通過實驗表征、計算機輔助結(jié)構(gòu)解析和原子模擬對切爾西土壤腐植酸進行三維結(jié)構(gòu)模擬

Mamadou S. Diallo，Andre Simpson，Paul Gassman，Jean Loup Faulon，James H. Johnson，William A. Goddard，Patrick G. Hatcher 著袁 飛 鞏冠群* 譯

1 加州理工學院貝克曼研究所139-74 材料和工藝模擬中心 加利福尼亞州帕薩迪納 91125

2 霍華德大學土木工程系 華盛頓特區(qū) 20059

3 多倫多大學斯卡伯勒學院物理科學系 加拿大多倫多 MIC 1A4

4 太平洋西北國家實驗室環(huán)境分子科學實驗室 華盛頓州里奇蘭 99352

5 桑迪亞國家實驗室計算生物學和進化計算部 加利福尼亞州利弗莫爾 94551-0969

6 俄亥俄州立大學化學系 俄亥俄州哥倫布 43210

7 中國礦業(yè)大學化工學院 徐州 221116

腐殖質(zhì)（HS）是地球上最豐富的碳庫。腐植酸（HAs）是本研究的初始焦點，一般操作上定義為在低pH 值（＜2）下不溶于水，在較高pH 值（＞2）下可溶于水的HS 組分。它們對各種生物化學和環(huán)境過程有重大影響。它們充當（i）土壤穩(wěn)定劑，（ii）植物的養(yǎng)分庫和水庫，（iii）有毒金屬離子、放射性核素和有機污染物的吸附劑，（iv）具有催化活性的化學緩沖液。由于HAs 是通過其在水溶液中的溶解度定義的，因此這些物質(zhì)的二維和三維結(jié)構(gòu)模型的開發(fā)一直是環(huán)境化學、土壤化學和有機地球化學中的一個突出問題。傳統(tǒng)的方法通常用于闡明未知化合物的結(jié)構(gòu)。在傳統(tǒng)方法中，結(jié)構(gòu)模型是從一系列分析數(shù)據(jù)中通過反復的試差過程（假設(shè)結(jié)構(gòu)與可用的分析數(shù)據(jù)相匹配）推導出來的。在過去的二十年中，一些研究者使用這種方法為HAs 生成了二維結(jié)構(gòu)模型。Stevenson 提出了一個二維模型，該模型包含了“典型”土壤HAs 的許多關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。Schluten 和Schnitzer 結(jié)合元素分析、13C NMR、熱解質(zhì)譜和氧化降解數(shù)據(jù)來開發(fā)土壤HA 的“最先進的結(jié)構(gòu)概念”。許多研究人員也使用傳統(tǒng)方法為HAs開發(fā)結(jié)構(gòu)構(gòu)建塊。Steelink 將元素分析數(shù)據(jù)與滴定數(shù)據(jù)相結(jié)合，開發(fā)了他的HA 構(gòu)建塊。Jansen和他的合作者們得到了一個結(jié)構(gòu)性的HA 構(gòu)建塊，它“更充分地結(jié)合了實驗數(shù)據(jù)和逆向生物合成分析的結(jié)果”。提出的Temple-Northeastern-Birmingham（TNB）腐植酸構(gòu)建塊是Steelink 的HA“單體”的改進版本。然而，這種傳統(tǒng)的HA模型構(gòu)建方法存在2 個主要問題。首先，在大多數(shù)情況下，這一過程是手動進行的；因此，對于多功能的地球大分子如HAs 來說，這是一個耗時且不太可靠的過程。第二，也是最重要的一點，當從同一組分析數(shù)據(jù)中可以推斷出許多結(jié)構(gòu)模型時，傳統(tǒng)的方法不能提供任何選擇適當異構(gòu)體的方法。因此，用計算化學方法對傳統(tǒng)方法生成的HAs 結(jié)構(gòu)模型的物理化學性質(zhì)進行后續(xù)計算時，難以獲得可靠的結(jié)果。

本文描述了開發(fā)HAs 三維結(jié)構(gòu)模型的綜合型實驗和計算框架（圖1）。它結(jié)合了實驗表征、計算機輔助結(jié)構(gòu)解析（CASE）和原子模擬，生成與HAs 的分析數(shù)據(jù)和熱力學/結(jié)構(gòu)特性相一致的所有三維結(jié)構(gòu)模型或這些模型的代表性樣本。這種方法基于4 個基本前提：（1）不同來源（如土壤、植物、沉積物和河流）的HAs 具有不同的結(jié)構(gòu)特征。不能用單一的結(jié)構(gòu)模型來描述不同來源的HAs。（2）在給定一組可靠的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的情況下，圖1所示的分層方法可用于生成所有三維模型或這些模型的代表性樣本，這些模型與相關(guān)HA 的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)最匹配。（3）通過標準的和經(jīng)過驗證的計算化學方法，將這些模型用于隨后的體熱力學和結(jié)構(gòu)性質(zhì)（例如密度、溶解度參數(shù)、13C NMR 光譜等）的計算。（4）只有產(chǎn)生與實驗數(shù)據(jù)一致的體熱力學和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的模型可以認為是HA 的可靠三維結(jié)構(gòu)模型。

