芪貞提取物對CTX誘導(dǎo)小鼠免疫低下的修復(fù)作用研究

盧迪，王曉宇，齊六衛(wèi)，趙寶凱，王大成，閆琰?

（1.沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽 110027；2.北京大偉嘉生物技術(shù)有限公司，北京 100085；3.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗外邪侵入的重要屏障，免疫系統(tǒng)的調(diào)控水平?jīng)Q定了機(jī)體的健康程度。如果免疫器官萎縮、免疫細(xì)胞分泌水平低下、免疫反應(yīng)遲緩，則機(jī)體長期處于亞健康狀態(tài)，為外邪侵入提供了可乘之機(jī)。御其外必先安其內(nèi)，從根本上提升機(jī)體的免疫水平，是防控疾病的關(guān)鍵，臨床實(shí)踐證實(shí)中藥調(diào)控免疫系統(tǒng)效果較好［1－3］。

芪貞提取物（QE）由黃芪、淫羊藿、女貞子組成，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善免疫抑制狀況、促進(jìn)抗體形成等功能。黃芪具有提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、提高機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答能力，并能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，對不同原因引起的免疫功能降低具有明顯改善作用［4－5］；淫羊藿具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫［6－8］；女貞子多糖能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖［9－10］。本試驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺人工誘導(dǎo)小鼠免疫低下的方法，利用碳粒廓清試驗(yàn)、半數(shù)溶血素試驗(yàn)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)，驗(yàn)證芪貞提取物對小鼠的免疫修復(fù)作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥品及試劑

芪貞提取物（沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司，批號：20011101）；印度墨汁（德制Chroma牌，80 mg碳粒/mL）；綿羊紅細(xì)胞（北京博爾西科科技股份有限公司，批號：201118）；環(huán)磷酰胺（天津市廣成化藥試劑有限公司，批號：202008126）；2，4－二硝基氟苯（廣東惠令化學(xué)試劑有限公司，批號：201021）；都氏試劑（石家莊華瑞創(chuàng)新生物技術(shù)開發(fā)中心，批號：202008）；無菌生理鹽水和1%碳酸鈉溶液（天津市廣成化藥試劑有限公司）；豚鼠血清（江蘇科晶生物科技有限公司）；IL－2、IL－4、IFN－γ 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20200221）。

1.2 儀器

電子分析天平（天津天馬橫基儀器有限公司）；微量移液器（德國Eppendorf 公司）；TG16A－WS 型臺式高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；UV－9100紫外分光可見光度計(jì)（北京瑞利分析儀器廠）；真空采血管（河北超然醫(yī)療器械有限公司）；RT－600 全自動酶標(biāo)儀（美國Rayto雷杜公司）。

1.3 動物

SPF 級ICR 小鼠150 只，體質(zhì)量（20 ± 1）g，雌雄各半，許可證號：SCXK（遼）2020－0001，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供；標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級環(huán)境，溫度（23±1）℃，濕度（55±5）%。

2 方法

2.1 碳粒廓清試驗(yàn)方法

參考文獻(xiàn)［11］的方法，將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10 只，分別為空白對照組、模型對照組、QE 低劑量組、QE中劑量組和QE高劑量組。除空白對照組外，各組試驗(yàn)小鼠在試驗(yàn)開始后連續(xù)3 d 腹腔注射環(huán)磷酰胺，同時(shí)每天灌喂芪貞提取物（QE），連續(xù)給藥3 d，給藥劑量見表1。于最后一次給藥1 h 后，小鼠尾靜脈注射25%印度墨汁200 μL，在注射后分別于2 min（t1）、15 min（t2）用毛細(xì)管刺入內(nèi)眥（眼眶）靜脈叢取血20 μL，并立即加入2 mL 0.1%碳酸鈉溶液中，等其充分搖勻后，于600 nm 波長處測定光密度值（OD）。小鼠頸椎脫臼處死，分別稱取肝臟和脾臟質(zhì)量。

