葛艷爭，石愛民，任廣躍 ，劉 哲，李嗣生，職蘭懿，王 強,，杜祖波

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京 100193；3.山東魯花集團有限公司，山東 萊陽 265200）

食品級Pickering乳液是用天然食品大分子固體顆粒（蛋白質(zhì)、多糖等食品級顆粒）對油水界面穩(wěn)定制備的一種新型乳液。與傳統(tǒng)乳液相比，Pickering乳液具有較高的穩(wěn)定性，不易受外界環(huán)境因素的影響，且生產(chǎn)成本低、環(huán)境友好。因此，由食品級顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液的開發(fā)在食品和醫(yī)藥等研究領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、乳清蛋白、大米蛋白、豌豆蛋白等均可有效地穩(wěn)定Pickering乳液體系。近年來，由于花生蛋白來源豐富、具有優(yōu)異的營養(yǎng)價值，且對人體健康的有益影響，已被運用在食品配方中?；ㄉ蛛x蛋白（peanut protein isolate，PPI）是最具有商業(yè)價值的花生蛋白產(chǎn)品，并且PPI具有優(yōu)異的乳化性、凝膠性、持水性等多種功能特性，具有發(fā)展為Pickering乳液穩(wěn)定劑的潛力。

目前，制備食品級固體顆粒的方法主要采用復(fù)合改性法，分別有加熱復(fù)合離子誘導(dǎo)法、加熱復(fù)合酶法、超聲復(fù)合水解法等。Ning Fangjian等通過加熱和鹽離子雙重誘導(dǎo)法制備了具有較好潤濕性的PPI納米顆粒，并用其穩(wěn)定了O/W型Pickering乳液。Jiao Bo等利用加熱復(fù)合酶法制備PPI納米顆粒，并用其穩(wěn)定了高內(nèi)相Pickering乳液。Zhang Xinxia等采用超聲預(yù)處理復(fù)合酸水解大米蛋白的方法，制備了一種球形結(jié)構(gòu)的大米肽納米顆粒，證實超聲可以顯著減小固體顆粒的粒徑。超聲處理具有效率高、操作簡單、無需化學(xué)處理更綠色且更適合于食品加工等優(yōu)勢，且有研究表明超聲預(yù)處理可以改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，使其三級結(jié)構(gòu)變的舒展，暴露更多的疏水性殘基，有利于酶交聯(lián)反應(yīng)的進行。

因此，本研究以PPI為原料，利用超聲預(yù)處理，隨后經(jīng)過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨（glutamine transaminase，TG）酶交聯(lián)得到PPI凝膠進行高速剪切和高壓均質(zhì)制備花生分離蛋白微凝膠顆粒（peanut protein isolate microgel particles，PPIMP），構(gòu)建Pickering乳液體系，并對PPIMP的相關(guān)性質(zhì)及其穩(wěn)定的Pickering乳液特性進行研究，以期為Pickering乳液在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生蛋白粉（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（47.22±0.06）%、油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.27%±0.06）%、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4.97±0.03）%） 青島長壽食品有限責(zé)任公司；葵花籽油 佳格食品（中國）有限公司；TG 酶北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（1-anilino-8-naphtaalenesulfonate，ANS） 北京百靈威科技有限公司；尼羅紅、尼羅藍(lán) 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DHR-2流變儀 美國TA儀器公司；激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司；Mastersizer3000激光粒度分析儀、Nano-ZS型激光粒度儀 英國Malvern公司；Freezee zone 6真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；T18 digital高速剪切機 美國IKA公司；AH-100D高壓均質(zhì)機 上海ATS公司；J-1500圓二色譜儀日本分光株式會社；多重光散射穩(wěn)定性分析儀 法國Formulaction公司。

1.3 方法

1.3.1 PPI的制備

參考本研究團隊前期實驗方法并略有改動。將花生蛋白粉與去離子水按1∶10（g/mL）比例混合，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 9.0，再將混合液在室溫下攪拌2 h，4 200 r/min離心10 min取上清液。然后，用1 mol/L的HCl溶液將上清液調(diào)pH 4.5，4 200 r/min離心10 min。最后，收集沉淀，并用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 7.0，冷凍干燥獲得蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.52%的花生分離蛋白。

1.3.2 超聲預(yù)處理

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的PPI溶液，室溫下攪拌2 h，并調(diào)pH 7.0后放入冰箱冷藏過夜。超聲時間分別設(shè)置為0、10、20、30、40 min，超聲功率為500 W處理PPI溶液。