圖1 腐殖質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模的分層方法Fig.1 The hierarchical approach for modeling the 3-D structures of humic substances

1 實驗方法和步驟

以切爾西土壤HA 為模型物質(zhì)，對新方法進行了驗證。HA 樣品是從霍頓淤泥中提取的，霍頓淤泥是一種廣泛存在于美國大湖區(qū)（密歇根州、威斯康星州、明尼蘇達州、伊利諾伊州、印第安納州和俄亥俄州）的沼澤土壤。本研究選擇霍頓淤泥作為HA 源樣本部分原因是其來源數(shù)據(jù)的可用性和對切爾西土壤HA 形成機制的深入研究。霍頓淤泥由占據(jù)洪積平原和冰漬的“封閉洼地”“厚度在51 英寸以上的草本有機沉積物中非常深、排水非常差的土壤”組成。導致其形成的原生植被主要由草、莎草、蘆葦、天花菜類植物和香蒲組成?；纛D淤泥排水不良，其原生植被特征以及有機質(zhì)在沼澤土壤中的平均停留時間相對較長表明，植物和微生物降解產(chǎn)物（如木質(zhì)素降解產(chǎn)物、多酚、糖、氨基酸等）的縮合是切爾西土壤HA 的主要形成途徑。

切爾西土壤HA 是基于國際腐殖質(zhì)學會制定的標準方法提取的。提取的切爾西土壤HA 樣品通過元素分析、漫反射FT-IR 光譜、一維1H 和13C 溶液NMR 光譜、二維溶液NMR（TOCSY 和HMQC）光譜和電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜（ESI QqTOF MS）進行表征。在支持信息的“實驗方法和步驟”一節(jié)中給出了提取和表征方法的詳細說明。

2 計算方法和步驟

2.1 計算機輔助結(jié)構(gòu)解析

利用CASE 軟件的SIGNATURE 生成了與定量/定性分析數(shù)據(jù)相一致的切爾西土壤HA 的所有三維結(jié)構(gòu)模型。SIGNATURE 程序執(zhí)行3 個基本任務。首先，它計算出一個詳盡的、不重疊的分子碎片和相關(guān)碎片間鍵的清單，這些分子碎片和碎片間的鍵與相分子關(guān)HA 的結(jié)構(gòu)輸入數(shù)據(jù)最匹配。在第二個任務中，軟件評估于步驟1 中發(fā)現(xiàn)的分子碎片和碎片間的鍵清單一致的結(jié)構(gòu)模型總數(shù)。最后，SIGNATURE 通過隨機連接步驟1 中發(fā)現(xiàn)的分子碎片和碎片間的鍵，生成相關(guān)HA 的所有三維模型或這些模型在統(tǒng)計學上具有代表性的樣本。這個CASE 程序基于特征描述符。一個原子的特征可以被看作是在分子建模軟件如Cerius2中定義的原子類型字母表上的一串字符。原子特征可以定義為0、1、2 和h 級別。在任何給定的分子群G 中，x 原子的h_特征是以x 為根的樹，它描述了到距離h的鍵合環(huán)境。一個分子基團或一個化學鍵的h_特征可以很容易表示為其h_原子特征的線性組合。對于類似HAs 的復雜的地球大分子，特征描述符提供了一種簡單而可靠的編碼方法：（i）將元素分析數(shù)據(jù)編碼為0 級原子特征，（ii）將1H/13C NMR 光譜定量數(shù)據(jù)編碼為1 級或2 級原子特征，（iii）定性數(shù)據(jù)（例如來自FT-IR 光譜、定性一維/二維NMR 光譜、ESI 質(zhì)譜等的分子碎片和碎片間的鍵）作為1、2 或更高級別的分子特征。一旦這些定性和定量數(shù)據(jù)被編碼成HA 的相關(guān)特征，下面的守恒定律就為在結(jié)構(gòu)解析中使用特征分子描述符提供了概念框架：分子碎片的h_特征之和+碎片間的鍵的h_特征之和=相關(guān)HA 的h_特征之和。

設(shè)hσ(S)和hσε(S)為相關(guān)HA 的實驗導出的輸入h_特征和相關(guān)標準誤差的集合。每個分子碎片（MF）fi（1 ＜i＜I）的數(shù)量xi和每個碎片間的鍵（IB）bj（1 ＜i＜J）的數(shù)量yj可以通過下列方程組來計算：

