的差異。方法參照實驗室前期研究。無菌采集小鼠腹腔巨噬細胞，制備成細胞懸液后按照1∶4的比例與0.4%的臺盼藍混合，細胞計數(shù)板計數(shù)后鋪于48孔細胞板(2×10細胞·孔)，置37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中，貼壁2 h后，去未貼壁細胞，添加新細胞培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期PmCQ2、Δ及 C-經(jīng)馬丁肉湯平板計數(shù)后，按1 MOI(multiplicity of infection)感染細胞，感染8 h后，去培養(yǎng)液，PBS清洗3次。每個菌取一半感染孔，分別加入100 μg·mL環(huán)丙沙星(500 μL·孔)處理30 min(殺死細胞外的菌，包括黏附菌)，PBS洗滌3次；另一半感染孔不加抗生素處理。其后，所有感染孔，每孔加入500 μL含0.1% TritonX-100的PBS溶液，充分裂解細胞，釋放出細胞中被吞噬細菌。取細胞裂解液分別進行平板菌落計數(shù)，測定各菌黏附的菌數(shù)及被細胞吞噬的菌數(shù)。試驗每次設5個生物重復，重復3次。

取6孔細胞板，每孔接種2×10個巨噬細胞，貼壁2 h后，分別感染1 MOI對數(shù)生長期PmCQ2、Δ及C-，感染8 h后，收集培養(yǎng)液，4 ℃、13 000 r·min離心10 min，取上清液，采用ELISA檢測試劑盒，分別檢測上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A等炎性因子。與此同時，收集各菌感染的巨噬細胞，提取總RNA，采用qRT-PCR方法，分別測定各菌感染的巨噬細胞中-、-1β、-6、-12p40和-17A等基因的轉錄情況。

1.11 HyaD調控相關基因表達分析

為分析HyaD參與調控其他基因表達情況，在此調查了其對菌株莢膜及生物膜產(chǎn)生、LPS合成及轉運、鐵轉運相關及保護性抗原等相關基因表達的影響。分別取PmCQ2、Δ及C-菌株對數(shù)生長期培養(yǎng)液，4 ℃、13 200 r·min離心2 min，收集菌體，采用細菌RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉錄合成cDNA。相關檢測基因及引物見表2，qRT-PCR方法檢測各基因的表達。試驗設5個生物重復。

表2 qRT-PCR檢測基因所需引物Table 2 Primers required for gene detection by qRT-PCR

1.12 滅活苗的制備

滅活菌苗制備方法參考試驗前期研究。取PmCQ2株和Δ株種子液，按 1% 分別接種馬丁肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min恒溫震蕩培養(yǎng)12 h，對培養(yǎng)后的PmCQ2株和Δ株菌液，分別進行純粹性檢驗和活菌計數(shù)后濃縮，濃縮后分別加入終濃度為0.15% 的甲醛溶液，37 ℃ 靜置滅活24 h，期間每隔3 h適當振蕩使其充分滅活，其后，兩種菌各取100 μL處理液，分別涂布于馬丁固體培養(yǎng)基上，于37 ℃ 培養(yǎng)24 h 進行滅活檢驗。滅活檢驗合格后，將菌液和PBS分別與15 A VG礦物油佐劑按照4∶1體積比混合均勻，分別制成滅活菌苗和PBS乳化劑，使PmCQ2株和Δ株終濃度均為5×10CFU·mL。每種滅活苗各取100 μL涂布在馬丁固體平板上，于37 ℃ 培養(yǎng)24 h 進行無活菌檢驗。另選取6只小鼠，分別背部皮下接種100 μL滅活苗進行疫苗安全性評價。檢驗合格疫苗4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.13 疫苗交叉保護性測定