1.3.3 PPIMP的制備

參考本研究團隊前期實驗方法并略有改動。將TG酶（20 U/g PPI）加入到處理后的PPI溶液中并在45 ℃水浴加熱4 h。加入2 倍體積的去離子水，隨后使用高速剪切機12 000 r/min剪切2 min，再通過高壓均質(zhì)機在50 MPa的壓力下均質(zhì)2 min得到PPIMP分散液。

1.3.4 PPIMP粒徑及Zeta電位的測定

采用Nano-ZS型激光粒度儀對PPIMP進行粒徑與Zeta電位分析。使用超純水將顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀釋到0.5%，取1 mL樣品緩緩地加入到樣品池中，防止氣泡產(chǎn)生。

1.3.5 表面疏水性測定

參考Zhu Xuefeng等的方法并略有改動。用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制1 mg/mL的蛋白溶液，室溫下10 000×離心20 min后取上清液，用Lowry法測定蛋白濃度。分別將上清液稀釋2、4、8、10 倍后取4 mL加入20 μL的8 mmol/L的ANS熒光探針。在避光條件下，發(fā)射波長和激發(fā)波長分別為390 nm和470 nm，狹縫5 nm，用熒光分光光度計測定樣品表面疏水性。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析

參考Mohsin等的方法并略作修改，將處理后的樣品冷凍干燥，再以1∶100比例與溴化鉀混合均勻研磨，并將其壓制成薄片，在波數(shù)范圍400～4 000 cm，掃描64 次。

1.3.7 圓二色譜分析

參考操強等的方法并略作修改。將PPIMP配制成0.1 mg/mL的溶液，以超純水為空白在190～250 nm掃描，樣品池光程長為1 mm。

1.3.8 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

參考Feng Haiying等的方法并略有改動。取20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的PPIMP與5 mL葵花籽油混合，12 000 r/min高速剪切2 min制備成乳液，從底部迅速吸取50 μL加入到4 950 μL 0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液混勻，在500 nm波長處測定吸光度。靜置10 min后，以相同方法再次測定吸光度。乳化性和乳化穩(wěn)定性按式（1）和（2）計算。

式中：為初始吸光度；為稀釋因子；為乳液中的油相體積分?jǐn)?shù)/%；為蛋白質(zhì)的初始質(zhì)量濃度/（g/mL）；為10 min后的吸光度；-為兩次測定時間的差值。

1.3.9 Pickering乳液的制備

將制備的PPIMP分散液稀釋到蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，再向上述PPIMP分散液中加入葵花籽油使其體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到65%、70%、75%、80%，在10 000 r/min剪切2 min得到Pickering乳液。

1.3.10 Pickering乳液粒徑的測定

參考本研究團隊前期實驗方法并略有改動。采用Mastersizer 3000激光粒度分析儀測定Pickering乳液的粒徑分布以及平均粒徑，用去離子水作為分散劑（1.330），乳液的折光系數(shù)為1.471。

1.3.11 Pickering乳液的穩(wěn)定性動力學(xué)指數(shù)（turbiscan stability index，TSI）分析

取約20 mL新鮮制備的Pickering乳液于Turbiscan穩(wěn)定性分析儀專用圓柱形玻璃瓶中，保持樣品瓶外壁潔凈，內(nèi)壁無樣品區(qū)域無殘留，液面平整。在設(shè)定溫度（55 ℃）下每隔30 min對樣品掃描一次，共掃描6 h。利用Turbisoft軟件計算乳液隨時間變化的TSI值。

1.3.12 Pickering乳液流變學(xué)特性的測定

參考本研究團隊前期實驗方法并略有改動。通過1 Hz的應(yīng)變掃描得到樣品的線性黏彈區(qū)域，所有樣品的測試均在該線性黏彈區(qū)范圍內(nèi)測試。25 ℃條件下，以直徑為40 mm的鋁制平板，在剪切速率1.0～100 s內(nèi)進行乳液表觀黏度的測定。設(shè)置角頻率為0.1～100 rad/s，頻率掃描測量的應(yīng)變振幅為0.5%，得到頻率掃描曲線。