表1 碳粒廓清試驗(yàn)給藥劑量

按公式（1）和（2）計(jì)算廓清指數(shù)K、校正廓清指數(shù)（吞噬指數(shù)）α：

2.2 半數(shù)溶血素試驗(yàn)方法

參考文獻(xiàn)［12］的方法，將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10 只，分別為空白對照組、模型對照組、QE 低劑量組、QE 中劑量組和QE 高劑量組，連續(xù)給藥7 d，給藥劑量見表2。除空白對照組外，其余組在給藥期間每日腹腔注射100 mg/kg 的環(huán)磷酰胺。所有組別在給藥第1 天開始對小鼠腹腔注射4%綿羊紅細(xì)胞（SRBC）混懸液0.2 mL 致敏，連續(xù)7 d。于小鼠最后一次致敏1 h后，摘除眼球取血，按常規(guī)方法制備血清。用生理鹽水將血清稀釋200 倍，取稀釋血清1 mL，4%綿羊紅細(xì)胞0.5 mL，10%豚鼠血清（補(bǔ)體）1 mL 于試管中混勻，空白對照用等體積生理鹽水代替小鼠血清，置于37 ℃孵育30 min。取出后冰浴終止反應(yīng)，冷卻后6 000 r/min離心8 min。取上清液1 mL 加都氏試劑3 mL 于試管中混勻靜置10 min，于490 nm 波長處測定吸收值。另取0.25 mL 4%綿羊紅細(xì)胞和都氏液3.75 mL 混勻后測定綿羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血時(shí)的吸收值。按公式（3）計(jì)算HC50的數(shù)值。

表2 半數(shù)溶血素試驗(yàn)給藥劑量

2.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)方法

參考文獻(xiàn)［13－14］的方法，將50 只小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為空白對照組、模型對照組、QE低劑量組、QE 中劑量組、QE 高劑量組，連續(xù)給藥7 d，給藥劑量見表2。各組小鼠從給藥第1 d 起（除空白對照組外）腹部去毛，于腹部暴露皮膚處均勻涂抹1%二甲硝基氟苯50 μL，每日1 次，連續(xù)7 d。全部小鼠于最后一次致敏1 h 后，將1%二硝基氟苯10 μL 均勻涂于小鼠右耳背側(cè)進(jìn)行抗原攻擊，24 h后摘除眼球取血，脫頸處死，剪下左右兩耳，用6 mm 打孔器在兩耳相同部位打取耳片稱重，左右耳片重量之差為耳腫脹度。同時(shí)摘取小鼠胸腺、脾臟、精確稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；按公式（4）計(jì)算耳腫脹率。Elisa法測定血清中IL－2、IL－4、IFN－γ的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。使用方差分析兩組之間的差異，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 碳粒廓清法試驗(yàn)結(jié)果

與空白對照組相比，模型對照組廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)（α）顯著降低（P＜0.01）。與模型對照組相比，QE 各給藥組的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均升高，其中QE高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），QE 中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的比較（±s）

表3 各組小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的比較（±s）

注：與模型對照組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01；與空白對照組相比，*P ＜0.01。

組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10廓清指數(shù)0.015 8±0.008 3 0.004 5±0.002 6*0.009 4±0.005 6a 0.014 3±0.003 3b 0.012 3±0.008 5a吞噬指數(shù)5.88±2.08 2.46±0.70*4.13±1.93a 5.70±1.04b 4.39±2.13a

3.2 半數(shù)溶血素試驗(yàn)結(jié)果

與空白對照組相比，模型對照組血清溶血素HC50顯著降低（P＜0.01）。與模型對照組相比，QE 各給藥組的血清溶血素HC50均升高，其中QE 低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），QE 高、中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠血清溶血素HC50的比較（±s）

表4 各組小鼠血清溶血素HC50的比較（±s）

注：與模型對照組相比，bP ＜0.01；與空白對照組相比，*P ＜0.01。

組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10血清溶血素HC50（%）154.71±34.57 80.33±20.77*119.71±48.91a 149.20±25.20b 139.03±26.07b

3.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 各組小鼠臟器指數(shù)和耳腫脹率的比較

模型對照組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)低于空白對照組，耳腫脹率高于空白對照組，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型對照組相比，QE 各給藥組的小鼠脾臟指數(shù)均升高，其中QE 高、中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；QE 各給藥組的小鼠胸腺指數(shù)均升高，其中QE 高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），QE 中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型對照組相比，QE 各給藥組的小鼠耳腫脹率均下降，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表5。