取雌性昆明小鼠(6～8周齡，體重20～22 g)270只，隨機分為27組，每組10只。按照表3進行疫苗免疫及攻毒分組。其中PmCQ2(1-9)、Δ(1-9)和PBS emulsifier(1-9)各為9個組。小鼠背部皮下多點注射疫苗，共免疫2次，首免后第14天進行加強免疫。首免第21天，分別以3.6×10CFU PmCQ1(LD=3.8×10CFU)、3.2×10CFU PmCQ2 (LD=3.43×10CFU)、4.6×10CFU PmCQ4(LD=2.1×10CFU)、2.9×10CFU PmCQ5 (LD=4.5×10CFU)、1.2×10CFU PmB (LD=5.0×10CFU)、4.4×10CFU PmF(LD=1.0×10CFU)、10 CFU PmQ (LD≈1 CFU)、10 CFU PmP (LD≈1 CFU)、2.2×10CFU PmR (LD=1.0×10CFU)等9株菌肌肉攻毒，攻毒后每天觀察2次，記錄小鼠臨床癥狀，瀕臨死亡實施安樂死，記錄小鼠死亡數(shù)量，連續(xù)記錄1周。疫苗保護率按以下公式計算：保護率(%)=(對照組死亡率-免疫組死亡率)/對照組死亡率×100。

表3 免疫分組和攻毒設計Table 3 Immunization grouping and challenge design

1.14 抗體效價分析

參照“1.13”小鼠免疫分組，共設定2個疫苗免疫組(PmCQ2及Δ)及1個PBS乳化劑免疫對照組和1個未免疫的空白對照組，每組6只小鼠，免疫方式及劑量參見表3，初免21 d尾靜脈采血，分離血清，ELISA方法檢測疫苗免疫各組特異性抗體水平(包被抗原分別為PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5、PmB、PmF、PmP、PmQ和PmR全菌蛋白)。

1.15 免疫后攻毒，肺病理變化分析

參照“1.13”小鼠免疫分組，設定2個疫苗免疫大組，PmCQ2(1-10)及Δ(1-10)，每種疫苗分為10個小組，每小組3只小鼠，免疫方式及劑量參見表3，初免第21天，其中9組分別感染PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5、PmB、PmF、PmP、PmQ、PmR等9種菌，感染劑量參照“1.13”，余下1組作未感染組對照。感染12 h后，所有小鼠實施安樂死，取肺組織送里來佳諾生物科技有限公司制做病理切片，HE染色分析。

1.16 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Graphpad Prism 6軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析處理，檢驗分析，>0.05為無顯著差異；<0.05、<0.01、<0.001、<0.000 1為差異顯著。

2 結 果

2.1 hyaD基因缺失株構建及其生物學特性

基因編碼UDP-GlcNAc轉移酶，根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中多殺性巴氏桿菌基因組數(shù)據(jù)分析，基因主要存在于A型和F型多殺性巴氏桿菌，1株B型多殺性巴氏桿菌中發(fā)現(xiàn)存在該基因，D和E型多殺性巴氏桿菌中未發(fā)現(xiàn)。A型多殺性巴氏桿菌中，、、等基因簇參與了莢膜多糖的合成轉運，但參與的具體作用仍不清楚。本研究選擇了一株已基因組測序的牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2菌株進行基因缺失，其基因全長2 919 bp，編碼972aa，根據(jù)氨基酸序列，分析預測其結構域位置，選擇缺失該基因的部分結構域(核酸序列區(qū)段：288～490 bp)。其上、下游同源臂擴增引物及缺失株驗證引物的設計位置如示意圖所示(圖1A)。上、下游同源臂融合連接到載體pUC19oriKan，轉化野生株PmCQ2感受態(tài)細胞，篩選獲得缺失株Δ，進而構建含完整基因的回補株質粒，轉化Δ感受態(tài)細胞，篩選獲得基因回補株C-。比較PmCQ2、Δ及C-，采用不同引物對進行PCR擴增，從基因水平驗證了所構建的Δ及C-的準確性，Δ中缺失了基因的部分片段，回補株中存在完整的基因(圖1B)，其后提取菌株RNA，采用qRT-PCR方法檢測各菌株中的轉錄本情況，結果發(fā)現(xiàn)，僅Δ中無轉錄本(圖1C)，進一步從蛋白水平檢測也發(fā)現(xiàn)僅缺失株中無HyaD蛋白表達(圖1D)，即從基因水平、轉錄水平和蛋白水平等3個方面驗證了所構建的Δ及C-的準確性。體外傳代30次后，Δ及C-遺傳性質穩(wěn)定。采用馬丁氏肉湯培養(yǎng)，Δ接種后4～8 h，生長明顯快于PmCQ2和C-，其后各菌株生長趨于一致(圖1E)。在馬丁氏肉湯平板上生長24 h后，Δ的菌落明顯小于PmCQ2的菌落，C-的菌落大小介于二者之間(圖1F)。Δ的生長菌落雖然變小，但其本身的生長速度與野生株并無顯著差異(圖1E)，這可能與其細胞的莢膜多糖含量有關，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，Δ的莢膜多糖含量顯著低于PmCQ2和C-(圖1G)。A型多殺性巴氏桿菌一般具有較厚的莢膜，在液體中不易離心沉降，而Δ因其莢膜多糖產(chǎn)生量降低，細胞因此變得極易離心和沉降(圖1H)。Petruzzi等發(fā)現(xiàn)，A型多殺性巴氏桿菌的莢膜多糖產(chǎn)生與其生物膜產(chǎn)生趨勢相反，莢膜多糖會抑制生物膜形成，莢膜多糖產(chǎn)生降低會促進生物膜的形成。測定Δ生物膜產(chǎn)生情況，結果發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生量顯著高于PmCQ2和C-(圖1I)，其莢膜多糖與生物膜的產(chǎn)生也是呈相反趨勢，與Petruzzi等研究結果一致。