1.3.13 Pickering乳液激光共聚焦顯微鏡分析

取0.5 mL乳液置于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，加入10 μL（1∶1）尼羅紅和尼羅藍(lán)混合染料（用異丙醇溶解），混合均勻后，于避光條件下染色30 min。將染色后的乳液置于載物臺上，在488 nm和633 nm激發(fā)波長觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗均重復(fù)3 次取平均值，使用Origin 8.5軟件作圖。采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析，＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時間對PPIMP粒徑及電位的影響

超聲時間對PPIMP 平均粒徑與平均分散系數(shù)（polymer dispersity index，PDI）的影響如表1所示，隨著超聲時間的延長，PPIMP的平均粒徑先減小后增大。與未超聲的PPIMP平均粒徑相比，超聲時間為20 min的PPIMP平均粒徑從372.95 nm減小至284.38 nm。與劉競男等研究超聲處理大豆分離蛋白時得到結(jié)論相似，其可能原因是超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)使蛋白由大分子物質(zhì)分解成小分子顆粒。超聲時間延長至40 min時，PPIMP的平均粒徑又逐漸增大至356.40 nm，這可能是超聲過程中蛋白質(zhì)的重聚現(xiàn)象導(dǎo)致。所有樣品的PDI均小于0.5，表明分散液是均勻且穩(wěn)定的體系。固體顆粒的粒徑大小直接影響Pickering乳液的液滴大小，粒徑越小其吸附能力越強，越有利于形成穩(wěn)定性更高的Pickering乳液。由此可知，經(jīng)過超聲預(yù)處理后的PPIMP更有利于Pickering乳液的穩(wěn)定。

表1 超聲時間對PPIMP粒徑和Zeta電位的影響Table 1 Effect of ultrasonic time on the particle size and zeta potential of PPIMP

超聲時間對PPIMP Zeta電位的影響見表1，超聲處理前后PPIMP的Zeta電位均為負(fù)，且Zeta電位絕對值均在30～40 mV之間。在超聲時間為20 min時，PPIMP的Zeta電位絕對值最大（35.38 mV），表明此時蛋白顆粒之間的靜電斥力最大，最不易發(fā)生聚集，這與粒徑的結(jié)果一致。而隨著超聲時間的增加，PPIMP的Zeta電位的絕對值先增大后減小?？赡茉蚴浅曁幚硎沟鞍踪|(zhì)中的極性基團暴露。

2.2 超聲時間對PPIMP表面疏水性的影響

用ANS作為熒光探針檢測不同超聲時間處理的PPIMP的表面疏水性變化如圖1所示，隨著超聲時間的延長，表面疏水性先增高后降低。超聲時間為0 min的PPIMP表面疏水性最小為109.54，超聲時間為20 min的PPIMP表面疏水性最大為138.16。本研究表面疏水性的增長效果明顯高于超聲-TG酶對紅豆蛋白的表面疏水性的影響。表面疏水性對固體顆粒的乳化性有決定性的影響，表面疏水性的提高有利于增強PPIMP的乳化效果。Wang Yuntao等的研究表明在一定的超聲時間內(nèi)，鷹嘴豆分離蛋白的表面疏水性隨超聲時間的延長而升高。當(dāng)超聲時間過長時，蛋白質(zhì)的表面疏水性降低，可能是過度的超聲處理過程中會產(chǎn)生熱量，冷卻過程中，蛋白質(zhì)的疏水相互作用將導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，從而導(dǎo)致其表面疏水性降低，該結(jié)果和Cui Qiang等研究結(jié)果一致。這些結(jié)果表明適宜的超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)會改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白氫鍵和分子間作用力裂解，蛋白內(nèi)部的疏水基團暴露，使其表面疏水性增強。

圖1 超聲時間對PPIMP表面疏水性的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the surface hydrophobicity of PPIMP

2.3 超聲時間對PPIMP二級結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，F(xiàn)TIR主要峰是3 600～3 100 cm（N—H伸縮和氫鍵）和1 600～1 700 cm（C＝O伸縮和氫鍵）。不同超聲時間處理的PPIMP在1 605 cm均具有強吸收峰。此外，超聲時間為20 min的PPIMP與未經(jīng)超聲處理的PPIMP相比，3 285 cm處的吸收帶變得更寬，這可能是由于超聲破壞了蛋白中的氫鍵作用，使蛋白質(zhì)分子展開。圓二色譜分析進一步研究了超聲時間對PPIMP二級結(jié)構(gòu)影響。將圖譜用CD Pro擬合軟件分析，數(shù)據(jù)如表2所示。超聲處理20 min的PPIMP，-螺旋相對含量增加、-折疊相對含量降低。這可能是超聲的空化效應(yīng)破壞了蛋白質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)，而使蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)增加。

