龔永福，陳 芳，張兆萍，張梅秀，蘇毓杰，楊振華，魏廷邦，張英英，高正睿，魏玉杰*

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅武威 733006；2.甘肅省特種藥源植物種質(zhì)創(chuàng)新與安全利用重點實驗室，甘肅武威 733006；3.國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系河西綜合試驗站，甘肅武威 733006)

1902年，德國植物學(xué)家哈伯蘭特首次成功地將多種植物葉肉細胞分離并在人工培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，提出植物細胞全能性理論，即離體植物細胞具有發(fā)育成完整植株的能力，為植物組織培養(yǎng)奠定了基本理論。近年來，組織培養(yǎng)技術(shù)得到快速發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于植物快繁脫毒、植物育種、遺傳工程及珍稀瀕危植物資源離體保存。然而，植物離體組織再生根是一個復(fù)雜的過程，在生根過程中存在著細胞脫分化難、對植物生長調(diào)節(jié)劑敏感性差、次生代謝物質(zhì)抑制生長、污染率高等問題，導(dǎo)致部分植物組培苗生根率低、生根質(zhì)量差或產(chǎn)生畸形苗，阻礙了一些生物技術(shù)在植物的應(yīng)用，如基因編輯借助組織培養(yǎng)技術(shù)進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，但獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株數(shù)量少、苗弱、生根困難、移栽難以成活，從而造成陽性材料的浪費。因此，植物組培苗提高生根率，獲得高質(zhì)量的再生不定根已成為研究的熱點。研究表明，植物組培苗生根受外植體本身基因型、生理生化狀態(tài)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型和生長調(diào)節(jié)劑的影響，還與碳源濃度、光照、光質(zhì)等緊密相關(guān)。該研究從培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基類型、無機鹽濃度、碳源濃度和種類、凝固劑)、植物生長調(diào)節(jié)劑(IAA、IBA、NAA)、培養(yǎng)條件(暗培養(yǎng)時間、光源、光質(zhì)、活性炭)、培養(yǎng)方式(兩步生根法、無糖組織培養(yǎng)生根法、瓶外生根法)進行歸納，分析影響植物組培苗生根的各方面因素，以期為今后實踐提供參考依據(jù)。

1 基本培養(yǎng)基對組培苗生根的影響

培養(yǎng)基分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基包括無機鹽、有機物、凝固劑、水等成分，為植物生長發(fā)育提供所需的各種養(yǎng)分。完全培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗的不同目的，添加植物生長調(diào)節(jié)劑和其他有助于植物生長的物質(zhì)。研究表明，基本培養(yǎng)基類型、無機鹽濃度、碳源種類和濃度、凝固劑均會對組培苗的生根產(chǎn)生影響。

在植物離體培養(yǎng)條件下，只有滿足組織細胞對營養(yǎng)的需求，才能更好地生長發(fā)育?？蒲腥藛T對植物組培苗生根所需的基本培養(yǎng)基做了大量研究。不同植物組培苗誘導(dǎo)生根的基本培養(yǎng)基不同，羅漢果為B5培養(yǎng)基、西洋參為MS培養(yǎng)基、樟葉越橘為WPM培養(yǎng)基、鹿茸草為DCR培養(yǎng)基、杜梨組培苗為NN。同種植物不同基因型的基本培養(yǎng)基不同，西洋梨在MS培養(yǎng)基比QL更易于生根，梨矮化砧木S2、S5分別以1/2QL、1/2MS培養(yǎng)基為最佳?；九囵B(yǎng)基不是一成不變的，為了獲得最佳的生根效果，通常需要根據(jù)植物自身營養(yǎng)需求，調(diào)整基本培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及含量。