A. 同源臂擴增及缺失株驗證引物設計示意圖；B. 野生株(PmCQ2)、缺失株(ΔhyaD)及回補株(C-hyaD)的PCR驗證，M. DNA marker；泳道1、4、7、10、13. PmCQ2；泳道2、5、8、11、14. ΔhyaD；泳道3、6、9、12、15. C-hyaD；C. hyaD 基因轉錄情況檢測；D. HyaD蛋白表達情況檢測；E. 生長曲線；F. 菌落形態(tài)；G. 莢膜多糖含量測定；H. 菌體靜置沉降及離心狀態(tài)；I. 生物膜含量測定。ns. 不顯著(P>0.05)，*. P <0.05，**. P <0.01，***. P <0.001，****. P <0.000 1。下同A. Schematic diagram of primers for homologous arm amplification and mutant verification; B. PCR confirmation of wild type(PmCQ2), mutant(ΔhyaD) and complementary strains(C-hyaD), M. DNA marker; Lane 1,4,7,10,13. PmCQ2 strain; Lane 2,5,8,11,14. hyaD mutant; Lane 3,6,9,12,15. C-hyaD; C. hyaD transcripts detected by qRT-PCR; D. HyaD protein detected by Western blot; E. Growth curve; F. Colony morphology; G. Capsular polysaccharide production; H. The status of bacterial cells sedimentation and centrifugation; I. Biofilm production. ns. No significant difference (P>0.05), *. P <0.05，**. P <0.01，***. P <0.001，****. P <0.000 1. The same as below圖1 hyaD基因缺失株及回補株的構建及其生物學特性測定Fig.1 Construction and characterization of hyaD mutant and complementary strain C-hyaD

2.2 hyaD基因缺失致使PmCQ2毒力下調

為探究基因缺失對多殺性巴氏桿菌PmCQ2毒力的影響，分別以2.0×10CFU的 PmCQ2、Δ和C-肌肉途徑攻毒小鼠，野生株PmCQ2感染小鼠在3 d內全部死亡，而Δ株感染小鼠 7 d內僅死亡1只，而C-感染小鼠在7 d以內全部死亡，死亡時間較PmCQ2滯后(圖2A)。感染后8和24 h，分別測定各菌株在臟器中的定殖量。感染相同劑量和相同時間條件下，野生株PmCQ2在各臟器中的定殖量最高，C-次之，Δ定殖量最低，各菌株間差異顯著，并隨感染時間延長各菌株定殖量有所升高(圖2B、2C)，測定各菌株感染24 h導致的小鼠肺部病理損傷發(fā)現(xiàn)，Δ引起肺病理損傷最輕(圖2D～F)。

A.生存曲線;B、C.臟器中細菌定殖測定; D～F.PmCQ2、ΔhyaD和C-hyaD感染小鼠肺組織HE染色(400×)A. Survival rates; B,C. Bacterial loads in infected mice organs; D-F. HE staining of lung of mouse infected with PmCQ2, ΔhyaD and C-hyaD, respectively (400×)圖2 PmCQ2、ΔhyaD及C-hyaD致病性比較分析Fig.2 Pathogenicity analysis of wild-type PmCQ2, hyaD mutant and C-hyaD