其中I和J是分子碎片和碎片間的鍵的總數(shù)。由于SIGNATURE 程序的目的是構(gòu)建分子模型，所以xi和yj總是正整數(shù)。由于實驗數(shù)據(jù)有限，方程（1）給出的線性系統(tǒng)通常是不確定的，并且有多個解。然而，為了解析HA 結(jié)構(gòu)，我們尋求最佳的解決方案[方程（2）]，即使分子碎片和碎片間的鍵的特征與相關(guān)的HA 的特征之和之間的差異最小化：

其中σ(S)={0σ(S)，……，hσ(S)，和σε(S)=0σε(S)，……，hσε(S)}是輸入原子/分子特征和相關(guān)的標準誤差的向量，Σ 是所選輸入分子碎片和碎片間的鍵的特征矩陣[ 方程（3）]，而X=（x1，……，xI，y1，……，yJ）是解向量。方程（2）正式描述了一個整數(shù)線性規(guī)劃問題。SIGNATURE使用2 種基本方法來解決此問題：系統(tǒng)枚舉和模擬退火。一旦確定了最佳分子構(gòu)建塊（即MFs 和IBs 的類型和數(shù)量），SIGNATURE 就會通過隨機連接相關(guān)HA 的分子碎片和碎片間的鍵來生成與輸入數(shù)據(jù)一致的所有三維模型。SIGNATURE 用戶還可以施加結(jié)構(gòu)約束，例如生成在指定范圍內(nèi)具有數(shù)均分子量的三維模型。因此，如果有相關(guān)的分析數(shù)據(jù)，SIGNATURE 具有為木質(zhì)素和瀝青質(zhì)等復雜有機地球大分子生成具有代表性的三維模型的固有能力。在支持信息的“計算機輔助結(jié)構(gòu)解析程序”一節(jié)中，對SIGNATURE 軟件背后的數(shù)學理論進行了總結(jié)。

2.2 原子模擬

利用分子力學（即能量最小化）和NPT MD（等溫等壓系綜分子動力學）模擬計算了SIGNATURE生成的切爾西土壤HA 三維結(jié)構(gòu)模型的體熱力學性質(zhì)（摩爾體積、體密度和溶解度參數(shù)）。每個SIGNATURE 生成的結(jié)構(gòu)模型首先進行能量最小化，然后在3000 K下進行3組15 ps的恒容-恒溫（NVT）MD 模擬（最終均方根推力為0.1 Kcal/molA）。隨后，將每個退火模型放置在具有周期性邊界條件的三維單元中，并使用Cerius2無定型結(jié)構(gòu)建立模塊將其填充至1.0 g/cm3的體密度。然后對模型進行能量最小化，以消除填充引起的不良接觸。每個最小化的三維周期模型隨后在T=300 K 下進行25 ps 的NPT MD 模擬，直到其體密度保持恒定。大多數(shù)情況下，進行能量最小化只需要2 個周期的MD 模擬，所有MD 模擬和能量最小化過程都采用了能量優(yōu)化力場（具有范德華相互作用的6 勢Lennard-Jones勢）。用電荷平衡（Qeq）程序計算所有的部分原子電荷。利用Ewald 求和計算了所有周期系統(tǒng)的長程靜電和范德華相互作用。相反，對于非周期系統(tǒng)，這些相互作用直接以截止半徑為30 ? 進行處理。在所有的NPT MD 模擬中采用了Berendsen 熱耦合方法（時間常數(shù)為0.1 ps）和Andersen 壓力控制方法（單元質(zhì)量前因子為0.04）。在完成MD 模擬和能量最小化運行后，計算了每個模型的單元體積（VP）、縮合相應變能（EP）和氣相應變能（Enp），并將每個切爾西HA 三維模型的摩爾體積（Vm）、體密度（ρ）和內(nèi)聚能（Ec）分別表示為：

其 中，Na是 阿 伏 加 德 羅 常 數(shù)，Mn是 由SIGNATURE 生成的切爾西HA 模型的摩爾質(zhì)量。根據(jù)Barton 的研究，Hildebrand 溶解度參數(shù)（δ）表示為：

方程（4）～方程（7）可用于在生成具有代表性的三維結(jié)構(gòu)模型樣本后，通過MD 模擬計算HAs 的體密度、內(nèi)聚能和Hildebrand 溶解度參數(shù)。

2.3 一維13C NMR 模擬

利用Chem Draw Pro 的NMR 模塊計算了所選切爾西土壤HA 三維模型的化學位移值，并將其輸入Bruker Analystik 發(fā)布的商業(yè)NMR 模擬軟件包“NMRSIM”中。用弛豫參數(shù)為40 ms 的T1/T2 計算了所選切爾西土壤HA 三維模型等摩爾混合物的13C NMR 光譜，該弛豫參數(shù)是針對切爾西土壤HA 樣品進行實驗測量的。將所測得的FID13C NMR 光譜在“XWIN NMR”中使用指數(shù)乘法處理，并先進行100 Hz 譜線加寬，然后再進行傅立葉變換。