圖2 不同超聲時間處理PPIMP的FTIR圖Fig.2 FTIR of PPIMP treated by ultrasonic for different periods of time

表2 圓二色譜測定不同超聲時間處理的PPIMP二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 2 Relative content of secondary structures in PPIMP treated by ultrasonic for different periods of time determined by circular dichroism spectroscopy %

根據(jù)粒徑、Zeta電位、表面疏水性、二級結(jié)構(gòu)、乳化性及乳化穩(wěn)定性結(jié)果可推測，經(jīng)過超聲預(yù)處理改變了PPI空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白氫鍵和分子間作用力裂解，疏水基團暴露，有利于TG酶交聯(lián)形成凝膠。再通過高速剪切與高壓均質(zhì)的撞擊、空穴等作用力將凝膠塊破碎，得到納米級的PPIMP。

2.4 超聲時間對PPIMP乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

乳化性表示蛋白質(zhì)促進乳液形成的能力，用于表征乳狀液乳化特性；乳化穩(wěn)定性表示賦予乳液抗應(yīng)變的能力，以抵抗在一定時間內(nèi)發(fā)生的不穩(wěn)定性變化，如聚結(jié)、絮凝或沉淀等，用于表征乳狀液穩(wěn)定狀態(tài)。如圖3所示，隨著超聲時間延長，PPIMP的乳化性及乳化穩(wěn)定性均呈先增加后降低的趨勢。超聲時間20 min時，乳化性（20.14 m/g）及乳化穩(wěn)定性指數(shù)（166.42 min）均達(dá)到最大值，且具有顯著差異（＜0.05）。王喜波等研究的超聲時間對大豆-乳清混合蛋白乳化性質(zhì)的影響也得到了相似的結(jié)論，可能原因是超聲20 min時暴露了更多的疏水性基團，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)與油的相互作用增強。這一結(jié)果與PPIMP表面疏水性的結(jié)果一致。此外，當(dāng)超聲時間超過30 min時，乳化性及乳化穩(wěn)定性均有所降低，可能原因是超聲時間過長，蛋白質(zhì)的重聚現(xiàn)象嚴(yán)重而不利于疏水基團的暴露，導(dǎo)致乳化性及乳化穩(wěn)定性有所降低。

圖3 超聲時間對PPIMP乳化性（A）及乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the emulsifying capacity (A) and emulsion stability (B) of PPIMP

2.5 Pickering乳液粒徑分布及平均粒徑分析

制備蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，油相體積分?jǐn)?shù)分別為65%、70%、75%、80%的Pickering乳液。未經(jīng)超聲處理PPIMP制備的Pickering乳液在放置10 min后出現(xiàn)乳析現(xiàn)象，故未對其進行系統(tǒng)的性質(zhì)表征。超聲20 min PPIMP制備的Pickering乳液，放置10 min后呈現(xiàn)為均一的乳液體系。圖4為不同油相體積分?jǐn)?shù)（65%～80%）Pickering乳液的粒徑分布及平均粒徑圖。隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加，Pickering乳液的平均粒徑先減小后增加，在油相體積分?jǐn)?shù)為75%時，乳液的平均粒徑最小。由粒徑分布圖（圖4A）可以觀察到，隨著油相體積的增加，粒徑分布圖中的主峰位置先逐漸向小尺寸移動（65%～75%），后又向大粒徑方向移動（75%～80%）。這可能是油相體積分?jǐn)?shù)為80%時，乳液屬于高內(nèi)相乳液，液滴之間會相互擠壓，測定時攪拌分散不完全。也可能是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的PPIMP不能完全包裹住所有液滴，加劇了乳液的絮凝，從而使粒徑增大，這與劉付用大豆蛋白穩(wěn)定的Pickering乳液粒徑結(jié)果一致。

圖4 不同油相體積分?jǐn)?shù)制備的Pickering乳液的粒徑分布（A）及平均粒徑（B）Fig.4 Particle size distribution (A) and average particle size (B) of Pickering emulsions prepared with different oil phase volume fractions

