猴頭菌發(fā)酵改性玉米皮膳食纖維工藝優(yōu)化

劉倩男，孫小焯，紀晚唐，許丁，趙宇楠，蔡丹*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 132300；2.小麥和玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 132300）

玉米皮占玉米質(zhì)量的14%～20%[1]，富含膳食纖維，除蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等成分外，還含有玉米纖維油、阿拉伯木聚糖、甾醇、維生素和阿魏酸等生物活性物質(zhì)[2-3]，具有減肥[4]、降血糖[5]、降膽固醇[6]、提高免疫力、預(yù)防高血壓、預(yù)防癌癥、抗菌消炎和抗氧化[7]等功能。在玉米深加工過程中，玉米皮是濕法生產(chǎn)淀粉產(chǎn)生的副產(chǎn)物，多被用作飼料生產(chǎn)原料或被丟棄，造成資源的浪費和環(huán)境的污染。膳食纖維（dietary fiber，DF）是指不被人體消化吸收，且由10個或更多單元組成的碳水化合物的聚合物，按溶解性可以分為不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）[8]。玉米皮膳食纖維具有很高的營養(yǎng)價值，它的攝入量與降低多種疾病的風(fēng)險息息相關(guān)，有研究表明，膳食纖維有降血脂、降血糖、減肥、清除有毒有害物質(zhì)、改善腸道菌群和預(yù)防癌癥、心血管疾病、抑郁癥等生理功能[9-13]。Haraa等[14]通過研究大鼠攝入不同膳食纖維對鋅的吸收影響，發(fā)現(xiàn)玉米皮纖維在低水平攝入時對鋅的吸收有促進作用，但在高水平攝入時對鋅的吸收有抑制作用。李曉月等[15]研究表明，玉米皮膳食纖維可以降低小鼠高密度脂蛋白膽固醇含量，可有效改善小鼠血脂指標。

膳食纖維的改性是利用一定技術(shù)手段對原料進行處理，將部分IDF轉(zhuǎn)化為SDF，并達到改善膳食纖維結(jié)構(gòu)、強化其理化性質(zhì)的目的[16]。目前，膳食纖維改性的方法有物理法、化學(xué)法和生物法[17]，研究中應(yīng)用較多的是物理法和生物法。其中，微生物發(fā)酵改性的方法選用的是安全無毒的微生物，具有安全、高效、無污染、低成本等優(yōu)點，可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，并且得到的膳食纖維純度較高。安瑩等[18]利用超聲波法提取黑玉米皮SDF，最優(yōu)工藝條件為提取時間32 min、料液比1∶11（g/mL），提取溫度60℃、超聲波功率700 W，此條件下SDF提取率達53.8%。陳闖等[19]采用雙酶法對玉米皮渣進行改性處理，使SDF的含量得到明顯提高，優(yōu)化后SDF最終得率為2.996%。李華麗等[20]利用黑根霉的二級發(fā)酵對玉米皮膳食纖維進行改性處理，使IDF轉(zhuǎn)化為SDF，并在最優(yōu)發(fā)酵條件下生產(chǎn)SDF乳飲料，得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為接種量4.40%、二級發(fā)酵溫度50.95℃、二級發(fā)酵時間46.50 min，最終飲料中SDF含量達到了4.45%。

本研究以玉米皮為主要研究對象，利用猴頭菌固態(tài)發(fā)酵的方法對玉米皮SDF改性，通過單因素和響應(yīng)面試驗確定發(fā)酵的最優(yōu)條件，并對比分析發(fā)酵前后玉米皮SDF對亞硝酸鹽、膽固醇和膽酸鹽的吸附能力。旨為提取高品質(zhì)的玉米皮SDF提供新方法，為膳食纖維的應(yīng)用提供參考，在增加資源利用、提高經(jīng)濟效益、促進人體健康等社會、環(huán)境方面有重要實踐價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮：黃龍食品工業(yè)有限公司；猴頭菌He-02-06（Hericium erinaceus）：小麥和玉米深加工國家工程中心；無水乙醇、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；無水葡萄糖（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；膽固醇、牛黃膽酸鈉（均為生化試劑）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（101A-1ET型）：上海實驗儀器廠有限公司；高速萬能粉碎機（AISITE型）、電熱恒溫水浴鍋（DK-98-II型）：天津市泰斯特儀器有限公司；振蕩培養(yǎng)箱（Stab S2型）：上海潤度生物科技有限公司；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（HPX-9162 MBE型）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高速離心機（Allegra X-30R型）：美國Beckman公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵菌種培養(yǎng)