無機鹽濃度對植物組培苗生根具有顯著影響。在組培苗誘導(dǎo)生根時，通常需要降低基本培養(yǎng)基中無機鹽濃度。韓如春等研究表明，1/2MS培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更有利于植物組培苗生根。喻娜對1/4MS、1/2MS、MS、2MS培養(yǎng)基進行旱半夏組培苗生根研究時發(fā)現(xiàn)，1/2MS培養(yǎng)基生根率高、根粗壯、質(zhì)量好，1/4MS培養(yǎng)基生雖然不定根數(shù)多，但根較細、出根時間慢，2MS培養(yǎng)基不定根數(shù)量少、根短粗，影響移栽后成活率。張琳娜等在不同無機鹽含量的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)彌勒苣苔組培苗生根，發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基生根率極顯著或顯著高于MS、1/4MS和1/10MS，且組培苗生長狀況最佳，根系發(fā)達。智邵川等、張春梅等、呂德任等分別在構(gòu)樹、非洲菊、花葉艷山姜組培苗生根的研究中發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基為生根最適培養(yǎng)基。通過大量研究表明，低濃度的無機鹽能促進植物組培苗生根，但濃度過低又會導(dǎo)致不定根比較細；高濃度的無機鹽則不利于生根且不定根質(zhì)量差；對于大多數(shù)植物而言，組培苗生根最適培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。

植物組織細胞需要碳水化合物提高能量才能正常生長，在培養(yǎng)基中添加的碳源是糖類，常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖等。糖類為組培苗提供能源外，還具有維持培養(yǎng)基滲透勢的作用，添加適量的糖是組培苗生根的關(guān)鍵。研究表明，不同植物組培苗生根所需的糖濃度不同，西洋參組培苗生根的最佳蔗糖濃度為30 g/L，花葉艷山姜、沙棗為20 g/L，天目杜鵑為5 g/L。史華平等對彩葉鳳梨組培苗生根研究發(fā)現(xiàn)，生根率隨著蔗糖濃度的升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢。一般情況下，蔗糖濃度過低，不能滿足植物細胞營養(yǎng)、代謝的需要，濃度過高導(dǎo)致細胞滲透壓升高，抑制組培苗生根。呂德任等研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的糖對花葉艷山姜組培苗生根誘導(dǎo)效果不同，含蔗糖的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的根粗、長，明顯優(yōu)于麥芽糖和乳糖的培養(yǎng)基。這是因為蔗糖降解產(chǎn)物為葡萄糖和果糖，極易被植物利用。石麗敏等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的蔗糖有利于生根壯苗和根數(shù)的增加。

凝固劑使組培苗在培養(yǎng)基上固定和生長，本身不提供任何營養(yǎng)成分。不同凝固劑的生根培養(yǎng)基組培苗生根效果不同。油菜組培苗生根采用加瓊脂粉的MS培養(yǎng)基時，地上部分生長健壯，但根細弱、生長慢。郝夢宇等將瓊脂粉換成瓊脂糖和植物凝膠后，生根質(zhì)量顯著改善，其中植物凝膠生根效果最好。還有人在培養(yǎng)基中不加凝固劑，采用液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)組培苗生根。劉曉迪等研究表明，液體培養(yǎng)能有效促進刺槐樹冠上部枝條生根，所得組培苗根長且根毛多。張雪君等對液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基進行比較，黨參組培苗在液體培養(yǎng)基的不定根生物量顯著增加，且組培苗生根培養(yǎng)時間由固體培養(yǎng)基的49 d縮短到24 d，培養(yǎng)周期大大縮短。這是因為液體培養(yǎng)基使外植體與培養(yǎng)基充分接觸，更有利于植物組培苗吸收營養(yǎng)和水分，間接提高了生根效果。以上研究表明，凝固劑對組培苗生根存在一定影響，植物組培苗生根時應(yīng)根據(jù)生根情況選擇合適的凝固劑。

2 植物生長調(diào)節(jié)劑對組培苗生根的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中重要組成部分，與植物組織培養(yǎng)能否成功有直接關(guān)系。根據(jù)組織培養(yǎng)的目的，選擇不同的植物生長調(diào)節(jié)劑和濃度是關(guān)鍵。植物生長調(diào)節(jié)包括生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸等。植物組培苗芽和根的分化主要受生長素和細胞分裂素比例的影響。研究表明，單獨使用生長素如IAA、IBA、NAA也能誘導(dǎo)生根。另外，同種植物不同品種生根對生長素需求不同。在草莓組培苗誘導(dǎo)生根中，隋珠品種在NAA濃度為0.1 mg/L時生根率為100%，生根質(zhì)量最好；而紅顏品種不添加生長素，生根率就能達到100%且生根質(zhì)量好。