測定Δ和C-肌肉感染小鼠的半數(shù)致死量，Δ的LD為2.30×10CFU，約為野生株PmCQ2半數(shù)致死量(LD=3.43×10CFU)的6 700倍，而C-的LD為1.43×10CFU，約為PmCQ2的4倍(表4)，基因的回補，基本恢復了Δ菌株相關毒力，表明Δ毒力降低的確是受到了HyaD調控。

表4 ΔhyaD和C-hyaD 菌株半數(shù)致死量測定Table 4 Median lethal dose (LD50) of hyaD mutant and C-hyaD strain CFU

2.3 hyaD基因缺失促進細胞黏附吞噬及相關炎性因子的產(chǎn)生

前面試驗已經(jīng)證實，基因缺失會導致菌株莢膜含量降低及相關毒力顯著下降。莢膜能促進病原抗細胞吞噬能力，前期有研究發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌莢膜的缺失會促進細菌的細胞黏附能力，那么Δ感染細胞的情況如何？本試驗選用了小鼠腹腔巨噬細胞進行測試。采用同一劑量的PmCQ2、Δ和C-分別感染巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)Δ更易黏附于巨噬細胞表面(圖3A)，并且被吞噬的數(shù)量顯著高于PmCQ2和C-(圖3B)，C-黏附和被吞噬的數(shù)量介于PmCQ2和Δ之間(圖3A、3B)，結果進一步證實多殺性巴氏桿菌莢膜缺失會促進細菌的細胞黏附能力。進一步測定各菌株誘導巨噬細胞炎性因子產(chǎn)生情況，結果發(fā)現(xiàn)，與野生株PmCQ2和回補株C-比較，在RNA轉錄和蛋白分泌水平，缺失株Δ能顯著促進巨噬細胞-、-1β、-6、-12p40和-17A炎性基因的轉錄(圖3C～G)和TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40和IL-17A炎性因子的分泌(圖3H～L)，該結果表明，菌體黏附和被吞噬的越多，宿主細胞的相關炎性因子產(chǎn)生越高。有趣的是，PmCQ2與C-誘導炎性基因的轉錄本無顯著差異，然而在其炎性因子分泌水平方面卻差異顯著(圖3C～L)，這可能與轉錄本(半衰期短)是一個短時間累積結果，而分泌出的蛋白因子(半衰期長)是一個較長時間累積結果有關。

A. 黏附巨噬細胞的細菌數(shù)量測定；B. 巨噬細胞吞噬的細菌數(shù)量測定；C～G. 感染巨噬細胞炎癥相關基因表達情況；H～L. 感染巨噬細胞炎性因子分泌情況A. The number of bacteria attached to macrophages; B. The number of bacteria in macrophages; C-G. The expression of inflammatory genes in macrophages infected with 1MOI of PmCQ2, hyaD mutant and C-hyaD, respectively; H-L. Inflammatory factors secretion of macrophages infected with 1MOI of PmCQ2, hyaD mutant and C-hyaD, respectively圖3 巨噬細胞感染分析Fig.3 In vitro macrophage infection analysis

2.4 hyaD基因缺失對菌株其他基因表達的影響

基于Δ相關生物學特性變化，選擇分析了與莢膜多糖合成轉運、生物膜合成、鐵轉運、LPS合成轉運、毒力、保護性抗原等相關基因的表達差異。與PmCQ2和C-相比，Δ莢膜合成相關的、、、等基因顯著下調(圖4A～D)，與生物膜合成相關的、基因表達顯著上調(圖4E、F)，與鐵轉運相關的、基因表達顯著下調(圖4G、4H)，而與LPS合成與轉運相關的、、、基因表達呈顯著下調(圖4I～L)，與菌株毒力有關的0442、4基因表達也顯著下調(圖4M、4N)?？紤]到多殺性巴氏桿菌外膜蛋白與交叉保護性密切關系，分析比較了野生株與缺失株部分外膜蛋白基因的表達差異，結果發(fā)現(xiàn)，缺失株中大量外膜蛋白基因如、、、、、、、、、、、、、、、、、2等基因的表達顯著上調(圖4O)，包括已證實具有交叉免疫保護性的外膜蛋白如OmpH、PlpE等，這預示著Δ可能具有交叉保護特性。

