低鈣脅迫對胎豬脂質(zhì)代謝的影響

張卓煒，艾強云，何 洋，張 輝，李 英，郭劍英，唐兆新*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學，廣州 510642; 2.云南農(nóng)業(yè)大學，昆明 650500)

鈣元素對于整個妊娠過程有著舉足輕重的作用。在妊娠初期時，胎胚尚處于細胞分裂及臟器發(fā)育的初級階段。此時胎兒對鈣的需求量不會發(fā)生顯著變化，因而不宜過多地補充鈣，以免誘發(fā)高鈣血癥、結(jié)石及骨骼過度鈣化等。但隨著孕期的增長，尤其是在懷孕后期，由于胎兒的牙齒與骨骼加速鈣化致使母體所需供給的鈣量大幅度增加，此時鈣缺乏將嚴重威脅到母體及胎兒的健康。當血清中的鈣濃度低于正常閾值，機體便會激活破骨細胞并從鈣庫內(nèi)抽調(diào)鈣源以維持血鈣濃度的穩(wěn)定。但長期動用骨鈣，輕則會影響神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌運動，重則可導致骨質(zhì)疏松與癱瘓的發(fā)生。缺鈣時鈣離子通道開放受阻，進而使得肌纖維蛋白和肌凝蛋白無法作用于相應結(jié)合位點，最終導致子宮肌收縮乏力，引發(fā)難產(chǎn)。此外，妊娠期母體的血鈣濃度還與產(chǎn)后出血癥的發(fā)生相關。

動物的脂肪主要由脂肪酸和甘油合成而來。脂質(zhì)的代謝是為日常生理活動供能的重要環(huán)節(jié)。脂質(zhì)及其衍生物可參與包括體溫調(diào)節(jié)、生物膜的組建、調(diào)控胰島素敏感性、保護血管以及免疫反應等。脂肪不僅是初生仔豬重要的能量來源，并且脂肪組織本身還是一類內(nèi)分泌器官，對調(diào)控諸如脂聯(lián)素、抵抗素以及瘦素等物質(zhì)的分泌至關重要。

基于現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)技術(shù)的快速發(fā)展，豬群在提高生產(chǎn)效益的同時所承受的生理負荷也越發(fā)加重，導致鈣磷代謝相關疾病的發(fā)生率也呈現(xiàn)出上升趨勢。當胎豬受母體低鈣脅迫影響時，對其脂質(zhì)代謝過程又會產(chǎn)生何種影響，本文就圍繞該問題的原因和機理進行探索，為相關領域的研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗于廣東省韶關市翁源縣豐澤畜牧養(yǎng)殖有限公司豬場內(nèi)進行。選取20頭健康的7～8胎齡母豬并隨機分成對照組(CON組)和低鈣組(LCa組)，每組10頭作生物學重復。按不同鈣磷比配置日糧，對照組(鈣∶磷=0.75∶0.592)，低鈣組(鈣∶磷=0.65∶0.513)。于妊娠第85天連續(xù)飼喂至第114天分娩。所有試驗母豬的日常飼養(yǎng)流程均嚴格按照該豬場的常規(guī)飼養(yǎng)管理辦法進行。日糧營養(yǎng)成分的調(diào)配遵照NRC(National Research Council, 2012)標準，飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成與營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Basal diet composition and nutrient levels (air-dried basal) %

1.2 樣本的采集

于母豬分娩后的1 h內(nèi)，在同窩中篩選出體重位于中位數(shù)，且無明顯異常的新生健康仔豬作為研究對象。前腔靜脈采血收集仔豬血液后，實施麻醉采集其肝腎組織樣本并置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及耗材

代謝組學檢測所使用的L-2-氯-苯丙氨酸(0.3 mg·mL)、甲醇、乙腈、二氯乙烷以及PBS溶液均為LC-MS級別試劑，購自美國Fisher Chemical公司；生化儀檢測所使用的總膽固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)以及低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)試劑，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；ELISA檢測所使用的豬總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、瘦素(leptin, LEP)、脂聯(lián)素(adiponectin, ADPN)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)、抵抗素(resistin)、內(nèi)脂素(visfatin)以及白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；熒光定量相關引物(表2)由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用的相關試劑，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

表2 基因引物序列Table 2 Gene primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 仔豬血清代謝組學檢測結(jié)果