3 結(jié)果

3.1 漫反射傅里葉變換紅外光譜

切爾西土壤HA 的C（51.31%）、H（4.00%）、O（39.67%）、N（4.12%）和S（0.93%）有機歸一化權(quán)重分數(shù)以及O/C 原子比（0.58）是典型的土壤腐植酸特征。它的漫反射FT-IR 光譜（圖2）顯示了許多土壤的光譜中發(fā)現(xiàn)的典型寬峰和肩峰。在3800 到2200 cm-1之間的區(qū)域顯示出非常寬的峰，有4 個不同的頻率范圍。3500 cm-1以上的高頻振動屬于非鍵合的OH 伸縮，其中大多數(shù)在3400 ～3000 cm-1區(qū)域出現(xiàn)的低分辨率寬的肩峰是芳香族C-H 伸縮，3000 ～2800 cm-1區(qū)域具有對稱和不對稱的脂肪族CH2和CH3伸縮的高強度峰。相反，2800 ～2400 cm-1區(qū)域的弱峰是COOH 基團的OH伸縮。在1800 ～1300 cm-1區(qū)域，觀察到幾個峰，包括：（i）來自COOH 基團的C=O 伸縮，（ii）芳香族C=C 的伸縮，（iii）CH3基團的CH 變形，和（iv）CH2基團的CH 彎曲。在1270 ～760 cm-1區(qū)域，我們觀察到幾個峰，包括：（i）芳香族C-H 和C-OH 伸縮和（ii）C-H 面外彎曲。它們屬于單羥基、二羥基和三羥基取代芳香烴。在1270 ～760 cm-1區(qū)域也觀察到碳水化合物的特征性脂肪族C-O 和C-OH 伸縮。

圖2 切爾西土壤腐植酸的漫反射FT-IR 光譜Fig.2 Diffuse reflectance FT-IR spectrum for Chelsea soil humic acid

3.2 一維和二維溶液NMR 光譜

切爾西土壤HA 的13C NMR 光譜（圖3a）也顯示了許多土壤HAs 的13C NMR 光譜的典型特征。脂肪族區(qū)域（以峰1 為中心，＞50 ppm）可能來自（i）多肽或氨基酸側(cè)鏈中的碳原子，（ii）直鏈或支鏈烴鏈中的碳原子，或（iii）從吸電子官能團如酯、羧酸、醚或羥基中分離一次或兩次的碳原子。峰2 屬于甲氧基芳香族碳，是木質(zhì)素衍生芳香化合物存在的良好指示劑。這種分布與HMQC 光譜（圖5）的交叉峰1 一致，表明連在該碳上的質(zhì)子與木質(zhì)素和類似來源的HA 中觀察到的芳香族質(zhì)子通過空間相互作用。峰3 屬于氨基酸或多肽的α 碳。TOCSY 光譜（圖6）與切爾西土壤HA 樣品中存在的此類成分或構(gòu)建塊一致。峰4 通常歸因于糖，盡管醚、酯、羥基碳也可能在該區(qū)域產(chǎn)生共振。在己糖中，異構(gòu)糖碳（峰5）與“環(huán)”碳原子的比例為1 ∶5。對于切爾西土壤HA，峰4 與峰5 的比例約為0.03 ∶11；由此表明，以峰4 為中心的大部分寬峰由糖產(chǎn)生。峰6 屬于無氧芳香族碳，而峰7 屬于多酚結(jié)構(gòu)的氧取代芳香族碳。峰9 來自含羰基或羧基的化合物（例如脂肪酸、氨基酸、糖和木質(zhì)素衍生的芳香烴）。

圖3 切爾西土壤腐植酸的一維溶液13C NMR 光譜Fig.3 1-D Solution 13C NMR spectra for Chelsea soil humic acid

圖6 在DMSO-d6 中的切爾西土壤腐植酸TOCSY 光譜的擴展區(qū)域Fig.6 Expanded region of the TOCSY spectrum of Chelsea soil humic acid in DMSO-d6

切爾西HA 的1H NMR 光譜（圖4）非常寬。由于幾乎連續(xù)重疊，單個質(zhì)子信號的整合幾乎是不可能的。但是，可以將圖4 中突出顯示的廣泛區(qū)域整合起來。A 區(qū)主要由脂肪族質(zhì)子組成。切爾西HA 的二維HMQC NMR 光譜（圖5）顯示了幾個與直鏈或支鏈烴上的CH2基團一致的交叉峰。除了來自游離氨基酸的小的可交換信號（圖4 下部的峰11 和12）之外，B 區(qū)主要由非可交換的脂肪族質(zhì)子組成。相反，C 區(qū)顯示來自不可交換的（即CH2-CO-O-R、CH2-O-R、氨基酸、糖等）和來自糖的可交換官能團OH 的各種信號。在相應的圖表中提供了一維和二維NMR 光譜的更詳細的說明?？傮w而言，DRIFT 和NMR 光譜實驗的結(jié)果與植物和微生物降解產(chǎn)物（如木質(zhì)素降解產(chǎn)物、多酚、糖、氨基酸等）的縮合是切爾西土壤HA 的主要形成途徑的假設(shè)是一致的。