A～D. 莢膜合成相關基因轉錄表達情況；E、F. 生物膜形成相關基因轉錄表達情況；G、H. 鐵轉運相關基因轉錄表達情況；I～L. LPS合成、轉運相關基因轉錄表達情況；M、N. 毒力相關基因Pm0442和plp4轉錄表達情況；O. 外膜蛋白相關基因轉錄表達情況A-D. The expression of capsular synthesis-related genes; E, F. The expression of biofilm formation-related genes; G, H. The expression of iron transportation-related genes; I-L. The expression of LPS synthesis- and transportation-related genes; M, N. The expression of virulence-associated genes Pm0442 and plp4; O. The expression of outer membrane protein genes圖4 hyaD基因缺失調控相關基因轉錄表達分析Fig.4 ΔhyaD influence other gene expression using qRT-PCR

2.5 hyaD基因缺失促進菌株交叉保護特性

依據(jù)前面試驗結果，基因缺失導致了多殺性巴氏桿菌莢膜多糖含量及外膜蛋白顯著變化，特別是與免疫保護性相關的一些蛋白表達顯著上升，預示著菌株可能具有了新的免疫保護特性。為檢測缺失株的免疫保護特性，分別制備了野生株PmCQ2和不同缺失株Δ滅活菌苗，比較二者對不同血清型和不同動物源多殺性巴氏桿菌的免疫保護性差異。以制備好的PmCQ2株和Δ株滅活疫苗分別免疫小鼠，觀察免疫小鼠精神狀態(tài)、食欲良好，背部皮下無明顯腫塊。免疫后21 d，尾靜脈采血，分離血清，以不同菌株細胞全蛋白作為包被抗原，ELISA檢測各血清中針對各菌株的特異性抗體水平。Δ株免疫小鼠血清中整體抗體水平(圖5A)均高于PmCQ2株免疫小鼠(圖5B)，抗牛源A型和B型多殺性巴氏桿菌的抗體水平顯著高于抗牛源F型和其他動物源多殺性巴氏桿菌的抗體水平(圖5A、5B)，由此可以看出疫苗株與各野生菌株間其交叉免疫抗原量的多少。

A. ΔhyaD株免疫小鼠抗體效價；B. PmCQ2株免疫小鼠抗體效價A. Antibody titers of mice immunized with hyaD mutant inactivated vaccine; B. Antibody titers of mice immunized with PmCQ2 inactivated vaccine圖5 免疫小鼠抗體產(chǎn)生情況Fig.5 Antibody generation of immunized mice

免疫小鼠經(jīng)尾靜脈采血后，肌肉途徑分別攻毒不同血清型和不同動物源多殺性巴氏桿菌菌株，Δ株滅活疫苗對牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5)和牛源B型多殺性巴氏桿菌PmB的免疫保護率達100%(圖6A～E)，對牛源F型多殺性巴氏桿菌PmF的保護率也達80%(圖6F)，對豬源A型多殺性巴氏桿菌PmP、禽源A型多殺性巴氏桿菌PmQ和兔源A型多殺性巴氏桿菌PmR的保護率也分別達100%、100%和90%(圖6G～I)；而PmCQ2株滅活苗除對牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5)的免疫保護率達80%以上(圖6A～D)，對牛源B型和F型多殺性巴氏桿菌的交叉免疫保護性弱，低于30%(圖6E、6F)，對兔源、禽源和豬源多殺性巴氏桿菌無交叉免疫保護作用(圖6G～I)。以上研究結果表明，基因缺失調控了菌株相關基因表達的改變，賦予了菌株新的交叉免疫保護特性。

A～I. 小鼠肌肉途徑免疫PmCQ2 和ΔhyaD疫苗，對照組注射PBS，免疫后第21天， 肌肉途徑分別感染PmCQ1(A)、PmCQ2(B)、PmCQ4(C)、PmCQ5(D)、PmB(E)、PmF(F)、PmP(G)、PmQ (H)和PmR(I)，記錄小鼠存活率，繪制各菌株感染小鼠生存曲線圖A-I. Mice were immunized with inactivated PmCQ2 and inactivated hyaD mutant, and injected with PBS as controls, and then challenged with PmCQ1(A), PmCQ2(B), PmCQ4(C), PmCQ5(D), PmB(E), PmF(F), PmP(G), PmQ(H) and PmR(I) at day 21 after primary immunization, respectively, record the survival mice number for the protective rate calculation圖6 疫苗交叉免疫保護性測定Fig.6 Cross-protection of inactivated PmCQ2 and inactivated hyaD mutant