菌種固體斜面培養(yǎng)：將保藏的猴頭菌菌種接種到麥芽瓊脂培養(yǎng)基上，在27℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d，備用。

菌種液體活化：將培養(yǎng)好的固體斜面菌種接種于液體活化培養(yǎng)基中，在27℃、160 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，即得液體發(fā)酵菌種。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基成分：玉米皮與蒸餾水的料液比為1∶2（g/mL），無水葡萄糖3.0%、磷酸二氫鉀0.10%、七水硫酸鎂0.04%，配制好培養(yǎng)基并滅菌后將猴頭菌發(fā)酵菌種接種于培養(yǎng)基中，在一定條件下對玉米皮固態(tài)發(fā)酵改性，發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵物烘干、粉碎備用。

1.3.3 單因素試驗

本試驗根據(jù)GB 5009.88—2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》對SDF含量進行檢測，以玉米皮SDF含量為指標，考察接種量（6%、8%、10%、12%、14%）、培養(yǎng)溫度（23、25、27、29、31℃）和培養(yǎng)時間（3、5、7、9、11 d）對猴頭菌固態(tài)發(fā)酵改性后玉米皮中SDF含量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以玉米皮SDF含量為指標，對接種量（A）、培養(yǎng)溫度（B）和培養(yǎng)時間（C）3個因素進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗因素水平設(shè)計見表1。利用Design-Expert 12對固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)條件進行響應(yīng)面優(yōu)化，確定發(fā)酵條件的最優(yōu)工藝參數(shù)并對最優(yōu)條件進行試驗驗證。

表1 響應(yīng)面分析因素水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3.5 玉米皮SDF的制備

將發(fā)酵前的玉米皮用去離子水清洗至pH值為中性，在50℃條件下烘干后粉碎備用。準確稱取發(fā)酵前后的樣品，過60目篩，以1∶20（g/mL）的料液比加入蒸餾水，在80℃水浴條件下浸提2 h，期間使用漩渦混勻器攪拌，冷卻后在4 000 r/min條件下離心20 min，向上清液中加入4倍體積的95%乙醇，4℃靜置12 h后得到的沉淀物即為SDF，冷凍干燥48 h后即得SDF粉末。

1.3.6 固態(tài)發(fā)酵對玉米皮SDF吸附亞硝酸鹽能力的測定

參考Hua等[21]的方法測定SDF亞硝酸鹽吸附能力，將0.1 mg/mL NaNO2標準溶液的pH值調(diào)為2（模擬胃內(nèi)環(huán)境）和7（模擬腸道內(nèi)環(huán)境）備用，準確稱取2份0.20 g發(fā)酵前后的玉米皮SDF（精確到0.000 1 g）分別加入50 mL兩種pH值的NaNO2標準溶液中，攪拌均勻后于37℃條件下恒溫振蕩2 h，4 000 r/min條件下離心15 min，吸取1 mL上清液于10 mL離心管中，加入2 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，靜置5 min，加1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水定容、搖勻，靜置15 min，以蒸餾水為空白，測定538 nm處OD值，測定上清液中剩余NO2-的含量，根據(jù)以下公式計算SDF的亞硝酸鹽吸附能力。

1.3.7 固態(tài)發(fā)酵對玉米皮SDF吸附膽固醇能力的測定

參考楊雪[22]的方法，將0.05 mg/mL膽固醇標準溶液的pH值調(diào)為2（模擬胃內(nèi)環(huán)境）和7（模擬腸道內(nèi)環(huán)境）備用。準確稱取2份0.50 g發(fā)酵前后的玉米皮SDF（精確到0.000 1 g）分別加入50.00 mL兩種pH值的膽固醇標準溶液中，攪拌均勻后于37℃條件下恒溫振蕩2 h，4 000 r/min條件下離心20 min，取4 mL上清液于10 mL離心管內(nèi)，采用鐵礬顯色法計算出上清液中剩余膽固醇的含量，根據(jù)以下公式計算SDF的膽固醇吸附能力。

1.3.8 固態(tài)發(fā)酵對玉米皮SDF吸附膽酸鹽能力的測定

參考Chu等[23]的方法，將膽酸鹽標準溶液pH值調(diào)為7（模擬腸道內(nèi)環(huán)境）備用，稱取0.50 g樣品（精確到0.000 1 g）加入50 mL濃度為1 mg/mL膽酸鈉標準溶液，攪拌均勻后于37℃恒溫振蕩2 h，4 000 r/min條件下離心20 min，取1 mL上清液采用糠醛顯色法測定剩余膽酸鈉含量，根據(jù)以下公式計算SDF的膽酸鹽吸附能力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用IBM SPSS Statistics 23軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用Graph Pad Prism 8軟件繪圖，采用Design-Expert 12軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計和作圖，所有試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 接種量對玉米皮SDF含量的影響