由圖1和表3可見，CON組與LCa組差異代謝物的數(shù)據(jù)處理結(jié)果。其中，質(zhì)控QC樣本集中，各項調(diào)試標準合格。PCA分析中所有樣本均位于大橢圓內(nèi)(95%的置信區(qū)間)，同組樣本聚類良好，不同組別間的樣本聚類區(qū)分明顯，證明CON組與LCa組具有明顯的差異性。PLS-DA與OPLS-DA參數(shù)中與差值<0.3，>0.9，證明模型參數(shù)穩(wěn)定且具備很好的預測能力。

圖1 差異代謝通路分析Fig.1 Differential metabolic pathway analysis

表3 模型參數(shù)Table 3 Model parameters

由圖1中可見，CON組與LCa組的差異代謝物及信號通路富集結(jié)果。包括甘油磷脂代謝、糖基磷脂酰肌醇生物合成、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、乳糖代謝、不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸降解以及鞘脂代謝等。其中變化最為顯著的是甘油磷脂代謝通路(glycerophospholipid metabolism)。

2.2 仔豬血清中脂類物質(zhì)檢測結(jié)果

由表4可見，仔豬血清中TC、TG、HDL-C以及LDL-C含量均無顯著差異(>0.05)。

表4 血清中脂類物質(zhì)Table 4 Lipids in serum mmol·L-1

2.3 仔豬脂質(zhì)代謝指標檢測結(jié)果

由表5可見，仔豬腎中脂質(zhì)代謝指標的檢測結(jié)果。其中，LCa組與CON組相比，F(xiàn)AS、resistin以及visfatin含量顯著降低(<0.05)；由表6可見仔豬肝中脂質(zhì)代謝指標的檢測結(jié)果。其中，LCa組與CON組相比，F(xiàn)AS含量顯著降低(<0.05)。

表5 腎脂質(zhì)代謝指標Table 5 Indicators of lipid metabolism in

表6 肝中脂質(zhì)代謝指標Table 6 Indicators of lipid metabolism in livers

2.4 仔豬脂質(zhì)代謝相關基因檢測結(jié)果

由圖2可見，CON組與LCa組相比，LCa組腎中4(<001)、、1712以及4的mRNA表達量顯著降低(<0.05)；由圖3可見，LCa組肝中及的mRNA表達量顯著降低(<0.05)。

*. P<0.05, **.P<0.01；下同*. P<0.05, **.P<0.01). The same as below圖2 腎中脂質(zhì)代謝相關基因Fig.2 Lipid metabolism-related genes in kidneys

圖3 肝中脂質(zhì)代謝相關基因Fig.3 Lipid metabolism-related genes in livers

3 討 論

3.1 低鈣脅迫對胎豬脂質(zhì)代謝通路的影響

由仔豬血清代謝組學分析可見，低鈣脅迫顯著影響了甘油磷脂代謝通路。甘油磷脂是動物體內(nèi)最常見的磷脂，由磷脂酸和不同的取代基團組成。其中，磷脂酸的合成還與糖脂代謝轉(zhuǎn)化脂肪酸的過程有關。甘油磷脂不僅參與脂蛋白的分泌，同時也會影響膽汁對脂肪的消化和吸收。在該信號通路中，LCa組C00350位點上磷脂酰乙醇胺類(phosphatidylethanolamine, PE)物質(zhì)增多。而PE的部分組成源于動物的肝和腎，所以推測低鈣脅迫可能導致了胎豬的肝腎對甘油磷脂類物質(zhì)的合成代謝出現(xiàn)了問題。LCa組C04230位點上磷酰脂膽堿類(lysophosphatidylcholine, LysoPC)物質(zhì)增多。LysoPC是磷脂酶A水解產(chǎn)物，具有激活磷脂酶活性的作用，同時也是導致動脈粥樣硬化的脂蛋白之一。LCa組C00416位點上磷脂酸類(lysophosphatidic acid, LysoPA)物質(zhì)增多。LysoPA具有類似生長激素的作用，提示低鈣脅迫可能還影響了胎豬的發(fā)育。此外，LCa組C01194位點上1-磷脂酰-D-肌醇(1-phosphatidyl-D-myo-inositol)增多，該物質(zhì)與棕櫚酸的合成相關。在脂肪酸生物合成及脂肪酸降解代謝途徑中，確實發(fā)現(xiàn)了棕櫚酸受低鈣刺激增多。棕櫚酸是脂肪酸合成中的首要脂肪酸，對動物的生長發(fā)育和脂肪蓄積有重要的影響。根據(jù)上述結(jié)果推測，低鈣脅迫影響了胎豬的脂質(zhì)代謝，導致甘油磷脂代謝(圖4)及棕櫚酸合成等途徑發(fā)生變化，進而可能影響到胎豬在生長過程中有關脂肪的生成及消化代謝過程，甚至可能會擾亂其育肥期的生長發(fā)育。而部分差異代謝物的增多是因由機體對低鈣脅迫刺激的代償作用。