為進一步比較Δ株與野生株PmCQ2滅活苗的免疫保護效果差異，分析疫苗免疫后感染的肺組織病理損傷后發(fā)現(xiàn)，Δ株免疫小鼠，在攻毒12 h后肺無明顯或輕微病理損傷(圖7)，而未免疫小鼠和野生株PmCQ2免疫小鼠的肺病理損傷較為嚴重，肺泡上皮細胞不同程度脫落，肺間質內較多炎性細胞浸潤(圖7)，表明Δ疫苗能顯著減輕毒株感染對臟器的損傷。PmCQ2滅活苗雖對野生株PmCQ2攻擊有100 % 免疫保護作用，但在受攻擊早期，免疫小鼠臟器還是會受到一定損傷，這種損傷程度可能與攻毒劑量與個體的保護性抗體水平有關。

小鼠免疫PmCQ2 和ΔhyaD疫苗后第21天，與未免疫小鼠一起，分別感染PmCQ1、PmCQ2、PmCQ4、PmCQ5、PmB、PmF、PmP、PmQ和PmR，感染后12 h，取肺組織HE染色Mice were immunized with inactivated PmCQ2 and inactivated hyaD mutant, and then challenged with PmCQ1, PmCQ2, PmCQ4, PmCQ5, PmB, PmF, PmP, PmQ and PmR at day 21 after primary immunization, the lungs were collected at 12 h post infection for the HE staining圖7 小鼠肺組織病理損傷分析(400×)Fig.7 Histopathological lesion analysis of mice lung (400×)

3 討 論

多殺性巴氏桿菌能引起多種動物疾病，包括禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、蹄類動物出血性敗血癥、牛羊地方性肺炎、兔鼻炎以及人類的傷口膿腫和腦膜炎(比較罕見)。根據(jù)NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中多殺性巴氏桿菌及相關文獻報道，在5種莢膜血清型多殺性巴氏桿菌中，A型多殺性巴氏桿菌幾乎能感染所有可感染多殺性巴氏桿菌的動物，可導致禽霍亂、肺炎、鼻炎、傷口膿腫等疾病，其臨床分離率最高；其次是B型和F型，B型常見感染豬、牛、羊，主要導致出血性敗血癥，F(xiàn)型常見感染兔和禽，偶有感染豬、牛的臨床株，有時從貓、狗口腔中也能分離出；D型主要感染豬和兔，E型可感染豬、牛、羊、駱駝等，主要導致動物出血性敗血癥，但D型和E型的臨床分離率相對較低。除按莢膜分型外，多殺性巴氏桿菌根據(jù)其菌體LPS進行分型，還可分為16種血清型，由此可以看出多殺性巴氏桿菌血清型的多樣性。不同血清型和不同動物來源的多殺性巴氏桿菌菌株致病性差異較大，相互交叉免疫保護性弱，這為多殺性巴氏桿菌疫苗的研究帶來了困難。目前，僅有的幾種多殺性巴氏桿菌商品化疫苗，也僅對同源血清型毒株感染提供有限的免疫保護作用。如何有效控制不同血清型和不同動物源多殺性巴氏桿菌的感染，抗生素治療似乎是可無差別針對不同血清型多殺性巴氏桿菌的，但隨著抗生素的大量使用，出現(xiàn)了越來越多的耐藥性多殺性巴氏桿菌菌株，這為該病原的防控帶來了新的問題。因此，對于多殺性巴氏桿菌易感動物群體，疫苗預防仍是有效的主要防控手段。