圖4 溶解在DMSO-d6 中（上）和溶解在加了100 μLD2O 的DMSO-d6 中（下）濃度為1 mg/mL 的切爾西土壤腐植酸的一維溶液1H NMR 光譜Fig.4 1-D Solution 1H NMR spectra for Chelsea soil humic acid at a concentration of 1 mg/mL,in DMSO-d6 (top) and DMSO-d6 with the addition of 100 μL of D2O (bottom)

圖5 切爾西土壤腐植酸HMQC 光譜（在DMSO-d6 中）具有交叉峰的區(qū)域Fig.5 Region of the HMQC spectrum (in DMSO-d6) of Chelsea soil humic acid with cross-peaks

3.3 電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜

可靠的摩爾質(zhì)量數(shù)據(jù)是開發(fā)HAs 三維結(jié)構(gòu)模型的關(guān)鍵。在20 世紀70 年代早期，Swift 和他的同事對HS 的水溶液進行了超速離心和凝膠滲透色譜（GPC）研究。他們得出腐植酸的平均摩爾質(zhì)量從10000 道爾頓到100000 道爾頓不等。在過去的二十年里，幾乎所有的大分子物理化學標準方法[如：蒸汽壓滲透法（VPO）、高壓尺寸排阻色譜法（HP-SEC）、流場分離法（FFF）等]已被用于測定HS 的數(shù)均摩爾質(zhì)量（Mn）和重均摩爾質(zhì)量（Mw），雖然得出的測量值之間存在一些差異，但人們一致認為黃腐酸（FAs）的摩爾質(zhì)量比HAs 低得多。對在四氫呋喃、HP-SEC 和FFF 中的VPO 研究表明，F(xiàn)As 的Mn值在600 ～1500 道爾頓之間。類似地，F(xiàn)FF 研究已經(jīng)證實，從水生、土壤、泥炭和煤炭樣品中分離出的HAs 的Mn值在800 到2500 道爾頓之間。近年來，利用ESI 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（ESI FT-ICR MS）、ESI QqTOF 質(zhì)譜和ESI 多級串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MSn）等更先進的分析手段對HS 進行了表征，所得出的質(zhì)譜顯示了1000 ～2000 道爾頓的一個廣泛峰分布。然而，大多數(shù)最強烈的峰出現(xiàn)在1000 道爾頓的m/z比以下，因此表明被測試的HAs 分子量不大。

切爾西土壤HA 的ESI QqTOF 質(zhì)譜如圖7 所示。這與Kujawinski 等最近得出的雷尼爾山土壤HA 的ESI QqTOF 質(zhì)譜相似。該樣品代表了加拿大和美國太平洋西北地區(qū)森林土壤中降解的木材HAs。切爾西土壤HA（見支持信息的“實驗方法和步驟”一節(jié)）和雷尼爾山土壤HA 的ESI QqTOF 質(zhì)譜在相同的實驗條件，使用俄亥俄州立大學校園化學儀器設(shè)施的微質(zhì)量Q-TOF II 質(zhì)譜儀獲得。通過超高分辨率ESI FT-ICR MS 進行表征，Kujawinski 等證實了雷尼爾山土壤HA 樣品中存在木質(zhì)素降解產(chǎn)物。ESI QqTOF 和FT-ICR 質(zhì)譜也證實了在雷尼爾山土壤HA 樣品中存在大量相對低分子量化合物。切爾西土壤HA（圖7）的ESI QqTOF 約為1200 道爾頓，從而表明較高分子量的化合物也不是切爾西土壤HA 的重要成分或組成部分。

圖7 切爾西土壤腐植酸的電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜（ESI QqTOF）Fig.7 Electrospray ionization quadrupole time-of-flight (ESI QqTOF) mass spectrum for Chelsea soil humic acid

3.4 計算機輔助結(jié)構(gòu)解析和模型生成

SIGNATURE 生成切爾西土壤HA 三維分子模型分兩步：

（i）確定分子構(gòu)建塊和碎片間鍵的最佳集合；

（ii）生成的所有三維結(jié)構(gòu)模型與此構(gòu)建塊和碎片間鍵的集合一致。

第一步是運行SIGNATURE 程序的“解析”模式。在該模式下，程序求解方程（2），用以確定與輸入數(shù)據(jù)最匹配的分子碎片和碎片間鍵的最佳數(shù)量。切爾西土壤HA 輸入的原子/分子特征如表1 所示。它們來自元素分析和定量13C NMR 數(shù)據(jù)（圖3A），假設(shè)標準誤差為20%。

表1 實驗得出的切爾西HAa 的輸入原子特征[hσ(S)exp]Tab.1 Experimentally derived input atomic signatures [hσ(S)exp] for Chelsea soil HAa