2.6 Pickering乳液穩(wěn)定性分析

TSI能夠便捷地比較樣品之間的穩(wěn)定性差異，是分析乳液體系物理穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。與起始線的偏差越大（TSI＝0），曲線的斜率越小表示體系越穩(wěn)定。圖5顯示了不同油相體積分?jǐn)?shù)制備Pickering乳液TSI隨時間的變化，TSI在0～5 000 s左右時，不同油相體積分?jǐn)?shù)Pickering乳液的TSI值變化較大，之后變化較平緩。TSI數(shù)據(jù)表明乳液的穩(wěn)定性順序為：油相體積分?jǐn)?shù)80%＞75%＞70%＞65%。油相體積分?jǐn)?shù)為65%的Pickering乳液TSI值最大為0.84（斜率最大），油相體積分?jǐn)?shù)為80%的Pickering乳液TSI值最小為0.33（斜率最?。?。當(dāng)內(nèi)相體積分?jǐn)?shù)大于74%時，稱為高內(nèi)相乳液。對于高內(nèi)相乳液，內(nèi)相體積分?jǐn)?shù)越大，乳液越穩(wěn)定。當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)為80%時，乳液的TSI值最小，即乳液最穩(wěn)定，這與PPIMP不能完全包裹住所有的液滴而液滴間形成橋接絮凝狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖5 不同油相體積分?jǐn)?shù)制備的Pickering乳液TSI隨時間的變化曲線Fig.5 Turbiscan stability index of Pickering emulsions prepared with different oil phase volume fractions as a function of time

2.7 Pickering乳液流變分析

如圖6A所示，所有乳液隨著剪切速率的增大黏度逐漸下降，表現(xiàn)出典型非牛頓假塑性行為（剪切稀化）。這種剪切稀化行為是乳液間的弱締合相互作用。在相同的剪切速率下，隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加，Pickering乳液的表觀黏度越大。該結(jié)果和江連洲等研究大豆分離蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的Pickering高內(nèi)相乳液黏度結(jié)果一致。

圖6 不同油相體積分?jǐn)?shù)制備的Pickering乳液的靜態(tài)（A）、動態(tài)（B）流變分析圖Fig.6 Rheological analysis of Pickering emulsions prepared with different oil phase volume fractions

由圖6B可以觀察到，油相體積分?jǐn)?shù)大于等于70%時，表現(xiàn)出彈性凝膠行為，在頻率掃描范圍內(nèi)，彈性模量始終大于黏性模量。另外，在同一頻率下，隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加，彈性模量和黏性模量逐漸增加。研究表明PPIMP穩(wěn)定的Pickering乳液的流變行為受油相體積分?jǐn)?shù)影響，油相體積分?jǐn)?shù)越高，越容易形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于乳液的穩(wěn)定。

2.8 Pickering乳液微觀結(jié)構(gòu)分析

PPIMP和食用油分別被尼羅藍(lán)和尼羅紅標(biāo)記為綠色和紅色。由圖7可以觀察到，綠色的蛋白顆粒包裹著紅色油滴，說明乳液均為水包油型。當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)由65%增加到80%時，液滴大小呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。油相體積分?jǐn)?shù)為80%時，會出現(xiàn)液滴和液滴絮凝，液滴間排布緊密相互擠壓而失去球形。這可能是由于可用固體顆粒的數(shù)量不足以穩(wěn)定所有液滴，固體顆?？梢詷蚪右旱危缑嫔系念w粒與水相中顆粒形成了橋連絮凝，使乳液體系更加穩(wěn)定。

圖7 不同油相體積分?jǐn)?shù)制備的Pickering乳液的CLSM圖Fig.7 CLSM micrographs of Pickering emulsions prepared with different oil phase volume fractions

3 結(jié)論

隨著超聲時間的延長，PPIMP的平均粒徑先增高后降低，表面疏水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性先增大后減小。在超聲時間為20 min時，平均粒徑最小，且表面疏水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性指數(shù)最大。此外，采用超聲時間20 min的PPIMP制備不同油相體積分?jǐn)?shù)的乳液，均為水包油型Pickering乳液，非牛頓假塑性流體。乳液穩(wěn)定性結(jié)果表明，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)為80%時，制備的高內(nèi)相Pickering乳液最穩(wěn)定。因此，通過超聲預(yù)處理制備的PPIMP可作為一種有效的Pickering穩(wěn)定劑，且PPIMP的成功制備對花生蛋白產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。