生長素IAA(吲哚乙酸)在植物根原基形成過程中起著至關(guān)重要的作用，植物嫩芽產(chǎn)生的IAA通過向下極性運輸?shù)交空T導(dǎo)生根。外源添加IAA，也會對植物生根產(chǎn)生影響。趙東利等研究發(fā)現(xiàn)，大蒜根生長發(fā)育與IAA濃度有密切關(guān)系，生根率、平均根數(shù)隨著IAA濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。但IAA穩(wěn)定性差，極易在培養(yǎng)基中氧化并被快速代謝。IBA(吲哚丁酸)比IAA穩(wěn)定，可以外施IBA刺激植物嫩芽產(chǎn)生IAA，從而促進生根。目前，很多草本、木本植物組培苗采用IBA生根都取得了成功，如西洋參、纈草、青岡、油茶等。IBA和IAA也可以混合使用誘導(dǎo)組培苗生根。張延紅等研究表明，IBA在當(dāng)歸組培苗根狀突起的誘導(dǎo)中起決定性作用，IAA促進根的進一步生長，IBA和IAA混合使用，誘導(dǎo)效果最佳。

NAA(萘乙酸)是人工合成的生長素，對不定芽的生根誘導(dǎo)有顯著影響，通過促進植物組織中儲存的淀粉分解為還原糖，為組培苗提供碳源，從而促進根的形成。組培苗根的生長發(fā)育同樣與NAA濃度密切相關(guān)。在一定范圍內(nèi)，隨著NAA濃度增加，組培苗生根率、平均根數(shù)呈上升趨勢，但超過最佳NAA濃度就會抑制生根。在組培苗生根誘導(dǎo)中，NAA可以單獨使用，也可以和IAA、IBA混合使用。孫大寬等在木棉組培苗生根研究中發(fā)現(xiàn)，單獨使用NAA生根率最高為19.66%，單獨使用IBA為39.15%，生根率均較低，而將NAA和IBA混合使用時生根率到達了95.80%，效果顯著。

3 培養(yǎng)條件對組培苗生根的影響

培養(yǎng)條件對組培苗生根有顯著影響，特別是光在植物組培苗的生長和分化過程中具有主導(dǎo)作用，主要表現(xiàn)在暗培養(yǎng)時間、光源、光質(zhì)等方面。

暗培養(yǎng)通過調(diào)控植物體內(nèi)的激素代謝水平促進組培苗生根。植物離體組織生根先在黑暗條件下誘導(dǎo)然后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)是必要的。在木棉生根研究中，不進行暗培養(yǎng)時組培苗生根率為87.95%，暗培養(yǎng)6 d生根率達97.36%，生根率顯著提高。不同植物組培苗生根誘導(dǎo)的暗培養(yǎng)時間不同，彩葉鳳梨為7 d，樟葉越橘為15 d。但暗培養(yǎng)時間過長，又會造成組培苗無法進行光合作用而黃化。張炎研究發(fā)現(xiàn)，長時間暗培養(yǎng)會促進離體芽伸長，同時造成組培苗不可逆轉(zhuǎn)的玻璃化現(xiàn)象。因此，植物組培苗生根需要合適的暗培養(yǎng)時間。

不同光照條件，如光源、光質(zhì)對組培苗生根有一定影響。羅劍飄等研究表明，不同光源對牛樟組培苗生根率及移栽后的成活率產(chǎn)生顯著影響，但對根長和根數(shù)無影響。LED和CCFL光源比普通熒光燈更利于組培苗生根，LED處理下非洲菊組培苗有機物累積量最高，有利于壯苗。不同植物組培苗生根對光質(zhì)的需求不同，組合光更適用于組培苗的生長。周鵬等在烏飯樹組培苗生根研究中，與對照熒光燈相比，LED單色光處理下，藍光能夠顯著提高烏飯樹的生根率和生根數(shù)，紅光具有抑制作用。而楊艷敏等在藍莓組培苗生根研究中的試驗結(jié)果剛好相反，藍光處理組培苗生根率最低，紅光最高。王政等研究表明，以70%紅光+30%藍光的LED組合，紅葉石楠組培苗根數(shù)、根長、地上干物質(zhì)等指標(biāo)均優(yōu)于其他處理，有助于組培苗的生長。