多殺性巴氏桿菌雖有多種血清型，但基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌2 000多個基因中，各血清型間絕大多數(shù)基因相同或同源性高，PlpB、PlpE、PmCQ2_2 g0128、OmpH、Omp87等交叉保護性抗原的發(fā)現(xiàn)，進一步證實各血清型菌株間存在交叉免疫保護性抗原，但通常單一抗原其交叉免疫保護作用有限。Homchampa等通過缺失多殺性巴氏桿菌P-1059株(血清型A:3)的基因獲得的缺失株能夠保護血清型A:1和A:4 菌株的感染，這為多殺性巴氏桿菌疫苗研究展示了新的方向。通過基因缺失的方式改變細胞的相應基因表達調控，促使相關交叉免疫保護性抗原的表達上調等，可能起到交叉免疫保護效果，但關鍵是確定哪些基因缺失能改變菌株免疫保護特性。本課題組前期研究中，PmCQ2菌株0979及0442基因缺失株均未發(fā)現(xiàn)交叉免疫保護特性。即便同一基因缺失，不同菌株其交叉保護特性也可能不同，如多殺性巴氏桿菌X-73株(血清型A:1)的基因缺失株就沒有交叉保護特性，本研究中，PmCQ2菌株基因缺失株的交叉保護作用，不僅體現(xiàn)在針對同源莢膜A型菌株，還針對同源莢膜B型和F型菌株及異源A型菌株，這與所報道的基因缺失株僅針對同源A型菌株保護不同，PmCQ2株基因缺失株表現(xiàn)出更強的交叉免疫保護特性。PmCQ2菌株基因缺失所表現(xiàn)出的交叉免疫保護特性，是否在其他菌株中同樣存在，這需進一步研究，但也可能與基因一樣，基因缺失賦予不同菌株不同的免疫保護特性。

自然選擇致使菌株具有各自的獨特性，包括其致病性、生長繁殖、抗逆性及免疫保護等，細胞組成結構的差異與其獨特性密切相關。從免疫保護角度來看，同一菌株，不同培養(yǎng)條件，其免疫保護性可能會出現(xiàn)顯著差異，采用限鐵性培養(yǎng)基培養(yǎng)，多殺性巴氏桿菌菌株的免疫保護性會顯著增強，不同培養(yǎng)條件導致的細胞組成成分表達差異是其關鍵原因?；蛉笔?，改變了細菌原有基因表達模式，部分性狀會隨之改變。多殺性巴氏桿菌PmCQ2 菌株基因的缺失，導致了部分莢膜合成轉運基因及毒力相關基因表達下調，同時也導致了菌株眾多外膜蛋白基因(、、、、、、、、、、、、、、、、、2等)的表達顯著上調，相關基因表達的變化，致使菌株在莢膜、毒力、菌落形態(tài)及免疫保護性等性狀方面發(fā)生了顯著變化。那么莢膜缺失是否與Δ的交叉免疫保護特性有關呢？在本研究中，答案是肯定的。但是否缺失了莢膜的菌株都會表現(xiàn)出交叉保護特性呢？情況卻未必。莢膜位于細胞最外層，具有抗逆抗吞噬作用，是病原非常重要的毒力因子，Boyce和Adler發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌莢膜缺失會導致菌株毒力顯著下調，也可賦予菌株較強的免疫保護特性，但不同基因導致的莢膜缺失，各菌株卻表現(xiàn)出了不同的免疫保護特性，與基因缺失均可導致B型多殺性巴氏桿菌的莢膜缺失，但其缺失株免疫保護特性卻出現(xiàn)顯著差異?；虻娜笔е戮昵v膜缺失，賦予了菌株較強的交叉免疫保護特性，而同樣是野生株PmCQ2，其0442基因缺失也導致菌株莢膜的缺失，卻并沒有賦予菌株交叉保護特性，同樣，實驗室分離的一株因基因的點突變導致的莢膜天然缺失的多殺性巴氏桿菌PmCQ6株，其交叉保護性也較弱。由此可以看出，多殺性巴氏桿菌莢膜缺失與菌株免疫保護特性并無必然相關性，同時，莢膜多糖的大量存在，也可能會限制相關保護性抗原的免疫作用。Δ中如PlpB、PlpE、OmpH和OmpW等與免疫保護相關的外膜蛋白表達上調及莢膜多糖含量的減少，可能是其具有較強交叉免疫保護作用的關鍵。

4 結 論

本試驗通過構建牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2株(PmCQ2)莢膜合成基因缺失株Δ和其回補株C-，初步證實了基因能夠調控PmCQ2株的莢膜生成、生物膜形成、生長繁殖及毒力等生物性狀，基因的缺失賦予了菌株較強的交叉免疫保護特性，為多殺性巴氏桿菌通用型疫苗研究提供了參考依據(jù)。