表2 給出了用作SIGNATURE 輸入的一組分子碎片（即“前體分子”）和碎片間鍵的集合。與DRIFT 和NMR 光譜數(shù)據(jù)以及切爾西土壤HA 假設(shè)的形成途徑一致，我們選擇了34種木質(zhì)素降解產(chǎn)物、20 種氨基酸、14 種碳水化合物、16 種多酚和19 種脂肪酸作為“前體分子”（表2）。同樣，選擇“前體分子”中的鍵合位點和相應的碎片間的鍵（表2），以確保它們可以通過已知的各種縮合機制（包括生物和非生物氧化偶聯(lián)、糖胺縮合、烷基-芳烴取代等）進行共價連接，以介導有機土壤中HA 的形成。為了確保生成的三維結(jié)構(gòu)模型的摩爾質(zhì)量與切爾西土壤HA 的ESI QqTOF 質(zhì)譜一致（圖7），我們將候選模型的C 原子數(shù)約束在40 ～75 之間。

表2 續(xù)

表2 切爾西土壤腐植酸的定性輸入?yún)?shù)：被選中的切爾西土壤腐植酸（HA）的“前體分子”和碎片間鍵的清單aTab.2 Qualitative input parameters for Chelsea soil humic acid: selected list of “precursor molecules” and interfragment bonds for Chelsea soil humic acid (HA)a

使用模擬退火搜索進行10 個循環(huán)（Tinitial=100K，Tfinal=1000 K 和Tincrement=100 K）來求解方程（2）。切爾西土壤HA 的最佳分子碎片（表3）包括2 種木質(zhì)素衍生的芳烴（對香豆酸和對茴香酸）、2 種多酚（2，3，6-三羧基苯酚和間苯二酚）、1 個氨基酸（甲硫氨酸）和1 個碳水化合物（半乳糖醛酸）。它的最佳碎片間的鍵包括3 個芳香族Caro-O 鍵、1 個芳香族Caro-N 鍵和1 個脂肪族Cali-O 鍵。這些分子碎片和碎片間的鍵的組合產(chǎn)生了18 個切爾西土壤HA 的三維結(jié)構(gòu)模型。每個模型的分子式為C45H43O24N1S1，摩爾平均分子量為1016 道爾頓。該值在切爾西土壤HA 的ESI QqTOF 質(zhì)譜的質(zhì)量范圍內(nèi)（圖7）。如表4 所示，切爾西土壤HA 模型的特征誤差（即實驗得出的原子特征和預測的原子特征之間的差異）相對較低。在所有情況下，包括芳香族碳特征（誤差19.30%）在內(nèi)的特征誤差均小于或與輸入數(shù)據(jù)中假定的標準誤差（20%）相當（表1）。平均特征誤差為3%。也就是說，SIGNATURE 生成的切爾西土壤HA 模型中每100 個碳原子中大約有3 個原子缺失或過量。

表3 切爾西土壤腐植酸的特征輸出參數(shù)a：與表1 和表2 的結(jié)構(gòu)輸入數(shù)據(jù)最匹配的分子碎片和碎片間鍵的清單Tab.3 Signature output parameters for Chelsea soil humic acida: list of molecular fragments and interfragment bonds that best match the structural input data from tables 1 and 2

表4 切爾西土壤腐植酸的原子特征a：模型預測與實驗得出的輸入數(shù)據(jù)Tab.4 Atomic signatures for Chelsea soil humic acida: model predictions versus experimentally derived input date

3.5 原子模擬和模型選擇

在本研究的第三階段，我們使用SIGNATURE，通過隨機連接表3 中給出的最佳“前體分子”和相應的碎片間的鍵來生成切爾西土壤HA 的所有18 個三維結(jié)構(gòu)模型的模型異構(gòu)體。隨后，使用“計算方法和步驟”一節(jié)中所述的步驟來計算每個模型的應變能、摩爾體積、密度和溶解度參數(shù)。3 個具有高應變能（＞ 1012kcal/mol）的切爾西土壤HA模型異構(gòu)體被去除。具有低體密度（0.74 g/cm3）的第4 個模型也被去除。其余的切爾西土壤HA模型異構(gòu)體的體密度（ρ）和溶解度參數(shù)（δ）如圖8 所示。據(jù)估算，HS 的體密度范圍為1.20 至1.45 g/cm3。Poerschman 和Kopinke 最近整理了來自各種來源的“腐殖質(zhì)有機質(zhì)”（HOM）的溶解度參數(shù)數(shù)據(jù)（圖9）。他們發(fā)現(xiàn)其值范圍“非常狹窄”（即23.0 ～28.0 J1/2/cm3/2）?；谶@些文獻值，切爾西土壤HA 模型異構(gòu)體中只有5 種表現(xiàn)出的體密度和溶解度參數(shù)的大小與文獻中的實驗估算值相當。每個切爾西土壤HA 模型異構(gòu)體的三維結(jié)構(gòu)、體密度和溶解度參數(shù)如圖10 所示。這些模型具有以下特征：（1）它們是結(jié)構(gòu)不同的模型異構(gòu)體，其分子組成與實驗表征數(shù)據(jù)一致。（2）它們是“分子異質(zhì)”化合物，包含了通常存在于從有機土壤中提取的HAs 中的重要構(gòu)建塊（例如，木質(zhì)素衍生的芳香族化合物、糖、氨基酸和多酚）。（3）它們由相對較小的化合物組成（即數(shù)均分子量為1016 道爾頓）。（4）它們具有與有機/無機溶質(zhì)、金屬離子和礦物表面相互作用的多個官能團（例如COOH 和OH 基團）。（5）它們具有通過氫鍵、范德華力等在水溶液中形成高分子量非共價鍵的超分子聚集體所需的結(jié)構(gòu)特征。（6）它們還表現(xiàn)出通過基質(zhì)輔助的共價相互作用（如化學交聯(lián)）在土壤中形成高分子量超分子組裝體所需的結(jié)構(gòu)特征。（7）他們計算的體密度和溶解度參數(shù)與文獻中得到的實驗估算非常吻合。