植物組培苗生根培養(yǎng)基中常加入活性炭。張春梅等研究表明，活性炭對非洲菊不定芽促進生根具有顯著作用，極大地縮短了生根時間。欒曉龍等在生根培養(yǎng)基中加入活性炭，秋子梨組培苗生根率、根數(shù)和根長均有提高。活性炭促進植物組培苗生根的原因可能是根的生長發(fā)育需要黑暗環(huán)境，活性炭使培養(yǎng)基變黑，恰好為根的生長提供了近似自然環(huán)境的黑暗條件，同時活性炭可以吸附培養(yǎng)基的有毒物質(zhì)，抑制次生代謝物質(zhì)的光氧化作用，為組培苗提供良好的生長環(huán)境，從而促進根的生長。不同植物組培苗生根需加入的活性炭濃度不一樣。鐵皮石斛活性炭最佳誘導(dǎo)生根濃度為0.5 g/L，秋子梨為1.0 g/L，非洲菊為 2.0 g/L。劉健暉等還對粗、細活性炭做了研究，試驗表明2種活性炭均促進了羅漢果組培苗生根，但效果不同，粗活性炭誘導(dǎo)的根更粗，細活性炭誘導(dǎo)的根更長，根盤更大。但也有植物組培苗生根培養(yǎng)基中加入活性炭并沒有促進生根，即使加入微量的活性炭，生根率反而降低了，如沉香、櫻花、毛菍等，可能原因是活性炭也會吸附培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑，降低了生根誘導(dǎo)效果。因此，活性炭具有兩面性，在生根培養(yǎng)基中需要加入適宜濃度的活性炭才能促進組培苗生根。

4 培養(yǎng)方式

植物根的形成分為2個階段，即根原基的誘導(dǎo)和分化，激素在根原基的誘導(dǎo)階段發(fā)揮著決定性作用；根分化階段激素不再是主要因素，濃度過高則會抑制根的生長?！皟刹缴ā被谝陨显磉M行分步生根，即第1步是根誘導(dǎo)階段，在培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在黑暗條件下培養(yǎng)一定時間，組培苗基部產(chǎn)生根原基；第2步是根伸長階段，將經(jīng)過誘導(dǎo)的組培苗轉(zhuǎn)移到不含植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的相同培養(yǎng)基上，在光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)?！皟刹缴ā倍嘤糜谳^難生根的木本材料，如紫荊、石楠、櫻桃等。李艷敏等為解決紫葉加拿大紫荊組培苗生根率低、長勢弱的問題，通過“兩步生根法”，成功地使生根率達到了95.4%，根數(shù)7.71條，根長3.56 cm，效果顯著。同樣，趙亞楠等通過研究“兩步生根法”，篩選出了誘導(dǎo)不定根發(fā)生和促進不定根生長的最佳條件，解決了杜梨組培苗生根難的問題。

無糖組織培養(yǎng)是指在培養(yǎng)基中不添加糖等有機物，采用二氧化碳作為碳源、蛭石代替瓊脂粉進行植物組織培養(yǎng)，其大大降低了原材料成本，且組培苗污染率低，植株生長好等特點，在很多植物組織培養(yǎng)中得到應(yīng)用。對歐梨、核桃組培苗生根進行無糖組織培養(yǎng)與常規(guī)組織培養(yǎng)比較，發(fā)現(xiàn)無糖組織培養(yǎng)植物生根率、移栽成活率更高，且根系發(fā)達，植株健壯，整體效果好。王立等的研究進一步表明無糖組織培養(yǎng)比傳統(tǒng)組織培養(yǎng)有更高的SOD、CAT和POD活性，使組培苗移栽后有較強的逆境脅迫反應(yīng)能力。