表5 各組小鼠臟器指數(shù)和耳腫脹率的比較（±s）

表5 各組小鼠臟器指數(shù)和耳腫脹率的比較（±s）

注：與模型對照組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01；與空白對照組相比，*P ＜0.01。

組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10脾臟指數(shù)（mg/g）5.11±2.69 1.59±0.55*3.16±1.88a 4.98±0.83b 4.56±1.77b胸腺指數(shù)（mg/g）1.70±0.59 0.44±0.32*1.15±0.82a 1.62±0.76b 1.50±1.15a耳腫脹率（%）5.11±2.34 69.14±22.73*16.04±17.33b 6.55±1.49b 7.14±2.64b

3.3.2 各組小鼠細(xì)胞因子的比較

與空白對照組相比，模型對照組的小鼠細(xì)胞因子均降低（P＜0.01）。與模型對照組相比，QE 各給藥組IL-2 均升高，其中QE 高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），QE 中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型對照組相比，QE 各給藥組的小鼠細(xì)胞因子IL-4 和IFN-γ 均升高，其中QE 高、中劑量組差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），QE 低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠細(xì)胞因子變化的比較（±s）

表6 各組小鼠細(xì)胞因子變化的比較（±s）

注：與模型對照組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01；與空白對照組相比，*P ＜0.01。

組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10 IL－2（pg/mL）84.89±25.31 43.40±14.13*65.20±25.93a 76.03±19.05b 71.25±32.04a IL－4（pg/mL）31.06±14.11 5.75±3.04*15.08±11.21a 29.61±6.76b 24.77±10.83b IFN－γ（pg/mL）69.86±24.99 38.60±8.91*53.40±18.05a 67.10±9.22b 64.84±13.30b

4 討論

很多免疫調(diào)節(jié)藥物具有雙向調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體免疫功能異常的情況下才能發(fā)現(xiàn)對免疫的影響，而在機(jī)體健康狀態(tài)下，這種免疫作用往往無法體現(xiàn)，所以成功建立免疫抑制的動物模型是試驗(yàn)的關(guān)鍵［15－17］。環(huán)磷酰胺是臨床常用一種免疫抑制劑，對體液免疫和細(xì)胞免疫均有抑制作用［18－20］，以環(huán)磷酰胺作為化學(xué)刺激藥物誘導(dǎo)免疫抑制模型被廣泛應(yīng)用于臨床藥物的評價(jià)［21－22］。參考馬玲等對于不同化學(xué)誘導(dǎo)劑誘發(fā)免疫失衡小鼠的研究，試驗(yàn)中以環(huán)磷酰胺作為化學(xué)誘導(dǎo)劑，采用高劑量（100 mg/kg 體重）兩次腹腔注射，成功建立免疫低下小鼠模型，模型組在免疫器官指數(shù)、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、血清中細(xì)胞因子含量方面與對照組均存在明顯差異［23］，為本次試驗(yàn)提供參考。

脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要的作用，也是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。小鼠血清溶血素水平和耳腫脹率是特異性免疫力的重要指標(biāo)。免疫細(xì)胞因子IL－2、IL－4 能夠促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖，參與免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)對B 細(xì)胞抗原提呈能力也起到促進(jìn)作用，促使免疫系統(tǒng)對外源刺激快速產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)；IFN－γ 也叫巨噬細(xì)胞活化因子，是Th1 細(xì)胞的標(biāo)志性的細(xì)胞因子，可提高NK 細(xì)胞、吞噬細(xì)胞活性，是免疫功能評價(jià)的重要指標(biāo)［24－25］。本次試驗(yàn)中，芪貞提取物給藥組能夠提升細(xì)胞因子指數(shù)，具有顯著作用。

本研究以ICR 小鼠（SPF 級）為試驗(yàn)動物，利用碳粒廓清試驗(yàn)、半數(shù)溶血素試驗(yàn)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)，驗(yàn)證QE 對小鼠的免疫修復(fù)作用。本研究表明，芪貞提取物（QE）能提高小鼠廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)、血清溶血素HC50，提高小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，降低耳腫脹率，提高小鼠血清中細(xì)胞因子指數(shù)（IL－2、IL－4、IFNγ），具有免疫修復(fù)作用，其中QE 中劑量組（200 mg/kg）效果最佳。