接種量對SDF含量的影響如圖1所示。

圖1 接種量對SDF含量的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on the content of soluble dietary fiber

由圖1可知，當接種量為8%時，SDF含量最高為8.76 g/100 g。接種量低于8%時，SDF含量低?？赡芤驗榫N量少、產(chǎn)酶量少以及菌體活性過低，導(dǎo)致發(fā)酵對玉米皮SDF改性能力較弱；當接種量超過8%時，SDF含量減少的原因可能為接種量過高，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)不足以供給菌體生長，影響真菌的發(fā)酵能力。因此，選擇接種量8%為最佳接種量。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對玉米皮SDF含量的影響

培養(yǎng)溫度對SDF含量的影響如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)溫度對SDF含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the content of soluble dietary fiber

由圖2可知，培養(yǎng)溫度對SDF含量的影響整體呈先上升后下降的趨勢，且在25℃條件下SDF含量最高，為7.24 g/100 g。培養(yǎng)溫度低于25℃時，菌體生長過慢，胞外酶活力較低，導(dǎo)致SDF含量較低；溫度過高時培養(yǎng)環(huán)境逐漸不利于菌體生長，且由于水分大量流失不利于菌絲體的積累和相關(guān)酶的合成，導(dǎo)致SDF含量降低[24]。因此，選擇培養(yǎng)溫度25℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.1.3 培養(yǎng)時間對玉米皮SDF含量的影響

培養(yǎng)時間對SDF含量的影響如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)時間對SDF含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the content of soluble dietary fiber

由圖3可知，培養(yǎng)時間對SDF含量的影響呈先上升后下降的趨勢，培養(yǎng)第7天時，SDF含量最高，為7.40 g/100 g；第 9 天時，SDF 含量次之，為 7.38 g/100 g。SDF含量隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，但在9 d后SDF含量有所下降，可能是因為培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分被利用到不足以供菌體生長，菌體生長開始消耗SDF，而且隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中水分含量減少、可溶性成分下降，菌體活力和胞外酶活力均下降，代謝能力減弱導(dǎo)致SDF含量降低[25]。因此，選擇培養(yǎng)時間7 d為最佳培養(yǎng)時間。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行Box-Behnken試驗設(shè)計，以得到固態(tài)發(fā)酵改性玉米皮SDF的最佳條件，其試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken design and results

利用Design-Expert 12軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到接種量（A）、培養(yǎng)溫度（B）和培養(yǎng)時間（C）3個因素與SDF含量之間的回歸方程為SDF含量/（g/100 g）=8.13+0.715 0A+0.673 7B+0.236 3C-0.8750AB-0.520 0AC+0.272 5BC-2.48A2-1.53B2-1.80C2。

方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

由表3可知，該模型顯著（P＜0.05），決定系數(shù)R2=0.955 7，說明預(yù)測值與實際情況擬合度較好。在本試驗中，接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間3個因素對SDF含量的影響程度大小順序為接種量＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析3個因素之間的交互作用對SDF含量的影響如圖4、圖5、圖6所示。

圖4 接種量和培養(yǎng)溫度交互作用對SDF含量的影響Fig.4 Effect of the interaction between inoculum amount and fermentation temperature on the content of soluble dietary fiber

圖5 接種量和培養(yǎng)時間交互作用對SDF含量的影響Fig.5 Effect of the interaction between inoculum amount and fermentation time on the content of soluble dietary fiber

圖6 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間交互作用對SDF含量的影響Fig.6 Effect of interaction between fermentation temperature and fermentation time on the content of soluble dietary fiber

由圖4、圖5、圖6可知，SDF含量隨著各因素水平的增大呈先增加后減小的趨勢，各因素間交互作用明顯，且在圖4和圖5可以看出因素A（接種量）的3D圖坡度最陡，說明接種量對SDF含量的影響最大，圖4中等高線圖的橢圓明顯，說明發(fā)酵過程中接種量和培養(yǎng)溫度兩個因素的交互作用顯著。