圖4 甘油磷脂代謝通路Fig.4 Glycerophospholipid metabolic pathway

3.2 低鈣脅迫對胎豬脂質(zhì)代謝指標的影響

脂肪酸合成酶(FAS)是一類二聚體蛋白酶，其主要功能是可將攝入的碳水類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為軟脂酸。抵抗素(resistin)是來源于脂肪的一類肽激素，由免疫細胞和上皮細胞所分泌，具有降低對胰島素敏感度的作用并會抑制脂肪細胞分化。內(nèi)脂素(visfatin)是一類脂肪細胞因子，主要由內(nèi)臟脂肪細胞所分泌，具有類胰島素效應。Visfatin可降低血糖水平，促進脂肪細胞的分化以及參與免疫反應等。由結(jié)果可見，LCa組腎中FAS、Resistin和Visfatin，以及肝中FAS的含量均顯著降低。一方面說明低鈣脅迫影響了胎豬軟脂酸(棕櫚酸)的合成。而在代謝組學分析中也發(fā)現(xiàn)，LCa組棕櫚酸的增多，證明低鈣脅迫使得胎豬體內(nèi)FAS含量減少致使棕櫚酸總體含量降低，因而在低鈣的刺激下促使胎豬吸收了更多的棕櫚酸以起到代償作用。另一方面，Resistin與Visfatin均具有類胰島素作用，因此LCa組中此兩種物質(zhì)的減少也預示胎豬的糖脂代謝及蛋白質(zhì)合成等出現(xiàn)異常。根據(jù)上述結(jié)果推測，低鈣脅迫影響了胎豬體內(nèi)脂質(zhì)代謝相關激素的分泌，可能改變了其脂肪細胞的分化程度，且不利于對碳水類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)化。

3.3 低鈣脅迫對胎豬脂質(zhì)代謝基因表達的影響

SCD(stearoyl-CoA desaturase)是脂肪組織和肝中重要的脂肪代謝限速酶，可將飽和脂肪酸催化轉(zhuǎn)為不飽和脂肪酸，且SCD的表達與豬的肌肉脂肪組織含量有很強的關聯(lián)性。LCa組肝腎組織中SCD的表達均顯著降低，也證實胎豬的脂肪酸代謝過程的確受到了影響。并且，LCa組腎中FABP4(Fatty acid binding protein 4)及HSD17B12(hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 12)的表達也顯著減少。FABP4是一類脂肪酸結(jié)合蛋白，負責承擔內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細胞核中脂肪酸的運輸與氧化反應等。HSD17B12參與脂肪酸代謝以及不飽和脂肪酸的生成過程，其表達還可影響雌激素分泌和卵泡的發(fā)育從而影響產(chǎn)仔數(shù)，這也有可能是豬群日后生產(chǎn)性能下滑的原因之一。此外，LCa組腎中ABCC4(ATP binding cassette subfamily C member 4)的表達顯著降低。ABCC4參與將膽汁酸轉(zhuǎn)運至血液循環(huán)的過程，從而調(diào)節(jié)對脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的利用等。低密度脂蛋白是轉(zhuǎn)運內(nèi)源性膽固醇的重要載體，盡管仔豬血液中LDL-C的含量未發(fā)生明顯變化，但在LCa組肝中LDLR的表達顯著降低，說明低鈣脅迫仍可能致使胎豬的膽固醇代謝障礙。根據(jù)上述結(jié)果推測，低鈣脅迫影響了胎豬脂質(zhì)代謝相關基因的表達，尤其是在脂肪酸的轉(zhuǎn)運及代謝方面較為顯著，甚至還可能會影響其今后的生產(chǎn)性能。

4 結(jié) 論

妊娠母豬缺鈣可影響胎豬的甘油磷脂代謝、糖脂代謝及脂肪酸的生成等，對胎豬的健康造成了一定的隱患。