瓶外生根有基質(zhì)培、水培、氣培，大多采用基質(zhì)培，即將組培苗以微型插穗的方式扦插在無菌基質(zhì)上進行生根。該方法與馴化相結(jié)合，簡化了組織培養(yǎng)步驟，具有培養(yǎng)時間短、成本低、移栽成活率高等優(yōu)點，可以進行植物大規(guī)模擴繁?；|(zhì)是植物瓶外生根的關(guān)鍵因素，因不同基質(zhì)透氣性和保水性不同，基質(zhì)組合、配比對生根率、根數(shù)、幼苗生長影響較大。任俞新在款冬瓶外生根研究中表明，當(dāng)基質(zhì)以黃綿河沙∶蛭石=2∶1時，組培苗生根率高，生根數(shù)多，幼苗生長健壯，當(dāng)僅為蛭石時，組培苗生根效果較差，不及前者。另外，組培苗瓶外生根還受練苗時間、外部環(huán)境條件的影響。趙春莉等研究認(rèn)為，影響瓶外生根率高低的因素為：扦插基質(zhì)>練苗時間>空氣濕度。

5 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展，在花卉、中藥材、樹木等取得了一定成果，一些植物已建立了組織培養(yǎng)體系。但不同植物組培苗不定根再生難易程度存在差異，遺傳轉(zhuǎn)化植株不定根再生成為現(xiàn)代生物技術(shù)能否成功應(yīng)用于植物的限制因素之一。提高植物組培苗生根率和生根質(zhì)量，應(yīng)從基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式著手。就生根培養(yǎng)基而言，不同植物組培苗生根所需的基本培養(yǎng)基不同，同種植物不同基因型生根培養(yǎng)基也不同，低濃度的無機鹽能促進組培苗不定根再生，1/2MS培養(yǎng)基能滿足絕大多數(shù)植物組培苗生根，碳源濃度和種類、凝固劑也會對組培苗生根產(chǎn)生影響，在選擇生根培養(yǎng)基時應(yīng)充分考慮以上因素的影響；植物生長調(diào)節(jié)劑對組培苗生根具有決定性作用，濃度過高、過低都不利于生根，篩選適宜濃度的外源激素是生根的關(guān)鍵；通常誘導(dǎo)植物組培苗生根的外源激素為IAA、IBA、NAA，但IAA穩(wěn)定性差，常用IBA代替IAA使用，IBA和NAA混合使用生根效果更佳。另外，同種植物不同品種、無性系對植物生長調(diào)節(jié)劑濃度變化的敏感度存在差異，在越南奇楠沉香組培苗生根研究中，不同無性系對NAA濃度變化敏感度差異較大，說明基因型在生根誘導(dǎo)中的影響不可忽視。光對植物形態(tài)建成有調(diào)控作用，在根原基誘導(dǎo)階段適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)是必要的，LED光源生根質(zhì)量優(yōu)于普通熒光燈，紅、藍組合光有助于植物生長；大部分生根培養(yǎng)基加入適宜濃度的活性炭，組培苗生根效果更好，且生根時間大大縮短。各因素對植物生根的影響程度也不同，羅漢果組培苗生根各因素影響程度從大到小依次為：培養(yǎng)基、活性炭、NAA、蔗糖。兩步生根法根據(jù)組培苗生根不同階段對光、植物生長調(diào)節(jié)劑的需求細化了組織培養(yǎng)步驟，為組培苗生根提供了更加適宜的生長環(huán)境；無糖組織培養(yǎng)生根法是一種新型的組織培養(yǎng)方式，根據(jù)植物生長情況，通過人工控制動態(tài)調(diào)整CO濃度、溫度、光照等進行植物生長環(huán)境的優(yōu)化，使其處于最佳狀態(tài)，大幅度減少了污染率，并提高了組培苗生根率、植株質(zhì)量和移栽生活率，以上2種生根方式是對常規(guī)組培方法的改進，克服了常規(guī)組織培養(yǎng)的缺陷，很好地解決了遺傳轉(zhuǎn)化植株因生根問題造成的材料浪費，促進了生物技術(shù)的應(yīng)用。無糖組織培養(yǎng)技術(shù)出現(xiàn)較晚，在國內(nèi)并沒有廣泛應(yīng)用，隨著技術(shù)不斷發(fā)展和設(shè)備的完善，今后將會成為一種重要的組培手段。瓶外生根法將組培苗生根和馴化相結(jié)合，進一步簡化了植物組織培養(yǎng)流程，節(jié)省了成本和時間，并提高了組培苗移栽成活率，可以進行花卉、中藥材等植物的大規(guī)模擴繁，從而滿足市場的需求。