經(jīng)Design-Expert 12軟件分析，響應(yīng)面優(yōu)化模型預(yù)測的最佳培養(yǎng)發(fā)酵條件為接種量8.205%、培養(yǎng)溫度25.395℃、培養(yǎng)時間7.132 d，計算SDF理論最大含量為8.245 g/100 g，為方便進行試驗，調(diào)整發(fā)酵條件為接種量8%、培養(yǎng)溫度25℃、培養(yǎng)時間7 d，在此條件下，進行3次平行試驗驗證，實測玉米皮SDF含量為（8.39±0.14）g/100 g，與預(yù)測值誤差較小，說明該模型對玉米皮SDF含量的優(yōu)化擬合效果良好。發(fā)酵前玉米皮中SDF 含量為（0.33±0.03）g/100 g，優(yōu)化后玉米皮 SDF 含量提高了24.42倍。

2.3 亞硝酸鹽吸附能力分析

發(fā)酵前后玉米皮SDF對亞硝酸鹽的吸附能力如圖7所示。

圖7 發(fā)酵前后SDF亞硝酸鹽吸附能力Fig.7 Adsorption capacity of soluble dietary fiber before and after fermentation for nitrite

由圖7可知，pH2條件下發(fā)酵前SDF亞硝酸鈉的吸附量為488.73 μg/g，發(fā)酵后SDF亞硝酸鈉的吸附量為493.99 μg/g，pH7條件下發(fā)酵前SDF亞硝酸鈉吸的吸附量為378.73 μg/g，發(fā)酵后SDF亞硝酸鈉的吸附量為426.58 μg/g，發(fā)酵前后兩種條件下SDF亞硝酸鈉吸附能力均有明顯變化，且pH2即胃內(nèi)環(huán)境中SDF亞硝酸鹽吸附能力要高于pH7即小腸環(huán)境。發(fā)酵后玉米皮SDF亞硝酸鹽的吸附能力有所增強，可能由于發(fā)酵有助于更多的羧基和羥基暴露，增強了玉米皮SDF對亞硝酸鹽的吸附能力。

2.4 膽固醇吸附能力分析

發(fā)酵前后玉米皮SDF對膽固醇的吸附能力如圖8所示。

圖8 發(fā)酵前后SDF膽固醇吸附能力Fig.8 Adsorption capacity of soluble dietary fiber before and after fermentation for cholesterol

由圖8可知，發(fā)酵前后兩種條件下SDF膽固醇吸附能力均有明顯變化，pH2和pH7條件下發(fā)酵后玉米皮SDF膽固醇的吸附量分別為3.61 mg/g和6.92 mg/g，均高于發(fā)酵前的玉米皮SDF膽固醇吸附能力，且pH7條件下膽固醇的吸附能力高于pH2，說明SDF對膽固醇的吸附能力在小腸中效果更好。小腸是膽固醇主要的消化吸收場所，這一結(jié)果與人體的實際消化環(huán)境相符[26]。發(fā)酵改性可以提高玉米皮SDF的膽固醇吸附能力，改性后的玉米皮SDF可以用作食品加工中降低膽固醇的功能性成分。

2.5 膽酸鹽吸附能力分析

膽酸鹽是膽汁酸的次級代謝產(chǎn)物，與一些胃腸道疾病和癌癥有關(guān)，也是腸道吸收膽固醇所必需的乳化劑和載體。膳食纖維可與膽酸鹽結(jié)合，促進膽汁酸鹽的排泄，減少人體對膽酸鹽的接觸和吸收，進一步抑制膽固醇的吸收[27]。發(fā)酵前后玉米皮SDF對膽酸鹽吸附能力如圖9所示。

圖9 發(fā)酵前后SDF膽酸鹽吸附能力Fig.9 Adsorption capacity of soluble dietary fiber before and after fermentation for cholate

由圖9可知，發(fā)酵前后SDF膽酸鹽吸附能力有明顯的差異變化，且發(fā)酵后玉米皮SDF膽酸鹽的吸附量達0.83 mg/g，是發(fā)酵前玉米皮SDF的1.34倍。發(fā)酵增加了SDF與膽酸鹽的親和力，使其具有更好的降血脂潛力。

3 結(jié)論

本研究采用單因素、響應(yīng)面試驗的方法，對猴頭菌固態(tài)發(fā)酵改性玉米皮SDF的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，優(yōu)化調(diào)整后的發(fā)酵條件為接種量8%、培養(yǎng)溫度25℃、培養(yǎng)時間7 d，該條件下實測玉米皮SDF含量為（8.39±0.14）g/100 g。發(fā)酵后玉米皮SDF的亞硝酸鹽吸附能力、膽固醇吸附能力和膽酸鹽吸附能力均有所提高，說明發(fā)酵改性可以提高玉米皮SDF的含量，并可以增強其功能性質(zhì)，使其可以更好地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。