圖8 選中的SIGNATURE 生成的切爾西腐植酸的三維模型估算的體密度（A）和溶解度參數(shù)（B）Fig.8 Calculated bulk densities (A) and solubility parameters (B) of the SIGNATURE generated 3-D models for Chelsea soil humic acid

圖9 Poerschman 和Kopinke 根據(jù)文獻吸附數(shù)據(jù)估算的“腐殖質(zhì)有機質(zhì)”（HOM）的溶解度參數(shù)Fig.9 Solubility parameters for “humic organic matter” (HOM) estimated by Poerschman and Kopinke from literature sorption data

圖10 選中的SIGNATURE 生成的切爾西腐植酸模型異構(gòu)體的三維結(jié)構(gòu)、體密度（ρ）和溶解度參數(shù)（δ）Fig.10 3-D structures and bulk densities (ρ) and solubility parameters (δ) of the selected SIGNATURE generated model isomers for Chelsea humic acid (HA)

這些模型異構(gòu)體的等摩爾混合物的模擬13C NMR 光譜與測量光譜相比具有優(yōu)勢（圖3B）。

4 討論

HAs 對環(huán)境和生物地球化學過程的影響相當重要。然而，盡管進行了兩個世紀的研究，HAs的三維結(jié)構(gòu)的基本問題仍未解決。這是有關(guān)水溶液、土壤和礦物-水界面中HAs 的分子和超分子結(jié)構(gòu)爭論不斷的主要原因。Swiftand 等認為，HAs由高分子量的大分子組成，這些大分子在水溶液中呈無規(guī)則卷曲構(gòu)象。相反，Piccolo 等認為HAs 是水溶液中小分子的非價鍵結(jié)合聚集體，而Wershaw等則認為HAs 在水溶液中形成“膠束狀”聚集體，在礦物表面形成“膜狀聚集體”。另一方面，MacCarthy 和Rice 認為，HAs 是“復雜的”和“異質(zhì)的”有機化合物的混合物。盡管圖10 所示的切爾西土壤HA 的三維結(jié)構(gòu)模型不符合以下觀點：HAs 是（i）高分子量大分子或（ii）大量有機化合物的復雜混合物。目前，我們還不能對水溶液、土壤和礦物-水界面中HAs 的三維結(jié)構(gòu)的基本問題提供確切的答案。

需要估算的2 個關(guān)鍵問題是SGNATURE 生成的模型對（i）“前體分子”和相關(guān)碎片間鍵的輸入清單以及（ii）碳原子數(shù)的約束條件的靈敏度。如前所述，輸入的切爾西土壤HA“前體分子”和碎片間的鍵（表2）選自定性DRIFT 和一維/二維13C/1H NMR 光譜數(shù)據(jù)的分子碎片庫，以確保它們可以通過已知的共價鍵縮合機制介導有機土壤中HA 的形成。盡管切爾西土壤HA 的“前體分子”清單中包括了微生物降解產(chǎn)物，例如多酚和脂肪酸，但對于從其他有機土壤的“更深”有機層中分離出來的HA 來說，這些可能不是重要的構(gòu)建塊，而微生物降解產(chǎn)物例如肽聚糖和角質(zhì)酸可能更普遍。因此，圖10 所示的SIGNATURE 生成的三維結(jié)構(gòu)模型可能僅代表從有機土壤（如霍頓淤泥）表層中分離出的HAs。由于需要生成切爾西土壤HA 的三維結(jié)構(gòu)模型，且摩爾質(zhì)量應在切爾西土壤HA 的ESI QqTOF 質(zhì)譜的m/z范圍內(nèi)（圖7），因此候選模型的碳原子數(shù)約束在40 到75 之間變化。滿足表1 給定的結(jié)構(gòu)輸入數(shù)據(jù)，在指定的特征誤差內(nèi)（表4）這個約束可以很容易地被放寬，以生成不同摩爾質(zhì)量的切爾西土壤HA 三維結(jié)構(gòu)模型的集合。實際上，這是我們方法的關(guān)鍵優(yōu)勢之一，該方法將用于后續(xù)研究中，以探索HAs 的三維結(jié)構(gòu)建模中的“多分散性”問題。

測量不確定性對HAs 體密度應用的影響作為模型選擇標準也需要被評估。從實用以及基本的觀點來看，HAs 可以描述為無定型材料。體密度（ρ）和溶解度參數(shù)（δ）是無定型材料系統(tǒng)最重要的熱力學性質(zhì)。無定型化合物的整體性能主要受其形成在能量上有利的三維緊密排列的分子排列的能力控制。因此，不能得到準確的密度和溶解度參數(shù)的HA 的三維結(jié)構(gòu)模型值得懷疑。盡管Poerschman 和Kopinke 對“腐殖質(zhì)有機質(zhì)”溶解度參數(shù)的文獻匯編具有統(tǒng)計意義（圖9），但沒有發(fā)現(xiàn)測量或估算的HAs 體密度的數(shù)據(jù)集合足以對不確定性進行有意義的統(tǒng)計估算。因此，通過考慮HAs 的“可接受的”體密度較大區(qū)間（即1.20 ～1.45 g/cm3），可以放寬SIGNATURE 生成的切爾西模型異構(gòu)體的密度選擇標準。

我們還需要評估用于模擬SIGNATURE 生成的切爾西土壤HA 模型的等摩爾混合物的13C NMR 光譜的計算程序的可靠性（圖3B）。首先，使用Chem Draw Pro 的NMR 模塊估算相關(guān)的化學位移。我們不太確定將這種方法應用于像SIGNATURE 生成的結(jié)構(gòu)模型這樣更大的“分子”時，其可靠性如何。其次，使用實驗測得的弛豫參數(shù)T1/T2 為40 ms，計算出切爾西土壤模型混合物的13C NMR 光譜。盡管此計算程序似乎合理，但尚未在定義明確的較小化合物的混合物上得到驗證：盡管有這些簡化的假設(shè)，但SIGNATURE生成的切爾西土壤HA 模型的等摩爾混合物的模擬13C NMR（圖3B）光譜與實測光譜相比要好，除了圖3B 中以80 pm 為中心的特征外。在隨后的研究中將探討開發(fā)改進和經(jīng)過驗證的程序，以模擬SIGNATURE 生成的HAs 三維模型的一維和/或二維NMR 光譜。

因為我們的方法基于對相關(guān)HA 的起源的了解以及對它的形成機制的洞察，所以主要通過植物和/或微生物降解產(chǎn)物縮合形成的HAs 似乎是評估該方法適用性和局限性的理想選擇。因此，將其系統(tǒng)地用于來自有機土、軟土、降解木材和泥炭土的大量HA 樣品及其分離碎片，應有助于促進具有代表性的三維結(jié)構(gòu)模型的開發(fā)。這些模型可用于隨后的綜合實驗和計算研究中，以解決相關(guān)HAs分子和超分子結(jié)構(gòu)的一些關(guān)鍵問題：（1）在多大程度上可以將整體HAs 形容為數(shù)量有限的“分子異質(zhì)”的多分散混合物？（2）有機地球大分子例如沒有明確定義頭和尾的HAs 在水溶液中是自組裝成有序的膠束還是形成非共價鍵合的分形聚集體？（3）在多大程度上HAs 可以形成具有與整體土壤HAs 一致的熱力學和結(jié)構(gòu)特性的高分子量共價鍵合的超分子組裝體？

本文所述的完整實驗和計算方法（圖1）還提供了通過MD 模擬估算HAs 的熱力學和理化性質(zhì)所需的生成三維結(jié)構(gòu)模型的方法。Diallo 等最近將該方法與Flory-Huggins 溶液理論相結(jié)合，在不使用任何經(jīng)驗推導的可調(diào)參數(shù)的情況下，獲得了18 種疏水性有機化合物（HOCs）與溶解的切爾西土壤HA 的結(jié)合常數(shù)的良好估算。我們目前正在評估切爾西土壤HA 的三維結(jié)構(gòu)模型（圖10）在一個完整的多尺度建?？蚣埽丛幽M與平均場統(tǒng)計熱力學相結(jié)合）中的應用程度，以預測切爾西土壤HA 上的HOC 吸附，而無需使用任何經(jīng)驗推導的可調(diào)參數(shù)。

5 支持信息

用于提取和表征切爾西土壤HA 的實驗方法和步驟，以及在“計算機輔助結(jié)構(gòu)解析”一節(jié)中SIGNATURE 軟件背后的數(shù)學理論的總結(jié)可通過http://pubs.acs.org 免費下載。

致謝和參考文獻（略）